CN112394124A - 一种血浆中西地那非、n-去甲基西地那非及n1,n4-去二甲基西地那非含量分析方法 - Google Patents

一种血浆中西地那非、n-去甲基西地那非及n1,n4-去二甲基西地那非含量分析方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112394124A
CN112394124A CN202011222462.XA CN202011222462A CN112394124A CN 112394124 A CN112394124 A CN 112394124A CN 202011222462 A CN202011222462 A CN 202011222462A CN 112394124 A CN112394124 A CN 112394124A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sildenafil
desmethylsildenafil
demethylsildenafil
plasma
standard
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011222462.XA
Other languages
English (en)
Inventor
秦飞
胡海容
李翠芬
王健松
孙晶晶
王玮
王干迷
吴嘉荣
黄金莹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Holdings Co ltd Baiyunshan Pharmaceutical General Factory
Original Assignee
Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Holdings Co ltd Baiyunshan Pharmaceutical General Factory
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Holdings Co ltd Baiyunshan Pharmaceutical General Factory filed Critical Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Holdings Co ltd Baiyunshan Pharmaceutical General Factory
Priority to CN202011222462.XA priority Critical patent/CN112394124A/zh
Publication of CN112394124A publication Critical patent/CN112394124A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02Column chromatography
    • G01N30/04Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06Preparation
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02Column chromatography
    • G01N30/88Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种血浆中西地那非、N‑去甲基西地那非及N1,N4‑去二甲基西地那非含量分析方法,包括以下步骤:取经预处理去除蛋白后的待测血浆制备成待测样品,以甲酸盐的水溶液为流动相A相,有机溶剂为流动相B相,进行LC‑MS/MS分析测定,通过内标法对西地那非及N‑去甲基西地那非和N1,N4‑去二甲基西地那非的含量进行定量分析;测定过程中液相色谱条件包括:采用梯度洗脱程序,洗脱过程中B相初始体积占比不小于25%。该方法灵敏度高、专属性强、稳定性高、抗基质效应能力强且线性范围极宽,可用于临床一期生物等效性试验等研究。

Description

一种血浆中西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基 西地那非含量分析方法
技术领域
本发明涉及化学药物测定技术领域,具体涉及一种血浆中西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基西地那非含量分析方法。
背景技术
西地那非是由美国食品药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)于1997年3 月批准的第一批5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase 5,PDE-5)抑制剂,是治疗勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)的处方药。西地那非的化学结构式如下:
Figure BDA0002762551410000011
阴茎勃起功能障碍的主要原因是阴茎海绵体供血不足,可能与缺少一氧化氮(NO)有关。NO可使鸟苷酸环化酶(Guanylyl cyclase receptor,GC)活化,在活化的GC作用下,鸟苷酸(Guanosine triphosphate,GTP)转变成环鸟苷酸(cyclLic guanosinemonophosphate, cGMP);cGMP可被磷酸二脂酶5型(PDE-5)降解为cGMP-5’,后者无生物学效应,而cGMP 则可引起阴茎海绵体平滑肌血管舒张,使阴茎迅速充血而勃起。研究表明,西地那非可通过抑制海绵体内分解cGMP的PDE-5,来增强NO的作用,从而发挥其治疗作用。
N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非是西地那非在人血浆中的活性代谢产物,具有与西地那非相似的药理作用,N-去甲基西地那非结构式如下式所示:
Figure BDA0002762551410000021
N1,N4-去二甲基西地那非结构式如下式所示:
Figure BDA0002762551410000022
