CN101575636A - 一种筛选磷酸二酯酶(pde)抑制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，通过将中药提取物分别与PDE样品反应后，检测该PDE活性，判断抑制PDE活性的选择性作用靶点；再根据中药提取物指纹图谱的变化，判断抑制PDE的有效成分，从而筛选出选择性磷酸二酯酶抑制剂。该方法包括的步骤为：中药提取物样品制备、PDE样品制备、细胞孵育、PDE活性检测、中药提取物样品指纹图谱检测；所述的PDE样品制备包括动物组织PDE样品制备、动物骨骼肌PDE样品制备、动物中性粒细胞PDE样品制备。

Description

一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法

技术领域

本发明属于中药成分筛选领域，具体涉及一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法；该方法通过将中药提取物分别与PDE样品反应后，检测该PDE活性，判断抑制PDE活性的选择性作用靶点；再根据中药提取物指纹图谱的变化，判断抑制PDE的有效成分，从而筛选出选择性磷酸二酯酶抑制剂。

背景技术

磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，简称PDE)是cAMP/PKA和cGMP/PKG信号途径中的关键性组成部分。根据激动剂和抑制剂的特异性、敏感性、酶动力学特性及氨基酸序列等的不同，目前在哺乳动物组织细胞中已经发现并鉴别出11个PDE家族成员，每个成员编码1到4个不同的基因。剪接变体和复杂的启动子编码哺乳动物细胞产生的50多种PDE蛋白。由于其多样性及在细胞和亚细胞的特异性分布，PDE能够选择性调节多种细胞功能。作为重要的环核苷酸信号的调节器，PDE成为治疗各种疾病包括心力衰弱、抑郁症、哮喘、炎症和勃起障碍的药物靶点。根据这一特点，医学上，以选择性PDE同功酶抑制剂为探针，来评价各种PDE同功酶在完整组织环核苷酸含量中的作用，为寻找新药开辟新的方向。已经发现的PDE抑制剂类药物有促智药、抗血栓药、血管扩张药、平喘药、抗变态反应药、抗抑郁药、抗阳痿药(西地那非)等。

中药是世界医药宝库中极为重要的组成部分，是我国人民几千年来与疾病作斗争的智慧结晶，其具有毒副作用小、效果好等特点，众多临床与实验资料显示中药对各种疾病均有良好的治疗作用。在防治SARS的过程中中药所发挥的重要抗炎作用，再次引起世界的瞩目。以往对中药的作用机理不甚清楚，近年随着各相关学科的飞速发展，对中药及其有效成分具体作用机理的研究有了长足进展，在一定程度上揭示了其作用机理及对各系统的影响，为进一步研究与开发利用打下良好基础。

研究表明：中药或其有效成份对PDE活性具有确切的抑制作用：黄芩对PDE有较强的抑制作用，黄芩苷能促进多形核白细胞内cAMP浓度升高，降低Ca2+浓度，抑制白细胞活化；甘草、柴胡、人参皂甙、皂甙元衍生物通过抑制cAMP-PDE的活性，使甘草、柴胡、人参皂甙的抗病毒、抗炎、抗过敏、抗溃疡的作用得到加强。理气药丁香能抑制PDE活性，使肥大细胞膜的稳定性增强从而抑制了组胺的释放，具有抗过敏作用。川芎的有效成份川芎嗪通过对PDE活性的抑制作用，使环核苷酸水平升高，从而参于机体的免疫。车前所含的Plantanm majoside等化合物能够抑制cAMP-PDE，这可能是车前镇咳抗炎活性的主要物质基础。淫羊藿中的淫羊藿苷(icariin)能选择性抑制PDE5，提高阴茎海绵体平滑肌cGMP浓度，可有效治疗男性勃起功能障碍。吴茱萸碱可松弛兔离体海绵体平滑肌，其作用与非选择抑制PDE有关。两面针碱、槲皮素、三氟啦嗪对钙调素依赖型PDE具有明显的抑制作用；安神药远志中的远志皂甙能够抑制神经系统PDE活性。猪苓多糖能降低PDE的活性，提高细胞内cAMP水平，等等。由此可见，从传统中草药中分离提取PDE特异性抑制剂用于临床前景广阔。

此前传统的从中药里筛选PDE抑制剂方法主要是应用水相和/或有机溶剂提取各种中药的总提取物，与PDE反应后，确定高活性PDE抑制中药，然后应用各种仪器设备和试剂将其总提取成分依次分离，再依次与PDE反应，最后筛选出PDE抑制剂。由于中药数量众多，成分复杂，这种从中药中筛选PDE抑制剂的方法成本高，难度大，周期长，工作量大等缺点，严重限制了从中筛选具有特殊药理活性的PDE特异性抑制剂在临床上的应用，而设计一种新型、快速的从中药复杂成分中筛选PDE特异性抑制剂的技术势在必行。

另外，由于PDE蛋白多达50余种，不论是提纯或克隆表达均需长期大量的工作。然而，根据PDE与组织器官或某种细胞的功能的关系，直接从中制备PDE，将之与药物或有关成分反应观察PDE活性变化，并相互比较，就能够观察到该药物或成分是否对该组织或细胞的PDE活性有影响和作用的差异，也就初步获得了特异性的PDE抑制剂。如果药物或物质为复杂成分，则可进一步检测其与PDE反应后指纹图谱的变化，何为有效成分。

发明内容

本发明提供一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，通过将中药提取物分别与PDE样品反应后，检测该PDE活性，判断抑制PDE活性的选择性作用靶点；再根据中药提取物指纹图谱的变化，判断抑制PDE的有效成分，从而筛选出选择性磷酸二酯酶抑制剂。

本发明的目的是通过以下技术方法实现的：

一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，该方法通过将中药提取物分别与PDE样品反应后，检测该PDE活性，判断抑制PDE活性的选择性作用靶点；再根据中药提取物指纹图谱的变化，判断抑制PDE的有效成分，从而筛选出选择性磷酸二酯酶抑制剂。

该方法包括的步骤为：

I.中药提取物的制备：

A.将中药原料药用蒸馏水淋洗后，加入水进行浸泡处理，再进行第一次煎煮，得到第一次煎液，将所述的第一次煎液存入另一容器中；

B.将第一次煎煮后的中药原料药中加入水进行第二次煎煮，得到第二次煎液；将所述的第一次煎液与第二次煎液合并，得到总煎液；

C.将所述的总煎液进行减压浓缩处理，得到浓缩液；所述的减压处理的温度为70℃；

D.向所述的浓缩液中加入95％乙醇，边加边搅拌，得到混合溶液A；将所述的混合液A于4℃的环境中放置48小时，得到冷却后的混合液A；所述的浓缩液与乙醇的重量比为1∶3；

E.将所述的混合溶液A进行第一次离心处理，得到第一次上清液；再将所述的第一次上清液中的乙醇去除，得到无醇上清液；

F.将所述的无醇上清液进行浓缩处理，直至生药浓度为1g/ml，得到生药药液；

G.用pH值为7.4的PBS溶液调节所述的生药药液的pH值为7.4，再用所述的pH值为7.4的PBS溶液将所述的生药药液稀释10倍体积，得到生药稀释液；

H.将所述的生药稀释液中进行第二次离心处理，得到第二次上清液，作为中药提取物样品；于4℃的环境中储存备用；

II.PDE样品制备：

A.动物组织PDE样品制备：

a.用心脏放血快速致死的方法处死试验动物，迅速采集该试验动物的各个组织；

b.分别向所述的动物的各个组织中加入钙镁PBS溶液，所述的各个组织与所述的钙镁PBS溶液的重量比为1∶10；再将所述的各个组织和所述的钙镁PBS溶液混合物冰浴制成各个组织溶浆，置于-80℃超低温冰箱中保存备用，作为动物组织PDE样品；

B.动物骨骼肌PDE样品制备：

a.将试验动物处死后取骨骼肌组织，将所述的骨骼肌组织用Hank’s平衡盐缓冲液清洗；

b.将所述的骨骼肌组织剪碎，进行消化处理，得到骨骼肌组织消化液；该消化处理，再终止消化，得到骨骼肌组织消化终止液；所述的骨骼肌组织消化终止液进行离心处理，弃上清得到沉淀物；

c.向所述的沉淀物中加入含血清培养基，将细胞团块吹散，得到细胞悬液；再将所述的细胞悬液进行过滤处理，得到骨骼肌细胞

d.将所述的骨骼肌细胞进行预培养，再进行细胞计数，再将所述的预培养后的骨骼肌细胞进行培养；

e.进行所述的培养48小时后，将培养基更换为含10％FCS的DMEM培养基继续培养；继续培养96小时后，将培养基更换为含5％胎牛血清的DMEM培养基；

f.将所述的含5％胎牛血清的DMEM培养基培养过的骨骼肌细胞进行清洗处理，得到清洗过的骨骼肌细胞；

g.将所述的清洗过的骨骼肌细胞加入钙镁PBS进行冻融处理，得到细胞裂解液；

h.吸取10μl所述的细胞裂解液作为PDE酶样品，加入浓度为25μmol·L^-1的cAMP中进行反应，再将该反应终止，得到反应液；

i.将所述的反应液进行离心处理，得到上清液，将该上清液用纯水做10倍稀释，得到动物骨骼肌PDE样品；吸取10μl所述的得到动物骨骼肌PDE样品作为检测样品，测定PDE反应活性；

C.动物中性粒细胞PDE样品制备：

a.采集动物的新鲜血液，向该血液中加入肝素，得到全血样品；

b.将葡聚糖溶液混入所述的全血样品中，进行沉降处理，得到上清液；

c.将所述的上清液取出按3∶1比例轻铺在淋巴细胞分离液上，离心处理后可见液体分为4层，保留最底层；

d.将所述的最底层进行纯化处理，得到高纯的中性粒细胞悬液；

e.用钙镁PBS稀释所述的中性粒细胞悬液，得到中性粒细胞稀释液；

f.将所述的中性粒细胞稀释液进行检测，再进行粉碎处理，得到中性粒细胞匀浆，即为所述的中性粒细胞PDE样品；

III.细胞孵育：

用钙镁PBS稀释所述的中性粒细胞悬液，得到中性粒细胞稀释液；所述的中性粒细胞稀释液中，中性粒细胞数目为10⁷-10⁸个/L；在24孔培养板中，加入所述的白芍提取物样品和中性粒细胞稀释液，空白对照组加入所述的白芍提取物样品和PBS，放入5％CO₂培养箱中培养，培养时间为1小时；