由于结构及药理性质等与西地那非具有较大的相似性,其多种检测指标均具有较强的相似性,难以对其进行分别定量。目前,关于西地那非及其相关物质的检测方法的研究主要集中在食品或药品中西地那非及其代谢产物或者有前物质和中间体的含量,且其均无法将西地那非与N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非含量区分开来。沈志武等[1]公开了一种利用高效液相色谱法测定保健食品中他达拉非、西地那非和伐地那非的含量,其利用乙腈- 三乙胺为流动相,二极管阵列检测器,能够实现对西地那非在0.5~100mg·L-1浓度范围内的定量检测,然而该线性范围难以满足临床血药浓度测定的需求。中国发明专利CN103926336A 公开了一种非法添加壮阳类化学成分的液-质多指标快速检测方法,该方法通过液质联用仪 (高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪,High performance liquidchromatography-time of flight mass spectrometer,HPLC-QTOF),以甲醇-乙腈混合溶液及甲酸-甲酸铵溶液为流动相,能够在一定程度上对西地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、红地那非、那红地那非、伐地那非、伪伐地那非、他达拉非和氨基他达拉非的混合物进行定量分析,但其最低检测限仅达0.01ppm级,且未包含与西地那非极其相似的去甲西地那非的检测。中国发明专利CN105353095A公开了一种西地那非及其结构类似物的免疫检测方法,其采用直接竞争化学发光酶联免疫法测定样品中西地那非及其结构类似物的含量,该方法适用于保健食品和保健药品且能够实现在0.024~1.21ng/mL范围内的线性定量,然而,根据该专利说明书第[0095]~[0099]段记载可知,该方法西地那非和去甲西地那非的交叉率达 105.6%,因此,其无法将西地那非和去甲西地那非分别定量,且仅在1ppb左右的一个小区间内实现线性定量,该方法同样难以应用于满足临床血药浓度测定。
综上所述,现有技术中,针对人体服用西地那非后,西地那非及其代谢产物在血浆中的浓度尚未有有效的检测手段,这一局限对我国仿制药的研究和发展及解决我国目前药品短缺局面极为不利。此外,由于血浆样品的处理过程较普通样品更为复杂,活性成分在血浆中的浓度更低,且药物体内代谢过程存在较大的个体差异,体内血药浓度与临床疗效和不良反应密切相关,如头痛、头晕、面色潮红、鼻塞、视觉色彩改变(如有蓝色色晕)和视力模糊等,严重的甚至造成阴茎异常勃起、单眼或双眼突然的视力丧失、突发听力减退或听力丧失。因此,建立一个有效、灵敏、快捷的液相色谱串联质谱法对于检测血药浓度从而调整剂量,减少不良反应,对于西地那非的临床用药指导中具有重大意义。
参考文献:
[1]沈志军,唐宏兵,李群,等.高效液相色谱法测定保健食品中他达拉非、西地那非、伐地那非违禁药物含量[J].期刊论文,2008,44(6):540-542.
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种检测方法,该方法能够同时对血浆中西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非的含量进行定量分析。
根据本发明的第一方面实施例的方法,包括以下步骤:
取经预处理去除蛋白后的待测血浆制备成待测样品,以甲酸盐的水溶液为流动相A相,有机溶剂为流动相B相,进行液相色谱串联质谱联用仪(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析测定,通过内标法对西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4- 去二甲基西地那非的含量进行定量分析;
测定过程中液相色谱条件包括:采用梯度洗脱程序,洗脱过程中B相初始体积占比不小于25%。
根据本发明的一些实施例,所述A相中还含有低级羧酸;优选地,所述低级羧酸的体积分数为0.01~1%;优选为0.05~0.5%;最优选为0.1%。
所述低级羧酸为碳原子数不超过4个碳的羧酸,包括甲酸、乙酸、丙酸等中的至少一种,优选为甲酸。添加甲酸等有机羧酸可使分析物的响应提高,但若有机羧酸浓度过高,则会导致杂质峰对主峰产生干扰。
根据本发明的一些实施例,所述有机溶剂的碳原子数不超过4个碳;优选地,所述低级醇包括乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或正丁醇中的至少一种。
根据本发明的一些实施例,所述甲酸盐包括甲酸钾、甲酸钠或甲酸铵中的至少一种。
根据本发明的一些实施例,所述甲酸盐的水溶液中醋酸盐的浓度小于20mmol/L;优选为小于10mmol/L,最优选为2mmol/L。该浓度可保证分析物西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非的响应,也可使杂质峰不干扰主峰的分析。
根据本发明的一些实施例,所述色谱柱为C18柱或C8柱;优选为C18柱填料粒径为1.7、 3.4或5μm(优选为1.7μm)。C18柱和C8柱的保留行为相似,而C18柱的峰形更优,苯基柱等的保留行为不佳,C18柱的1.7、3.4和5μm粒径效果均较好,优选1.7μm以降低压力。
根据本发明的一些实施例,所述待测血浆的预处理操作为:向待测血浆中加入有机溶剂,使蛋白质沉淀,去除沉淀后取上清液用于制备待测样品。由于西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非极性相对较大,采用液液萃取的方法回收率不高,影响灵敏度与方法的重现性。而固相萃取的方法虽然能满足方法学要求,但是其使用的耗材成本高,并且处理过程十分繁琐。本发明中样本处理方法采用蛋白沉淀的方法,在其他条件的配合下,回收率高达90%、专属性强,与西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非色谱保留基本一致,减小了基质效应对检测结果的影响,既能满足回收率的要求,又可以提高检测效率。