将培养结束后的所述的中性粒细胞稀释液进行离心处理，得到上清液；将所述的上清液进行除菌处理，得到细胞孵育样品；

IV.PDE活性检测：

A.配制反应体系：

中药管的反应体系：cAMP用钙镁PBS溶解并稀释至100μmol/L，所述的PDE样品量为10μL，cAMP 80μL，所述的中药样品量为10μL；

空白对照管的反应体系：加入灭活的所述的PDE样品10μL，用PBS补充反应液总量至100μL；

同时设中药对照管，反应体系：所述的各种中药提取物10μL，PBS90μL；

B.酶反应及活性检测：

a.将装有以上所述的各个反应体系的容器进行培养，所述的培养的温度为35℃，时间为30分钟；

b.将容器在沸水浴中加热2分钟终止反应；

c.将该管进行离心处理，得到上清液；

d.从该上清液中取其中的80μL，用超纯水做10倍稀释，过0.22-0.45μm微孔滤膜，得到HPLC样品；

检测结果中，PDE活性以底物水解百分率表示：

PDE活性％＝(空白对照管底物浓度-对照管或中药管底物浓度)/空白对照管底物浓度×100％

所述的中药样品对PDE活性的影响用以下公式表示：

PDE活性变化率％＝(空白对照管PDE活性-中药管PDE活性)/空白对照管PDE活性×100％。

所述的PDE活性变化率大于50％的中药提取物所对应的原料药为该PDE样品来源的组织或细胞的磷酸二酯酶抑制剂；

V.中药提取物指纹图谱检测：

将所述的中药提取物样品分别与所述的PDE样品和细胞孵育样品反应后，如PDE活性显著降低，则进行高效液相色谱(HPLC)指纹图谱检测，确定该中药的PDE活性特异性抑制成分。

本发明的有益效果为：

本发明能够快速、高效地从中药复杂成分中筛选组织或细胞特异性磷酸二酯酶抑制剂，克服了现有的从中药中筛选PDE抑制剂成本高，难度大，周期长，工作量大等不足。

附图说明

图1：白芍提取物样品与动物中性粒细胞PDE样品反应前后指纹图谱变化；

图2：白芍提取物样品与中性粒细胞孵育前后指纹图谱变化。

具体实施方式

实施例1：

不同组织PDE活性的大小，决定着其对环核苷酸的调节能力和不同激动剂与抑制剂作用的发应水平。试验1主要研究了主要脏腑组织cAMP-PDE和cGMP-PDE的活性大小，以及对不同传统归经药物的反应，分析药物归经与PDE的关系。

试验1：

一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，通过将中药提取物分别与PDE样品反应后，检测该PDE活性及中药提取物指纹图谱的变化，判断抑制PDE活性的选择性作用靶点及有效成分，并快速筛选出选择性磷酸二酯酶抑制剂及其成分；该方法包括的步骤为：

I.中药提取物的制备：

A.将中药原料药用蒸馏水淋洗后，加入水进行浸泡处理，再进行第一次煎煮，得到第一次煎液，将所述的第一次煎液存入另一容器中；所述的浸泡处理中，所述的原料药与所述的水的重量比为1∶10-15，浸泡的时间为0.5小时；所述的第一次煎煮中，时间为0.5小时；所述的中药原料药为中药饮片：黄连、白芍、白术、防风、通草，购自北京前门同仁堂药店；

B.将第一次煎煮后的中药原料药中加入水进行第二次煎煮，得到第二次煎液；将所述的第一次煎液与第二次煎液合并，得到总煎液；所述的第二次煎煮中，时间为0.5小时；所述的第一次煎煮后的中药原料药与水的重量比为1∶8；

C.将所述的总煎液进行减压浓缩处理，得到浓缩液；所述的减压处理的温度为70℃；所述的浓缩液和所述的中药原料药的重量比为0.8-1∶1；

D.向所述的浓缩液中加入95％乙醇，边加边搅拌，得到混合溶液A；将所述的混合液A于4℃的环境中放置48小时，得到冷却后的混合液A；所述的浓缩液与乙醇的重量比为1∶3；

E.将所述的混合溶液A进行第一次离心处理，得到第一次上清液；再将所述的第一次上清液中的乙醇去除，得到无醇上清液；所述的第一次离心处理中，转速为3000rpm，时间为20分钟；所述的去除乙醇的方法为旋转蒸发，采用的仪器为旋转蒸发仪，温度为65℃；