根据本发明的一些实施例,所述有机溶剂与待测血浆的体积比为(3~1):(1~3);优选为(3~2):(1~2);最优选为3:1。
根据本发明一些实施例,所述有机溶剂为乙腈。
根据本发明一些实施例,所述待测样品的制备操作为:向经预处理去除蛋白后的待测血浆中加入流动相A相。
根据本发明的一些实施例,所述LC-MS/MS分析过程中,柱温箱温度为35~45℃,流速为0.1~1mL/min;优选地,所述柱温箱温度为37~42℃,流速为0.2~0.6mL/min;最优选地,所述柱温箱温度为40℃,流速为0.3mL/min。
根据本发明的一些实施例,所述梯度洗脱程序具体如下:
0-0.3minB相的体积占比维持在25%;
0.3-1min B相的体积占比由初始比例变化至95%;
1-2min B相的体积占比维持在95%;
2-2.2min B相的体积占比由95%变化至25%;
2.2-3min B相的体积占比维持在25%。
根据本发明的一些实施例,所述LC-MS/MS分析过程中,质谱条件包括:
离子源:电喷雾离子源(Electrospray ionization,ESI);
离子模式:正离子(Positive);
监测模式:多反应监测(Multi reaction monitor,MRM);
电喷雾电压:5500V;
离子源温度:500℃;
气帘气(Curtain gas,CUR):20psi;
碰撞气:9psi。
根据本发明的一些实施例,所述LC-MS/MS分析过程中,质谱条件还包括:西地那非、 N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非的监测离子对分别为475.3/100.1、483.3/108.1 和449.0/283.0;每次扫描一个离子时所停留的时间(Dwell)均为200ms,去簇电压(declustering potential,DP)均为80V,碰撞能量(Collision energy,CE)均为50eV。
根据本发明的一些实施例,所述内标法使用的内标物为西地那非-d8根据本发明的一些实施例,所述方法还包括标准曲线的绘制步骤,具体如下:
取不同浓度的标准工作液和正常人空白血浆混合制成标准工作血浆,将标准工作血浆按照待测血浆同样的预处理步骤进行处理,得到标曲样品,取标曲样品在同等条件下进行LC-MS/MS分析得到标准溶液中目标物峰面积和内标物峰面积,将以上检测数据通过加权最小二乘法进行线性回归,分别得到西地那非、N-去甲基西地及N1,N4-去二甲基西地那非的标准曲线;
所述标准曲线方程为y=a×x+b,权重因子为1/x2,其中,y为标准目标物峰面积与对应内标物峰面积的比值,x为标准工作液中待测目标物血药浓度与对应内标浓度的比值;
所述标准工作液为含有西地那非标准品、西地那非-d8、N-去甲基西地那非标准品和 N1,N4-去二甲基西地那非标准品。
根据本发明的一些实施例,所述标准曲线绘制过程中内标物测定的质谱条件包括:
西地那非-d8的监测离子对为461.2/283.3,每次扫描一个离子时所停留的时间(Dwell) 均为200ms,去簇电压(DP)均为80V,西地那非-d8的碰撞能量(CE)是50eV。
根据本发明的方法,至少具有如下有益效果:
本发明将内标法与高效液相色谱串联质谱法相结合,提高了定量结果的准确性,减小了系统误差,缩短了分析时间,使检测过程简便快速,利于在临床治疗中对患者体内的西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非血药浓度进行检测,为西地那非的个性化给药、减少毒副反应发生等方面的应用提供实验基础。
本发明方案创造性的提出同时检测血浆中西地那非及其代谢物N-去甲基西地那非和 N1,N4-去二甲基西地那非的浓度,通过甲酸铵的配合巧妙地将洗脱初始浓度设置在25%以上,能够较好地避免血浆中的杂质干扰西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非的分析,同时,采用内标法,使得西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非含量能够同时得到准确的定量;添加甲酸盐,使得杂质响应最低。该方法灵敏度高(最低定量限为1ng/mL)、专属性强、稳定性高、抗基质效应能力强且线性范围极宽,可用于临床一期生物等效性试验等研究,能够为我国仿制药的研究和发展,建立一个有效、灵敏、快捷的液相色谱串联质谱方法检测血药浓度从而调整剂量,减少不良反应,在西地那非的临床用药中具有重大的指导意义。
本领域公知,西地那非在不同个体上的代谢差异巨大,因此,通过本发明方案可以使得医者更好地确定不同个体的给药剂量、间隔时间;从而实现精准医疗。同时,还能对N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非的药理作用和药效研究提供一定的依据,为仿制药的开发提供新的方向,若其具有更好地作用,则可以开发为类似药物,较好地解决相关疾病药品单一的窘境。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1中绘制的西地那非标准曲线图;
图2为本发明实施例1中绘制的N-去甲基西地那非标准曲线图;
图3为本发明实施例中最低定量下限样本处理后西地那非(A)、N-去甲基西地那非(B) 和N1,N4-去二甲基西地那非(C)的色谱峰;
图4为本发明实施例中最低定量下限样本处理后西地那非-d8的色谱峰。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果,以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明实施例一为:一种能够同时对血浆中西地那非及N-去甲基西地那非含量进行定量分析的方法,其具体分析过程如下:
一、实验材料
药品及试剂:西地那非、西地那非-d8、N-去甲基西地那非、N1,N4-去二甲基西地那非(加拿大TLC PharmaChem Inc.);乙腈(色谱纯,Merck);甲醇(色谱纯,Merck);甲酸(色谱纯,Aladdin);异丙醇(色谱纯,永华化学科技(江苏)有限公司);甲酸铵(色谱纯,Aladdin);乙酸乙酯(色谱纯,Merck);叔丁基甲醚(色谱纯,Alfa);超纯水(自制,Millipore)。
二、液质条件
1.液相色谱条件