F.将所述的无醇上清液进行浓缩处理，直至生药浓度为1g/ml，得到生药药液；

G.用pH值为7.4的PBS溶液调节所述的生药药液的pH值为7.4，再用所述的pH值为7.4的PBS溶液将所述的生药药液稀释10倍体积，得到生药稀释液；

H.将所述的生药稀释液中进行第二次离心处理，得到第二次上清液，作为中药提取物样品，于4℃的环境中储存备用；所述的第二次离心处理中，转速为10000rpm，时间为20分钟；

II.PDE样品制备：

A.动物组织PDE样品制备：

a.用心脏放血快速致死的方法处死试验动物，迅速采集该试验动物的各个组织；该组织为心、肝、脾、肺、肾；所述的试验动物为性成熟雌性中国小香猪，购自中国农业大学昌平实验基地；

b.分别向所述的动物的各个组织中加入钙镁PBS溶液，所述的各个组织与所述的钙镁PBS溶液的重量比为1∶10；再将所述的各个组织和所述的钙镁PBS溶液混合物冰浴制成各个组织溶浆，置于-80℃超低温冰箱中保存备用，作为动物组织PDE样品；

B.动物骨骼肌PDE样品制备：

a.将试验动物处死后取骨骼肌组织，将所述的骨骼肌组织用Hank’s平衡盐缓冲液清洗3次；具体操作为：取1～3天新生ICR小鼠，用75％酒精对所述的小鼠体表进行充分消毒，脱颈处死后所述的小鼠，剥皮取四肢的骨骼肌组织；

b.将所述的骨骼肌组织剪碎，进行消化处理，得到骨骼肌组织消化液；该消化处理采用以0.1％(w∶v)胶原酶II和0.2％(w∶v)胰酶37℃消化30min，再中终止消化，得到骨骼肌组织消化终止液；该终止消化为向所述的骨骼肌组织消化液加入重量相等的含15％胎牛血清(FCS)的DMEM(Dulberco Modified Eagles Medium)培养基；所述的骨骼肌组织消化终止液进行离心处理，弃上清得到沉淀物；所述的离心处理的转速为1000rpm(200×g)，时间为10min；

c.向所述的沉淀物中加入含血清培养基，用5ml移液管将细胞团块吹散，得到细胞悬液；再将所述的细胞悬液进行过滤处理，得到骨骼肌细胞；该过滤处理采用100μm的尼龙网，将骨骼肌细胞过滤至60mm培养皿中；

d.将所述的骨骼肌细胞进行预培养，再进行细胞计数，再将所述的预培养后的骨骼肌细胞进行培养；所述的预培养在含5％CO₂的二氧化碳培养箱中进行，预培养温度为37℃，时间为60分钟；所述的培养中，所述的预培养后的骨骼肌细胞的浓度为2～3.5×10⁵，所述的培养在0.1％(w∶v)明胶的24孔培养板中进行；

e.进行所述的培养48小时后，将培养基更换为含10％胎牛血清的的DMEM培养基继续培养；继续培养96小时后，将培养基更换为含5％胎牛血清的DMEM培养基；

f.将所述的含5％胎牛血清的DMEM培养基培养过的骨骼肌细胞进行清洗处理，得到清洗过的骨骼肌细胞；该清洗处理先吸去培养板中的培养基，再用温度为4℃的钙镁PBS清洗所述的含5％胎牛血清的DMEM培养基培养过的骨骼肌细胞3次；

g.将所述的清洗过的骨骼肌细胞加入钙镁PBS进行冻融处理，得到细胞裂解液；所述的冻融处理中，将所述的24孔板中每孔加入30μl钙镁PBS，置-80℃冰箱反复冻融数次，至骨骼肌细胞裂解；

h.吸取10μl所述的细胞裂解液作为PDE酶样品，加入浓度为25μmol·L^-1的cAMP中进行反应，再将该反应终止，得到反应液；该反应在35℃振荡培养箱中进行，转速为60rpm，时间为30分钟；终止该反应的方法为进行沸水浴3min，使酶灭活；

i.将所述的反应液进行离心处理，得到上清液，将该上清液用纯水做10倍稀释，得到动物骨骼肌PDE样品；吸取10μl所述的得到动物骨骼肌PDE样品作为检测样品，测定PDE反应活性；所述的离心处理中，转速为15000rpm，温度为4℃，时间为20分钟。

C.中性粒细胞磷酸二酯酶样品制备：

a.采集动物的新鲜血液，向该血液中加入肝素，所述的1ml新鲜血液中加入35U肝素；得到全血样品；

b.将葡聚糖溶液混入所述的全血样品中，进行沉降处理，得到上清液；所述的沉降处理为静置40min；所述的葡聚糖溶液的重量百分比为为4.5％，与所述的全血样品的体积比为1∶5；

c.将所述的上清液取出轻铺在淋巴细胞分离液上，离心处理后可见液体分为4层，保留最底层；所述的4层中，最上层为血浆层；第2层为单核细胞和淋巴细胞层；第3层为淋巴细胞分离液层；最底层为中性粒细胞层，夹杂少量红细胞而微带红色；所述的离心处理的时间为15分钟，离心力为500g；

所述的淋巴细胞分离液购自上海恒信化学试剂有限公司；

d.将所述的最底层进行纯化处理，得到高纯的中性粒细胞悬液；该纯化处理的方法为：用蒸馏水将残余的红细胞溶胀后，再经钙镁PBS漂洗；

e.用钙镁PBS稀释所述的中性粒细胞悬液，得到中性粒细胞稀释液；所述的中性粒细胞稀释液中，中性粒细胞数目为10¹¹个/L；

f.将所述的中性粒细胞稀释液进行检测，再进行粉碎处理，得到中性粒细胞匀浆，即为所述的中性粒细胞PDE样品；

所述的检测为：用Wright染色法检测细胞纯度(中性粒细胞呈蓝紫色，多为二到三叶核，近圆形)＞95％，台盼蓝染色法检查活性(活细胞排斥台盼蓝染料)＞95％。所述的粉碎处理中，工具为玻璃匀浆器；在显微镜下确认所述的中性粒细胞匀浆的中细胞被粉碎细小均匀，即为所述的中性粒细胞PDE样品；

III.酶反应及活性检测：

A.配制反应体系：

a.cAMP-PDE活性检测：

中药管的反应体系：cAMP用钙镁PBS溶解并稀释至80μmol/L，所述的PDE样品量为20μL，cAMP 70μL，所述的中药样品量为10μL；

b.cGMP-PDE活性检测：

中药管的反应体系：cGMP用钙镁PBS溶解并稀释至100μmol/L，所述的PDE样品量为10μL，cGMP 80μL，所述的中药样品量为10μL；

c.动物组织活性检测：

中药管的反应体系：cAMP用钙镁PBS溶解并稀释至100μmol/L，所述的PDE样品量为10μL，cAMP 80μL，所述的中药样品量为10μL；

d.空白对照管的反应体系：加入灭活的所述的PDE样品10μL，用PBS补充反应液总量至100μL；

同时设中药对照管：反应体系：所述的各种中药提取物10μL，PBS90μL；

所述的PDE样品分别为按照本实施例II部分中得到的动物组织PDE样品、骨骼肌细胞PDE样品和动物中性粒细胞PDE样品；

所述的cAMP、cGMP均购自SIGMA公司；

以上所述的各个反应体系在Eppendorf管中配制；

B.酶反应及活性检测：

a.将装有以上所述的各个反应体系的EP管进行培养，所述的培养的温度为35℃，时间为30分钟，采用的仪器为震荡式培养箱；

b.将该EP管在沸水浴中加热2分钟终止反应；

c.将该管进行离心处理，得到上清液；所述的离心处理的温度为4℃，转速为15000rpm，时间为30分钟；

d.从该上清液中取其中的80μL，用超纯水做10倍稀释，过0.45μm微孔滤膜，得到HPLC样品；

e.将所述的HPLC样品进行HPLC反应；平行进样两次，每次所述的HPLC样品的用量为10μL；所述的HPLC的色谱条件为：Waters高效液相色谱仪，色谱柱采用Diamonsil C₁₈ 5μm，250×4.6mm，检测波长为254nm，灵敏度为0.05AUFS，柱温为室温，cAMP测定流速为1.0mL/min，cGMP测定流速为0.8mL/min。分析流动相由甲醇和50mmol磷酸缓冲液(pH 6.6)组成，容积比为1∶9；

检测结果中，PDE活性以底物水解百分率表示：

PDE活性％＝(空白对照管底物浓度-中药对照管或中药管底物浓度)/空白对照管底物浓度×100％

所述的中药样品对PDE活性的影响用以下公式表示：

PDE活性变化率％＝(空白对照管PDE活性-中药管PDE活性)/空白对照管PDE活性×100％。

正数表示抑制作用，负数表示促进作用。

C.检测结果

a.中药对动物五脏组织PDE活性的影响：

表1  中药对五脏组织PDE活性的影响(PDE活性变化率％)

由表1可见，因为黄连对心组织cGMP的PDE活性变化率大于50％，所以黄连是心组织cGMP-PDE选择性抑制剂；因为白芍对肺组织cGMP的PDE活性变化率大于50％，所以白芍是肺组织cGMP-PDE选择性抑制剂；

b.中药对骨骼肌cAMP-PDE磷酸二酯酶活性的影响

表2  中药对骨骼肌cAMP-PDE磷酸二酯酶活性的影响(PDE活性变化率％)

由表2可见，在所选中药中，白芍对骨骼肌cAMP-PDE活性抑制作用最强，PDE活性变化率为82.11％，所以白芍是骨骼肌PDE活性抑制剂。

c.中药对中性粒细胞cAMP-PDE磷酸二酯酶活性的影响

表3  中药对中性粒细胞cAMP-PDE磷酸二酯酶活性的影响(PDE活性变化率％)