色谱柱:Waters,ACQUITY UPLC BEH C18,50mm×2.1mm,1.7μm;
流动相:流动相A:100%水含0.1%甲酸和2mM的甲酸铵;流动相B:乙腈;
柱温箱温度:40℃;
流速:0.3mL/min;
流动相初始比例为25%甲醇(B相),具体洗脱程序如表1所示:
表1
Figure BDA0002762551410000081
进样体积3μL;自动进样器洗针液1为:甲醇:乙腈:异丙醇:三氟乙醇:乙酸乙酯:水:甲酸的体积比为30:30:10:10:10:10:1;自动进样器洗针液2为:甲醇:异丙醇:水:甲酸的体积比为 40:40:20:1;自动进样器洗针体积为:500μL;样品盘温度:5℃。进样后清洗进样针:5 次×洗针液1,4次×洗针液2;清洗进样阀:4次×洗针液1,3次×洗针液2;切换阀程序:0-1min,流动相进废液,1-3.1min,流动相进质谱检测器,3.1-5min,流动相进废液。
2.质谱条件
质谱参数:离子源为ESI源,采用正离子模式(Positive)、多反应监测模式(MRM);
CUR:20psi;
CAD:9psi;
IonSpray Voltage:5500V;
TEM:500℃;
GS1:30psi;
GS2:30psi;
Pause between mass:20ms。
其他参数见下表2:
Figure BDA0002762551410000091
表2质谱MRM参数设置
3.方法学验证
3.1准确度和精密度
分别取20ng/mL、60ng/mL、600ng/mL、10000ng/mL和16000ng/mL的西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非质控工作溶液50μL,每个加入由6个不同来源的混合基质950μL涡旋混合配制呈含西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4- 去二甲基西地那非浓度分别为1ng/mL(最低质控浓度,Lower Limit of quantification,LLOQ QC)、3ng/mL(低质控浓度,Lower Limit quantification,LOQ)、30ng/mL(几何质控浓度, Geometricmean quantification,GMQC)、500ng/mL(中质控浓度,Medium quaLity controlconcentration,MQC)、800ng/mL(高质控浓度,High quality control concentration,HQC)的质控样品,取100μL置于96孔板中,每个浓度6个重复,分别加入内标沉淀剂(含内标5ng/mL)300μL,涡旋混匀10min,低温4℃,4000r/min离心10min,取上清液进样检测。根据随行标曲进行计算,计算获得批内与批间准确度和精密度。结果详见表3、表4及表5。
表3西地那非的批内和批间准确度与精密度
Figure BDA0002762551410000092
Figure BDA0002762551410000101
表4 N-去甲基西地那非的批内和批间准确度与精密度
Figure BDA0002762551410000102
Figure BDA0002762551410000111
表5 N1,N4-去二甲基西地那非的批内和批间准确度与精密度
Figure BDA0002762551410000112
Figure BDA0002762551410000121
3.2线性和定量下限
标准曲线样品每次新鲜配制,分别浓度为20、40、200、1000、4000、12000、18000、20000ng/mL的西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非工作溶液(溶剂为纯甲醇)50μL加入空白血浆基质950μL,涡旋混合得浓度为1(最低定量限,LLOQ)、 2、10、50、200、600、900、1000ng/mL的标曲样品。取100μL置于96孔板中,每个浓度2个重复,分别加入内标沉淀剂(含内标5ng/mL)300μL,涡旋混匀10min,低温 4℃,4000r/min离心10min,取上清液进样检测。分别以西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非浓度为横坐标x,西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非与内标的峰面积比值为纵坐标y,用加权最小二乘法(权重为1/x2)进行回归运算,结果如图1和2所示。从图1和2中可以看出,得到的标准曲线方程具有良好的线性,其中,西地那非标准曲线方程为y=0.00689x+0.000302,R2=0.9979;N-去甲基西地那非标准曲线方程为y=0.00894x+0.000148,R2=0.9995,其中权重因子为1/x2;N1,N4-去二甲基西地那非标准曲线方程为y=0.00734x+0.000448,R2=0.9989,其中权重因子为1/x2
3.3专属性
取20ng/mL的西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非工作溶液50μL加入空白血浆基质950μL,涡旋混合得浓度为1ng/mL的最低定量限样品。取100μL 置于96孔板中,每个浓度3个重复,分别加入内标沉淀剂(含内标5ng/mL)300μL,涡旋混匀10min,低温4℃,4000r/min离心10min,取上清液进样检测,得西地那非及 N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非及其内标的典型色谱峰,结果如图3-4所示。从图3-4中可以看出,西地那非、N-去甲基西地那非、N1,N4-去二甲基西地那非和内标西地那非-d8的保留时间依次为1.51min、1.56min、1.56min和1.56min。
3.4基质效应和提取回收率