由表3可见，在所选中药中，白芍对cAMP-PDE活性抑制作用最强，PDE活性变化率为97.42％，所以白芍是中性粒细胞的PDE活性抑制剂。

试验2：

本试验在试验1的基础上，进一步研究白芍提取物对中性粒细胞PDE、中性粒细胞孵育后PDE的活性变化及反应后白芍提取物指纹图谱变化。

一、白芍提取物对中性粒细胞PDE活性的影响及反应后指纹图谱变化：

1.白芍提取物的制备：

A.将中药原料药用蒸馏水淋洗后，加入水进行浸泡处理，再进行第一次煎煮，得到第一次煎液，将所述的第一次煎液存入另一容器中；所述的浸泡处理中，所述的原料药与所述的水的重量比为1∶10-15，浸泡的时间为0.5小时；所述的第一次煎煮中，时间为0.5小时；所述的中药原料药为白芍购自北京前门同仁堂药店；

B.将第一次煎煮后的中药原料药中加入水进行第二次煎煮，得到第二次煎液；将所述的第一次煎液与第二次煎液合并，得到总煎液；所述的第二次煎煮中，时间为0.5小时；所述的第一次煎煮后的中药原料药与水的重量比为1∶10；

C.将所述的总煎液进行减压浓缩处理，得到浓缩液；所述的减压处理的温度为70℃；所述的浓缩液和所述的中药原料药的重量比为1∶1；

D.向所述的浓缩液中加入95％的乙醇，边加边搅拌，得到混合溶液A；将所述的混合液A于4℃的环境中放置24小时，得到冷却后的混合液A；所述的浓缩液与乙醇的重量比为1∶3；

E.将所述的混合溶液A进行第一次过滤处理，得到第一次滤液，调节所述的第一次滤液的pH值为7.5-8.0；

F.将所述的第一次滤液放置12小时，进行第二次过滤处理，得到第二次滤液；将所述的第二次滤液中的乙醇挥发掉，再加入注射用水，得到无醇第二次滤液，所述的无醇第二次滤液中的中药含量为1g/ml；所述的去除乙醇的方法为旋转蒸发，采用的仪器为旋转蒸发仪，温度为65℃；

G.将所述的无醇第二次滤液放置24小时，进行第三次过滤处理，得到第三次滤液；

H.将所述的第三次滤液进行灭菌处理，得到白芍提取物，冷藏备用；该灭菌处理中，温度为115℃，时间为30分钟；所述的白芍提取物中的中药含量为1g/ml；

I.用pH值为7.4的PBS稀释所述的白芍提取物，得到白芍提取物稀释液，并调节pH值为7.4；所述的白芍提取物稀释液与所述的PBS的体积比为1∶10；

J.将所述的白芍提取物稀释液进行离心处理，得到上清液；将所述的上清液进行除菌处理，得到白芍提取物样品；所述的除菌处理采用0.22μm的滤膜；所述的离心处理中，温度为4℃，时间为30分钟，离心力为10000g；

2.中性粒细胞分离及PDE制备：

具体方法参见试验1；

所述的中性粒细胞稀释液中，中性粒细胞数目为10⁸个/L；

所述的检测为：用Wright染色法检测细胞纯度(中性粒细胞呈蓝紫色，多为二到三叶核，近圆形)＞96％，台盼蓝染色法检查活性(活细胞排斥台盼蓝染料)＞98％。所述的粉碎处理中，工具为玻璃匀浆器；在显微镜下确认所述的中性粒细胞匀浆的中细胞被粉碎细小均匀，即为所述的中性粒细胞PDE样品；

3.PDE活性检测：

具体方法参见试验1；

A.配制反应体系

白芍提取物样品管的反应体系：cAMP用钙镁PBS溶解并稀释至50μmol/L，所述的PDE样品量为20μL，cAMP 70μL，所述的白芍提取物样品量为10μL；

空白对照管的反应体系：加入灭活的所述的PDE样品10μL，用PBS补充反应液总量至100μL；

B.酶反应及活性检测

a.将装有以上所述的各个反应体系的EP管进行培养，所述的培养的温度为35℃，时间为30分钟，采用的仪器为震荡式培养箱；

b.将该EP管在沸水浴中加热2分钟终止反应；

c.将该管进行离心处理，得到上清液；所述的离心处理的温度为4℃，转速为15000rpm，时间为30分钟；

d.从该上清液中取其中的80μL，用超纯水做10倍稀释，过0.22μm微孔滤膜，得到HPLC样品；

e.将所述的HPLC样品进行HPLC反应；平行进样两次，每次所述的HPLC样品的用量为10μL；色谱条件参见试验1；

根据检测结果，生药浓度为10mg/ml的白芍提取物的PDE活性变化率为75.55％。

4.反应后白芍提取物指纹图谱变化

色谱条件：Agilent 1100色谱仪，色谱柱Eclipse XDB-C18，5μm，4.6×150mm。流动相由乙腈和水组成(v/v＝12/88)，流速0.8ml/min，柱温25℃；

有图1可知：与对照比较(图1中上面色谱图)，反应后白芍提取物指纹图谱(图1中下面色谱图)中，仅有a峰峰高及峰面积显著降低，其它各主要峰峰高及峰面积均无明显变化。

二.白芍提取物与中性粒细胞孵育后PDE活性变化及反应后白芍提取物指纹图谱变化

1.中性粒细胞准备：

具体方法参见试验1；

所述的中性粒细胞稀释液中，中性粒细胞数目为6.5×10⁷个/L；

所述的检测为：用Wright染色法检测细胞纯度(中性粒细胞呈蓝紫色，多为二到三叶核，近圆形)＞96％，台盼蓝染色法检查活性(活细胞排斥台盼蓝染料)＞98％。

2.细胞孵育：

在24孔培养板中，每孔加入0.1ml的所述的白芍提取物样品和0.9ml的中性粒细胞稀释液，空白对照组加入所述的白芍提取物样品和0.9ml的PBS，放入5％CO₂培养箱中培养，培养时间为1小时；培养结束后检查细胞的形态正常；

将培养结束后的所述的中性粒细胞稀释液进行离心处理，得到上清液；所述的离心处理的温度为4℃，时间为3分钟，离心力为1000g；将所述的上清液进行除菌处理，得到细胞孵育样品；所述的除菌处理采用0.22μm的滤膜；

3.PDE活性检测

具体方法参见试验2中的第一部分；

根据检测结果，反应液浓度为10mg生药/ml的白芍提取物对孵育中性粒细胞的PDE活性变化率为15.25％。

4.与中性粒细胞孵育后白芍提取物指纹图谱变化

色谱条件参见试验2中的第一部分；由图2可见，与对照比较(图2中，上面色谱图)，反应后白芍提取物指纹图谱(图2中，下面色谱图)中，只有a峰峰高及峰面积明显降低，其它各主要峰峰高及峰面积均无显著变化。

本实施例中的采用的试剂Hank’s平衡盐缓冲液、胶原酶II(Sigma)，胰酶、DMEM培养基、胎牛血清(Gibco)，牛血清白蛋白(Amersco)，cAMP、HEPES、rolipram(Sigma)，Dextran T-500(Phamacia)，淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂有限公司)，均为分析纯；甲醇为色谱纯。

本实施例中的试剂的配制方法：

PBS配制方法：137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，8.8mmol/LNa₂HPO₄，1.5mmol/L KH₂PO₄，pH 7.4。

钙镁PBS：在PBS基础上加1mmol/L MgCl₂，1mmol/L CaCl₂，pH 7.4。50mmol磷酸缓冲液(pH 6.6)：0.1mol/L KH₂PO₄与0.1mol/L Na₂HPO₄以3∶2(v∶v)比例混匀，再做1倍稀释，即为50mmol磷酸缓冲液。

特殊分离液(在HBSS中加入缓冲能力很强的HEPES和Tris以增强提取过程中对中性粒细胞的保护)：140mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，1mmol/L MgCl₂，1mmol/L CaCl₂，1mmol/L NaH₂PO₄，10mmol/L HEPES，5mmol/L Tris。

Claims (10)

1.一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，其特征在于，该方法通过将中药提取物分别与PDE样品反应后，检测该PDE活性，判断抑制PDE活性的选择性作用靶点；再根据中药提取物指纹图谱的变化，判断抑制PDE的有效成分，从而筛选出选择性磷酸二酯酶抑制剂。

2.根据权利要求1所述的一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括的步骤为：中药提取物样品制备、PDE样品制备、细胞孵育、PDE活性检测、中药提取物样品指纹图谱检测。

3.根据权利要求2所述的一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，其特征在于，所述的PDE样品制备包括动物组织PDE样品制备、动物骨骼肌PDE样品制备、动物中性粒细胞PDE样品制备。

4.根据权利要求2所述的一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，其特征在于，所述的中药提取物样品制备包括以下步骤：

A.将中药原料药用蒸馏水淋洗后，加入水进行浸泡处理，再进行第一次煎煮，得到第一次煎液，将所述的第一次煎液存入另一容器中；

B.将第一次煎煮后的中药原料药中加入水进行第二次煎煮，得到第二次煎液；将所述的第一次煎液与第二次煎液合并，得到总煎液；

C.将所述的总煎液进行减压浓缩处理，得到浓缩液；所述的减压处理的温度为70℃；

D.向所述的浓缩液中加入95％的乙醇，边加边搅拌，得到混合溶液A；将所述的混合液A于4℃的环境中放置48小时，得到冷却后的混合液A；所述的浓缩液与乙醇的重量比为1∶3；

E.将所述的混合溶液A进行第一次离心处理，得到第一次上清液；再将所述的第一次上清液中的乙醇去除，得到无醇上清液；

F.将所述的无醇上清液进行浓缩处理，直至生药浓度为1g/ml，得到生药药液；

G.用pH值为7.4的PBS溶液调节所述的生药药液的pH值为7.4，再用所述的pH值为7.4的PBS溶液将所述的生药药液稀释10倍体积，得到生药稀释液；

H.将所述的生药稀释液中进行第二次离心处理，得到第二次上清液，作为中药提取物样品；于4℃的环境中储存备用。

5.根据权利要求2所述的一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，其特征在于，所述的动物组织PDE样品制备包括以下步骤：