基质效应:取6个不同来源的空白血浆,取100μL,分别加入300μL的乙腈溶液,涡旋混匀10min,低温4℃,4000r/min离心10min,取上清液180μL;向上清液中加入20μL含西地那非/西地那非-d8、N-去甲基西地那非/西地那非-d8和N1,N4-去二甲基西地那非/西地那非-d8混合溶液(西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非的终浓度为3、500、800ng/mL,内标终浓度为5ng/mL),每个浓度重复6个,将96孔板在多管混合器上振荡样品10min(2000rpm),进样检测;以纯水代替空白血浆,加入 300μL的乙腈溶液,涡旋混匀10min,低温4℃,4000r/min离心10min,取上清液180μL;向上清液中加入20μL含西地那非/西地那非-d8、N-去甲基西地那非/西地那非-d8和N1,N4- 去二甲基西地那非/西地那非-d8混合溶液(西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非的终浓度为3、500、800ng/mL,内标终浓度为5ng/mL),每个浓度重复6 个,将96孔板在多管混合器上振荡样品10min(2000rpm),进样检测;
溶血基质效应:取西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非平行工作溶液50μL置于1.5mL离心管中,加入含有2%溶血血浆950μL,涡旋混匀(西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非的终浓度为3、500、800ng/mL)。分别取100μL置于96孔板中,每个浓度3个重复,分别加入内标沉淀剂(含内标5ng/mL) 300μL,涡旋混匀10min,低温4℃,4000r/min离心10min,取上清液进样检测。其中, 2%溶血血浆的配制:取全血经过一个-80℃冻融循环后,1500g离心10min,取上清 0.1mL溶血的红细胞加到4.90mL的空白基质中,混匀即可;
高脂基质效应:取西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非平行工作溶液50μL置于1.5mL离心管中,加入高脂血浆950μL,涡旋混匀(西地那非及N- 去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非的终浓度为3、500、800ng/mL)。分别取100μL 置于96孔板中,每个浓度3个重复,分别加入内标沉淀剂(含内标5ng/mL)300μL,涡旋混匀10min,低温4℃,4000r/min离心10min,取上清液进样检测。其中,高脂基质的配制:如称取一定量甘油三酯15.0mg溶解在0.1mL的甘油中,再加空白血浆 4.90mL,混匀即可。上述基质效应通过分析物和内标的峰面积比计算得到内标归一化基质效应因子,基质效应结果如下表6所示:
表6西地那非和N-去甲基西地那非的基质效应
Figure BDA0002762551410000141
从表6中可以看出,通过对基质效应的全面考察结果发现各种常见基质效应均无显著差异,由此表明,基质效应对本发明方案的测定结果无影响。
提取回收率:分别取西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非平行工作溶液50μL,加入由6个不同来源的混合基质950μL涡旋混合配制呈含西地那非及 N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非浓度分别为3ng/mL(低质控浓度,Low qualitycontrol,LQC)、500ng/mL(中质控浓度,Medium quality control,MQC)、 800ng/mL(高质控浓度,High quality control,HQC)的质控样品,取100μL置于96孔板中,每个浓度6个重复,分别加入内标沉淀剂(含内标5ng/mL)300μL,涡旋混匀 10min,低温4℃,4000r/min离心10min,取上清液进样检测;取6个不同来源混合的空白血浆100μL置于96孔板中,分别九个重复,加入300μL的乙腈溶液,涡旋混匀 10min,低温4℃,4000r/min离心10min,取上清液180μL;向上清液中加入20μL含西地那非/西地那非-d8、N-去甲基西地那非/西地那非-d8和N1,N4-去二甲基西地那非/西地那非-d8混合溶液(西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非的终浓度为3、 500、800ng/mL,内标终浓度为5ng/mL),每个浓度重复3个,将96孔板在多管混合器上振荡样品10min(2000rpm),进样检测。结果如下表7所示:
表7西地那非、N-去甲基西地那非、N1,N4-去二甲基西地那非及其内标的提取回收率
Figure BDA0002762551410000151
从表7中可以看出,本发明实施例方案对西地那非和N-去甲基西地那非及其内标的提取回收率均在90%以上。
3.5稳定性考察
分别取西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非平行工作溶液50μL,加入由6个不同来源的混合基质950μL涡旋混合配制呈含西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非浓度分别为1ng/mL(LLQC)、3ng/mL(LQC)、 30ng/mL(GMQC)、500ng/mL(MQC)、800ng/mL(HQC)的质控样品。取100μL置于96 孔板中,每个浓度6个重复,分别加入内标沉淀剂(含内标5ng/mL)300μL,涡旋混匀10min,低温4℃,4000r/min离心10min,取上清液进样检测。根据随行标曲获得测得浓度,此浓度作为初始值(T0);其中LQC和HQC质控样品室温光照条件下放置约24h后,同上前处理操作,根据随行标曲获得测得浓度(室温光照稳定性),结果如下表8所示,以及置于-80℃条件下,考察5次冻融循环情况下的稳定性,第5次样品溶解后,同上前处理操作,根据随行标曲获得测得浓度(冻融循环稳定性),结果如下表9所示;五种质控样品在进样器温度条件下放置72h后重新进样分析,结果如下表10所示。
表8室温光照稳定性
Figure BDA0002762551410000152
Figure BDA0002762551410000161
表9冻融循环稳定性
Figure BDA0002762551410000162