A用心脏放血快速致死的方法处死试验动物，迅速采集该试验动物的各个组织，该组织为心、肝、脾、肺、肾；

B.分别向所述的动物的各个组织中加入钙镁PBS溶液，所述的各个组织与所述的钙镁PBS溶液的重量比为1∶10；再将所述的各个组织和所述的钙镁PBS溶液混合物冰浴制成各个组织溶浆，置于-80℃超低温冰箱中保存备用，作为动物组织PDE样品。

6.根据权利要求2所述的一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，其特征在于，所述的动物骨骼肌PDE样品制备包括以下步骤：

A.将试验动物处死后取骨骼肌组织，将所述的骨骼肌组织用Hank’s平衡盐缓冲液清洗；

B.将所述的骨骼肌组织剪碎，进行消化处理，得到骨骼肌组织消化液；该消化处理，再终止消化，得到骨骼肌组织消化终止液；；所述的骨骼肌组织消化终止液进行离心处理，弃上清得到沉淀物；

C.向所述的沉淀物中加入含血清培养基，将细胞团块吹散，得到细胞悬液；再将所述的细胞悬液进行过滤处理，得到骨骼肌细胞；

D.将所述的骨骼肌细胞进行预培养，再进行细胞计数，再将所述的预培养后的骨骼肌细胞进行培养；

E.进行所述的培养48小时后，将培养基更换为含10％FCS的DMEM培养基继续培养；继续培养96小时后，将培养基更换为含5％胎牛血清的DMEM培养基；

F.将所述的含5％胎牛血清的DMEM培养基培养过的骨骼肌细胞进行清洗处理，得到清洗过的骨骼肌细胞；

G.将所述的清洗过的骨骼肌细胞加入钙镁PBS进行冻融处理，得到细胞裂解液；

H.吸取10μl所述的细胞裂解液作为PDE酶样品，加入浓度为25μmol·L-1的cAMP中进行反应，再将该反应终止，得到反应液；

I.将所述的反应液进行离心处理，得到上清液，将该上清液用纯水做10倍稀释，得到动物骨骼肌PDE样品。

7.根据权利要求2所述的一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，其特征在于，所述的动物PDE样品制备包括以下步骤：

A.采集动物的新鲜血液，向该血液中加入肝素，得到全血样品；

B.将葡聚糖溶液混入所述的全血样品中，进行沉降处理，得到上清液；

C.将所述的上清液取出轻铺在淋巴细胞分离液上，离心处理后可见液体分为4层，保留最底层；

D.将所述的最底层进行纯化处理，得到高纯的中性粒细胞悬液；

E.用钙镁PBS稀释所述的中性粒细胞悬液，得到中性粒细胞稀释液；

F.将所述的中性粒细胞稀释液进行检测，再进行粉碎处理，得到中性粒细胞匀浆，即为中性粒细胞PDE样品。

8.根据权利要求2所述的一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，其特征在于，所述的细胞孵育包括以下步骤：

用钙镁PBS稀释所述的中性粒细胞悬液，得到中性粒细胞稀释液；所述的中性粒细胞稀释液中，中性粒细胞数目为10⁷-10⁸个/L；在24孔培养板中，加入所述的白芍提取物样品和中性粒细胞稀释液，空白对照组加入所述的白芍提取物样品和PBS，放入5％CO₂培养箱中培养，培养时间为1小时；将培养结束后的所述的中性粒细胞稀释液进行离心处理，得到上清液；将所述的上清液进行除菌处理，得到细胞孵育样品。

9.根据权利要求2所述的一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，其特征在于，所述的细胞孵育包括以下步骤：

A.配制反应体系：

中药管的反应体系：cAMP用钙镁PBS溶解并稀释至100μmol/L，所述的PDE样品量为10μL，cAMP 80μL，所述的中药样品量为10μL；

空白对照管的反应体系：加入灭活的所述的PDE样品10μL，用PBS补充反应液总量至100μL；

同时设中药对照管，反应体系：所述的各种中药提取物10μL，PBS90μL；

B.酶反应及活性检测：

a.将装有以上所述的各个反应体系的容器进行培养，所述的培养的温度为35℃，时间为30分钟；

b.将该EP管在沸水浴中加热2分钟终止反应；

c.将该管进行离心处理，得到上清液；

d.从该上清液中取其中的80μL，用超纯水做10倍稀释，过0.22-0.45μm微孔滤膜，得到HPLC样品；

检测结果中，PDE活性以底物水解百分率表示：

PDE活性％＝(空白对照管底物浓度-中药对照管或中药管底物浓度)/空白对照管底物浓度×100％

所述的中药样品对PDE活性的影响用以下公式表示：

PDE活性变化率％＝(空白对照管PDE活性-中药管PDE活性)/空白对照管PDE活性×100％；

所述的PDE活性变化率大于50％的中药提取物所对应的原料药，为该PDE样品来源的组织或细胞的磷酸二酯酶抑制剂。

10.根据权利要求2所述的一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法，其特征在于，所述的中药提取物样品指纹图谱检测包括以下步骤：将所述的中药提取物样品分别与所述的PDE样品和细胞孵育样品反应后，PDE活性显著降低，则进行高效液相色谱(HPLC)指纹图谱检测，确定该中药的PDE活性特异性抑制成分。

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