表10处理后72小时样品中西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基西地那非稳定性
Figure BDA0002762551410000163
Figure BDA0002762551410000171
从表8~10可以看出,工作溶液及基质在光照与避光条件下均稳定,可不避光进行样品前处理,本发明实施例方案对样品的保存条件要求低。
本发明对照例为:一种血浆中西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非含量的检测方法,其与实施例一的区别在于:待测血浆预处理时,在待测血浆中加入的有机溶剂为甲醇。在其他条件均一致的条件下,测定其提取回收率,结果如下表11所示:
表11使用甲醇处理后西地那非、N-去甲基西地那非、N1,N4-去二甲基西地那非及其内标的提取回收率
Figure BDA0002762551410000172
Figure BDA0002762551410000181
对比表7和表11中的数据可以看出,用甲醇处理血浆后,西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非及其内标的提取回收率会明显低于使用乙腈进行处理。因此,使用乙腈作为沉淀血浆蛋白的试剂可以提高目标化合物的检测灵敏度。
综合上述,本发明实施例采用蛋白沉淀法处理人血浆样本,以西地那非-d8为内标采用超高效液相色谱-质谱联用(Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS)方法检测人血浆中西地那非及N-去甲基西地那非和 N1,N4-去二甲基西地那非的含量。质谱采集方法选用ESI正离子及多反应监测模式(MRM)。该检测方法对西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基西地那非在(1-800)ng/mL范围内均具有良好的线性有关系,其线性范围宽;批内和批间的准确度和精密度均良好,提取回收率、基质效应和稳定性考察均符合要求。采用本发明实施例的检测方法,灵敏度高、专属性强、稳定性高、回收率高达90%以上,既能满足回收率的要求,又可以提高检测效率。此外,该方法的重现性好,分析时间短,能满足西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非在人血浆中浓度的检测要求,可用于西地那非片剂药代动力学研究和生物等效性研究。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换,或直接或间接运用在相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种血浆中西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基西地那非含量分析方法,其特征在于:包括以下步骤:
取经预处理去除蛋白后的待测血浆制备成待测样品,以甲酸盐的水溶液为流动相A相,有机溶剂为流动相B相,进行LC-MS/MS分析测定,通过内标法对西地那非及N-去甲基西地那非和N1,N4-去二甲基西地那非的含量进行定量分析;
测定过程中液相色谱条件包括:采用梯度洗脱程序,洗脱过程中B相初始体积占比不小于25%。
2.根据权利要求1所述的血浆中西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基西地那非含量分析方法,其特征在于:所述A相中还含有低级羧酸;优选地,所述低级羧酸的体积分数为0.01~1%;更优选为0.05~0.5%;最优选为0.1%。
3.根据权利要求1所述的血浆中西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基西地那非含量分析方法,其特征在于:有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或正丁醇中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的血浆中西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基西地那非含量分析方法,其特征在于:所述甲酸盐选自甲酸钾、甲酸钠或甲酸铵中的至少一种;优选地,所述甲酸盐的水溶液中甲酸盐的浓度小于20mmol/L;优选小于10mmol/L;最优选为2mmol/L。
5.根据权利要求1所述的血浆中西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基西地那非含量分析方法,其特征在于:所述色谱柱为C18柱或C8柱;填料粒径为1.7、3.4或5μm。
6.根据权利要求1所述的血浆中西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基西地那非含量分析方法,其特征在于:所述待测血浆的预处理操作为:向待测血浆中加入有机溶剂,使蛋白质沉淀,去除沉淀后取上清液用于制备待测样品;所述有机溶剂优选为乙腈;优选地,所述有机溶剂与待测血浆的体积比为(3~1):(1~3);更优选为(3~2):(1~2);最优选为3:1。
7.根据权利要求1所述的血浆中西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基西地那非含量分析方法,其特征在于:所述LC-MS/MS分析过程中,柱温箱温度为35~45℃,流速为0.1~1mL/min;优选地,所述柱温箱温度为37~42℃,流速为0.2~0.6mL/min;优选地,所述柱温箱温度为40℃,流速为0.3mL/min。
8.根据权利要求1所述的血浆中西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基西地那非含量分析方法,其特征在于:所述梯度洗脱程序具体如下:
0-0.3minB相的体积占比维持在25%;
0.3-1min B相的体积占比由初始比例变化至95%;
1-2min B相的体积占比维持在95%;
2-2.2min B相的体积占比由95%变化至25%;
2.2-3min B相的体积占比维持在25%。
9.根据权利要求1至8任一项所述的血浆中西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基西地那非含量分析方法,其特征在于:所述内标法使用的内标物为西地那非-d8。
10.根据权利要求9所述的血浆中西地那非、N-去甲基西地那非及N1,N4-去二甲基西地那非含量分析方法,其特征在于:所述方法还包括标准曲线的绘制步骤,具体如下:
取不同浓度的标准工作液和正常人空白血浆混合制成标准工作血浆,将标准工作血浆按照待测血浆同样的预处理步骤进行处理,得到标曲样品,取标曲样品在同等条件下进行LC-MS/MS分析得到标准溶液中目标物峰面积和内标物峰面积,将上述结果通过加权最小二乘法进行线性回归,分别得到西地那非、N-去甲基西地及N1,N4-去二甲基西地那非的标准曲线;
所述标准曲线的方程为y=a×x+b,权重因子为1/x2,其中,y为标准目标物峰面积与对应内标物峰面积的比值,x为标准工作液中待测目标物血药浓度与对应内标浓度的比值;
所述标准工作液为含有西地那非标准品、N-去甲基西地那非标准品、N1,N4-去二甲基西地那非和西地那非-d8的溶液。
CN202011222462.XA 2020-11-05 2020-11-05 一种血浆中西地那非、n-去甲基西地那非及n1,n4-去二甲基西地那非含量分析方法 Pending CN112394124A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011222462.XA CN112394124A (zh) 2020-11-05 2020-11-05 一种血浆中西地那非、n-去甲基西地那非及n1,n4-去二甲基西地那非含量分析方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011222462.XA CN112394124A (zh) 2020-11-05 2020-11-05 一种血浆中西地那非、n-去甲基西地那非及n1,n4-去二甲基西地那非含量分析方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112394124A true CN112394124A (zh) 2021-02-23

Family

ID=74598687

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011222462.XA Pending CN112394124A (zh) 2020-11-05 2020-11-05 一种血浆中西地那非、n-去甲基西地那非及n1,n4-去二甲基西地那非含量分析方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112394124A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113155992A (zh) * 2021-03-15 2021-07-23 上海容圣生命科技有限公司 一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物浓度的方法
CN113884607A (zh) * 2021-11-17 2022-01-04 南京西默思博检测技术有限公司 一种检测药物西地那非和n-去甲基西地那非的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008127291A2 (en) * 2006-10-10 2008-10-23 Los Alamos National Security, Llc Advanced drug development and manufacturing
CN101575636A (zh) * 2009-05-14 2009-11-11 北京农学院 一种筛选磷酸二酯酶(pde)抑制剂的方法
CN103926336A (zh) * 2013-12-18 2014-07-16 重庆市食品药品检验所 一种非法添加壮阳类化学成分的液-质多指标快速检测方法
KR101421100B1 (ko) * 2013-10-08 2014-07-22 대한민국 고온 기체상 크로마토그래프 분석법을 이용한 발기유발제의 고감도 신속 검출법
CN105572242A (zh) * 2015-11-11 2016-05-11 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种保健食品中pde-5抑制剂类违禁药的非目标物快速筛查检测方法
CN108593828A (zh) * 2018-02-23 2018-09-28 李水军 血浆制备卡中药物和毒物含量的检测方法
CN111693640A (zh) * 2020-06-15 2020-09-22 劲牌有限公司 一种保健食品中非法添加化合物的筛查方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008127291A2 (en) * 2006-10-10 2008-10-23 Los Alamos National Security, Llc Advanced drug development and manufacturing
CN101575636A (zh) * 2009-05-14 2009-11-11 北京农学院 一种筛选磷酸二酯酶(pde)抑制剂的方法
KR101421100B1 (ko) * 2013-10-08 2014-07-22 대한민국 고온 기체상 크로마토그래프 분석법을 이용한 발기유발제의 고감도 신속 검출법
CN103926336A (zh) * 2013-12-18 2014-07-16 重庆市食品药品检验所 一种非法添加壮阳类化学成分的液-质多指标快速检测方法
CN105572242A (zh) * 2015-11-11 2016-05-11 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种保健食品中pde-5抑制剂类违禁药的非目标物快速筛查检测方法
CN108593828A (zh) * 2018-02-23 2018-09-28 李水军 血浆制备卡中药物和毒物含量的检测方法
CN111693640A (zh) * 2020-06-15 2020-09-22 劲牌有限公司 一种保健食品中非法添加化合物的筛查方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOHN KIM 等: "Simultaneous determination of sildenafil and its active metabolite UK-103,320 in human plasma using liquid chromatography tandem mass spectrometry", 《JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS》 *
刘子雄 等: "超高效液相色谱-串联质谱法测定保健食品中78 种非法添加化学药物", 《现代食品科技》 *
李筱旻 等: "两种西地那非片在健康人体内的生物等效性", 《中国新药与临床杂志》 *
王雨晴 等: "超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱快速筛查中成药保健品中26种非法添加化合物", 《食品与发酵工业》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113155992A (zh) * 2021-03-15 2021-07-23 上海容圣生命科技有限公司 一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物浓度的方法
CN113884607A (zh) * 2021-11-17 2022-01-04 南京西默思博检测技术有限公司 一种检测药物西地那非和n-去甲基西地那非的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Comparative analysis of nucleosides and nucleobases from different sections of Elaphuri Davidiani Cornu and Cervi Cornu by UHPLC–MS/MS
CN111257486B (zh) 检测血液中5种精神药物和主要代谢产物的方法及试剂盒
CN110068644B (zh) 高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法
CN108828077B (zh) 一种同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒及其检测方法与应用
CN112394124A (zh) 一种血浆中西地那非、n-去甲基西地那非及n1,n4-去二甲基西地那非含量分析方法
CN111239303B (zh) 一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法
CN109828043A (zh) 一种人血浆中阿考替胺的定量分析方法
Xie et al. Simultaneous quantification and pharmacokinetic investigation of selexipag and its main metabolite ACT-333679 in rat plasma by UPLC-MS/MS method
CN110068645B (zh) 液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的方法
CN109709227B (zh) 高效液相色谱-串联质谱测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物残留量的方法
CN113325100B (zh) 一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用
CN114544796B (zh) 一种液相质谱联用测定血浆中司替戊醇的方法
CN113030343B (zh) 一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法
CN111413439A (zh) 一种快速亲水相互作用色谱-串联质谱法测定血浆中二甲双胍的方法
CN112485340A (zh) 一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法
Tian et al. Validation and quantification of a UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of quinocetone and its main metabolites (3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid and dedioxoquinenone) in aquatic products
CN117491542B (zh) 一种检测干血片中精神类药物的试剂盒及方法
CN115541778B (zh) 一种测定人血浆中阿普斯特浓度的检测方法
CN115060819B (zh) 基于hplc-ms/ms单峰法同时测定人血浆中sun及su12662的方法
CN109946408B (zh) 测定人血浆中连翘苷及代谢物苷元葡萄糖醛酸结合物、苷元硫酸结合物的检测方法
CN110618221B (zh) 一种水产品中脱氢胆酸的检测方法
CN112730682B (zh) 一种抗病毒药物临床研究血浆样本中奥司他韦及代谢物奥司他韦酸浓度的生物分析方法
CN114563504B (zh) 一种测定血浆中游离醛固酮含量的方法及试剂盒
CN117129597B (zh) 一种hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法
CN118050442A (zh) 用于测定全血中他克莫司浓度的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination