CN113984913A - 一种基于磷酸二酯酶抑制活性的生物限值评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于磷酸二酯酶抑制活性的生物限值评价方法。基于磷酸二酯酶(PDE)抑制活性，建立清金化痰汤抗炎活性测定方法，补充完善经典名方清金化痰汤的质量控制。以高效液相色谱法建立PDE酶活性测定方法，考察清金化痰汤抑制PDE酶活性的量效关系。通过测定多个批次供试品对PDE酶抑制率，以中和酶活性的国际单位U标示清金化痰汤水提物冻干粉的生物活性。本发明建立了PDE酶活性的HPLC检测方法，用于测定QJHTD对PDE酶的抑制效应，结果表明供试品对PDE酶抑制率为42.98‑70.05％，即1mg清金化痰汤水提物冻干粉最少可中和1.7U PDE酶活性。

Description

一种基于磷酸二酯酶抑制活性的生物限值评价方法
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体地，涉及一种基于磷酸二酯酶抑制活性的生物限值评价方法。
背景技术
清金化痰汤记载于明代叶文龄所著《医学统旨》卷六治疗“咳嗽”项下，由黄芩、栀子、桑白皮、桔梗、贝母、瓜蒌仁、橘红、茯苓、麦冬、知母和甘草11味药材组成。全方具有清热化痰止咳、清肺养阴润燥之功，是治疗咳嗽属痰热郁肺证的代表方剂，被各类中医药教材、临床指南、《古代经典名方目录(第一批)》收录或推荐。在现代临床上有着广泛的应用，尤其对以咳嗽咳痰为主要症状的呼吸道感染疗效显著，如慢阻肺急性加重期(AECOPD)、感冒、急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、肺炎、支气管扩张等。
生物活性测定法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用。其测定方法包括生物效价测定法和生物活性限值测定法。近年来，生物活性测定方法因其直接关联药效，已在多种中药开展了探索性研究，如水蛭、麝香、金银花、板蓝根、穿新莲等。环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)是细胞内重要的第二信使分子,可调节细胞内的多种信号传递和生理活动，如介导炎症细胞因子的产生与释放。磷酸二酯酶(PDEs)是一类可水解细胞内第二信使cAMP和cGMP的酶类，PDEs共由11种各具特性的同工酶家族组成，如PDE4被认为是一种新型抗炎靶标，主要用于肺部的炎症治疗。清金化痰汤治疗肺系病具有良好疗效，实验发现清金化痰汤具有抑制PDE酶的作用。因此，如何建立一种基于PDE抑制活性检测的清金化痰汤生物活性测定方法是业界需要解决的难题之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于磷酸二酯酶抑制活性的生物限值评价方法，用以解决背景技术中存在的技术问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种基于磷酸二酯酶抑制活性的生物限值评价方法，包括以下步骤：
步骤A1，溶液配制：
第一步，Ca/Mg PBS缓冲溶液：将NaCl溶液、KCl溶液、Na2HPO4溶液、KH2PO4溶液混合均匀，调节pH至7.3-7.5，再加入CaCl2溶液、MgCl2溶液，高温高压灭菌30-40分钟，经0.45μm滤膜过滤，得到Ca/Mg PBS缓冲溶液；
进一步，第一步中NaCl溶液、KCl溶液、Na2HPO4溶液、KH2PO4溶液、CaCl2溶液、MgCl2溶液的体积比为1：1：1：1：1：1。
进一步，NaCl溶液、KCl溶液、Na2HPO4溶液、KH2PO4溶液、CaCl2溶液、MgCl2溶液的浓度分别为137mmol·L-1、2.7mmol·L-1、8.8mmol·L-1、1.5mmol·L-1、1mmol·L-1、1mmol·L-1。
第二步，磷酸二酯酶(PDE)溶液：在冰浴条件下，将磷酸二酯酶溶于Ca/Mg PBS缓冲溶液，待溶解后混匀；
进一步，第二步中磷酸二酯酶、Ca/Mg PBS缓冲溶液的用量比为3.5-4.5U：0.35-0.45mL。
第三步，cAMP溶液：称取3.28-3.30mg cAMP，用Ca/Mg PBS缓冲溶液溶解定容到100mL；
第四步，清金化痰汤水提物冻干粉(QJHTD)溶液：称取各批次清金化痰汤水提物冻干粉，用Ca/Mg PBS缓冲液溶解，4℃条件下10000rpm离心10分钟取上清液，配制获得1.11、3.33、10.00、30.00mg·mL-1不同浓度的溶液；
第五步，IBMX溶液：称取2.22mg IBMX，用Ca/Mg PBS缓冲溶液溶解定容到5mL，再分别稀释为24.69、74.07、222.22、666.67μmol·L-1 4种不同浓度。
步骤A2，影响因素考察：
第六步，cAMP标准曲线的建立：精密吸取不同浓度cAMP对照品溶液20μL进入液相色谱仪，在254nm波长下检测，记录cAMP峰面积；
第七步，cAMP底物浓度的考察：在冰浴条件下，分别向空白管和测试管中加入37.5μL cAMP溶液(终浓度分别为25、37.5、50、62.5、75μmol·L-1)，接着向测试管加入30μL PDE溶液(终浓度4U·mL-1)，空白管加入30μL Ca/Mg PBS缓冲溶液，最后各管加入7.5μL Ca/MgPBS缓冲溶液，将各管置于37℃孵育箱中恒温孵育30min，在100℃水浴中加热3min终止反应，用超纯水稀释2倍，于4℃、12000rpm离心10min，取130μL上清液，直接用于高效液相色谱检测，HPLC进样20μL，254nm波长下检测；
第八步，酶反应的时间考察：根据第七步中cAMP底物浓度的测定结果选择最佳cAMP底物浓度，在冰浴条件下，向离心管中分别加入30μL PDE(终浓度4U·mL-1)，用Ca/MgPBS缓冲溶液补足至总体积为75μL，将各管置于37℃孵育箱中恒温孵育0、30、45、60、75、90min，在100℃水浴中加热3min终止反应，用超纯水稀释2倍，于4℃、12000rpm离心10min，取130μL上清液，直接用于高效液相色谱检测，HPLC进样20μL，254nm波长下检测；
步骤A3，PDE酶抑制率的检测：
在冰浴条件下，向空白管中分别加入37.5μL cAMP溶液，向对照样管中分别加入37.5μL cAMP溶液、30μL的PDE溶液，向供试品样品管中分别加入37.5μL cAMP溶液，30μLPDE溶液、7.5μL不同浓度的QJHTD溶液、IBMX溶液，空白管和对照样品管用Ca/Mg PBS缓冲溶液补足至总体积为75μL，将各管置于37℃孵育箱中恒温孵育30min后，在100℃水浴中加热3min，用超纯水稀释2倍，于4℃、12000rpm离心10min，取130μL上清液，直接用于高效液相色谱检测，测得cAMP峰面积；
进一步，步骤A3中液相色谱的条件为：流动相采用5％甲醇和95％的质量分数0.5％的醋酸水溶液等度洗脱，检测波长为254nm，色谱柱温为30℃，流动相流速1.0mL/min，样品运行时间为25min，进样量为20μL。
进一步，原理为：cAMP可以通过高效液相色谱在紫外可见光范围内进行检测，抑制剂可以抑制cAMP与PDE酶的结合，从而抑制cAMP分解生成5-AMP，在高效液相色谱中反应为峰面积值的变化。在体外酶活性抑制实验中，化合物与PDE结合后会导致PDE对cAMP的降解作用减弱，峰面积值也会随之产生变化，若对PDE酶活性抑制越强，则相应的cAMP的峰面积值就越大，反之亦然。
步骤A4，QJHTD和阳性对照药IBMX抑制PDE酶活性的量效关系考察：
重复步骤A3的操作，考察不同批次不同浓度的QJHTD、以及不同浓度PDE酶抑制剂IBMX，对PDE酶活性的抑制情况，计算得到抑制率；
进一步，步骤A4中QJHTD批次为19112602、19112607、19112608，终浓度分别为0.11、0.33、1.00、3.00mg·mL-1，IBMX的终浓度为2.47、7.41、22.22、66.67μmol·L-1。
步骤A5，方法学考察：
第九步，仪器精密度试验：精密吸取cAMP溶液20μL，连续进样6次，测得cAMP峰面积，计算RSD值；
第十步，供试品稳定性试验：取QJHTD按照步骤A3的方法制备供试品溶液，按步骤A3的色谱条件在0、6、12、24、48小时分别进样20μL，测得cAMP峰面积，计算RSD值；
第十一步，重复性试验：取QJHTD溶液和IBMX溶液按照步骤A3的实验方法重复6次，测得cAMP面积，计算抑制率；
第十二步，中间精密度考察：考察实验室不同仪器和不同实验人员对QJHTD溶液和IBMX溶液对PDE抑制率的影响，以考察方法的中间精密度；
第十三步，方法适用性考察：按拟采用的生物活性测定方法和剂量对QJHTD待检批次19112601、19112603、19112604、19112605、19112606、19112609、19112610进行方法适用性考察。
本发明的有益效果：
基于理论可知，PDE酶抑制剂可降低PDE酶活性，减弱其对cAMP和cGMP的降解能力，从而减少炎症因子的产生和释放。现代研究表明清金化痰汤可降低血清、肺组织或肺泡灌洗液中炎症因子水平，减轻气道炎症反应。结合清金化痰汤抗炎的生物活性，首先优化了cAMP底物浓度和酶反应的时间，建立了PDE酶抑制率的检测方法，通过考察清金化痰汤对PDE酶抑制作用，发现在一定浓度范围内，清金化痰汤水提物冻干粉对PDE酶表现出明显的抑制作用并呈剂量依赖关系，因此选择对PDE酶抑制率作为考察指标。在本研究的实验条件下，确定清金化痰汤水提物冻干粉1mg·mL-1为限值浓度，在该限值浓度下，供试品对PDE酶抑制率为42.98-70.05％，即1mg清金化痰汤水提物冻干粉最少可中和1.7U PDE酶活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为cAMP标准曲线；
图2为cAMP底物浓度对cAMP减少量的影响；
图3为酶反应时间对cAMP减少量的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
配制溶液：
第一步，Ca/Mg PBS缓冲溶液：将137mmol·L-1NaCl溶液、2.7mmol·L-1KCl溶液、8.8mmol·L-1Na2HPO4溶液、1.5mmol·L-1KH2PO4溶液混合均匀，调节pH至7.3，再加入1mmol·L-1CaCl2溶液、1mmol·L-1MgCl2溶液，高温高压灭菌35分钟，经滤膜过滤，得到Ca/Mg PBS缓冲溶液，其中NaCl溶液、KCl溶液、Na2HPO4溶液、KH2PO4溶液、CaCl2溶液、MgCl2溶液的体积均为50mL；
第二步，磷酸二酯酶溶液：在冰浴条件下，将3.5U磷酸二酯酶溶于0.35mL Ca/MgPBS缓冲溶液，待溶解后混匀；
第三步，cAMP溶液：称取3.28mg cAMP，用Ca/Mg PBS缓冲溶液溶解定容到100mL；
第四步，清金化痰汤水提物冻干粉(QJHTD)溶液：称取各批次清金化痰汤水提物冻干粉，用Ca/Mg PBS缓冲液溶解，4℃条件下10000rpm离心10分钟取上清液，配制获得1.11、3.33、10.00、30.00mg·mL-1不同浓度的溶液；
第五步，IBMX溶液：称取2.22mg IBMX，用Ca/Mg PBS缓冲溶液溶解定容到5mL，再分别稀释为24.69、74.07、222.22、666.67μmol·L-1 4种不同浓度。
实施例2
配制溶液：
第一步，Ca/Mg PBS缓冲溶液：将137mmol·L-1NaCl溶液、2.7mmol·L-1KCl溶液、8.8mmol·L-1Na2HPO4溶液、1.5mmol·L-1KH2PO4溶液混合均匀，调节pH至7.4，再加入1mmol·L-1CaCl2溶液、1mmol·L-1MgCl2溶液，高温高压灭菌35分钟，经滤膜过滤，得到Ca/Mg PBS缓冲溶液，其中NaCl溶液、KCl溶液、Na2HPO4溶液、KH2PO4溶液、CaCl2溶液、MgCl2溶液的体积均为100mL；
第二步，磷酸二酯酶溶液：在冰浴条件下，将4U磷酸二酯酶溶于0.40mL Ca/Mg PBS缓冲溶液，待溶解后混匀；
第三步，cAMP溶液：称取3.29mg cAMP，用Ca/Mg PBS缓冲溶液溶解定容到100mL；
第四步，清金化痰汤水提物冻干粉(QJHTD)溶液：称取各批次清金化痰汤水提物冻干粉，用Ca/Mg PBS缓冲液溶解，4℃条件下10000rpm离心10分钟取上清液，配制获得1.11、3.33、10.00、30.00mg·mL-1不同浓度的溶液；
第五步，IBMX溶液：称取2.22mg IBMX，用Ca/Mg PBS缓冲溶液溶解定容到5mL，再分别稀释为24.69、74.07、222.22、666.67μmol·L-1 4种不同浓度。
实施例3
cAMP标准曲线的建立：
参照表1和图1，精密吸取已制备的不同浓度cAMP对照品溶液,20μL进入液相色谱仪，在254nm波长下检测，记录cAMP峰面积，以cAMP峰面积(Y)为纵坐标，cAMP溶液浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线；
表1 cAMP峰面积与浓度线性关系考察
Figure BDA0003246386090000081
结果表明：cAMP在1.56-100μmol·L-1范围内呈良好线性关系，cAMP线性回归方程为：Y＝15448X(r＝1，n＝7)。
实施例4
cAMP底物浓度的考察：
参照表2、图2，在冰浴条件下，分别向空白和测试管中加入37.5μL cAMP溶液(终浓度分别为25、37.5、50、62.5、75μmol·L-1)，接着向测试管加入30μL PDE溶液(终浓度4U·mL-1)，空白管加入30μL Ca/Mg PBS缓冲溶液，最后各管加入7.5μL Ca/Mg PBS缓冲溶液，将各管置于37℃孵育箱中恒温孵育30min，在100℃水浴中加热3min终止反应，用超纯水稀释2倍，于4℃、12000rpm离心10min，取130μL上清液，直接用于高效液相色谱检测，HPLC进样20μL，254nm波长下检测；
表2 cAMP底物浓度对酶反应速率影响的考察
Figure BDA0003246386090000082
Figure BDA0003246386090000091
结果表明：在30min反应时间内，随着cAMP浓度的增大，cAMP减少量逐渐增大，应与酶的反应速率有关，在50μmol·L-1cAMP浓度，cAMP减少速率变缓，故底物浓度选择50μmol·L-1。
实施例5
酶反应时间考察：
参照表3、图3，选择实施例3中最佳cAMP底物浓度50μmol·L-1，在冰浴条件下，向离心管中分别加入30μL PDE溶液(终浓度4U·mL-1)，用Ca/Mg PBS缓冲溶液补足至总体积为75μL，将各管置于37℃孵育箱中恒温孵育0、30、45、60、75、90min，在100℃水浴中加热3min终止反应，用超纯水稀释2倍，于4℃、12000rpm离心10min，取130μL上清液，直接用于高效液相色谱检测，HPLC进样20μL，254nm波长下检测；
表3酶反应时间的考察
Figure BDA0003246386090000092
结果表明：终浓度4U·mL-1PDE溶液和50μmol·L-1cAMP反应过程中，在90min内，随着酶反应时间的增加，cAMP减少量增加，考虑到时间成本，故反应时间选择为60min。
实施例6
清金化痰汤抑制PDE酶活性的量效关系考察：
参照表4-7，在冰浴条件下，向空白管中分别加入37.5μL cAMP溶液，向对照样管中分别加入37.5μL cAMP溶液、30μL的PDE溶液，向供试品样品管中分别加入37.5μL cAMP溶液，30μL PDE溶液，7.5μL不同浓度的QJHTD溶液、IBMX溶液，空白管和对照样品管用Ca/MgPBS缓冲溶液补足至总体积为75μL，将各管置于37℃孵育箱中恒温孵育30min后，在100℃水浴中加热3min，用超纯水稀释2倍，于4℃、12000rpm离心10min，取130μL上清液，直接用于高效液相色谱检测，测得cAMP峰面积，其中QJHTD批次为19112602、19112607、19112608，终浓度分别为0.11、0.33、1.00、3.00mg·mL-1，IBMX的终浓度为2.47、7.41、22.22、66.67μmol·L-1，液相色谱的条件为：流动相采用5％甲醇和95％的质量分数0.5％的醋酸水溶液等度洗脱，检测波长为254nm，色谱柱温为30℃，流动相流速1.0mL/min，样品运行时间为25min，进样量为20μL；
表4 QJHTD(Lot.19112602)抑制PDE酶的量效关系考察(x±s,n＝3)
Figure BDA0003246386090000101
表5 QJHTD(Lot.19112607)抑制PDE酶的量效关系考察(x±s,n＝3)
Figure BDA0003246386090000102
Figure BDA0003246386090000111
表6 QJHTD(Lot.19112608)抑制PDE酶的量效关系考察(x±s,n＝3)
Figure BDA0003246386090000112
反应抑制率公式为：抑制率(％)＝(样品组cAMP峰面积－对照组cAMP峰面积)/(空白组cAMP峰面积－对照组cAMP峰面积)×100％
结果表明：在0.11-3.0mg·mL-1浓度范围随给药浓度的增大，对PDE酶抑制率增大，呈线性关系，当QJHTD溶液浓度为1mg·mL-1时，19112602、19112607、19112608三个批次药物对PDE酶抑制率分别为47.22±2.37％、52.13±2.96％、56.52±5.67％，RSD<11％，抑制效果稳定，基于不同批次QJHTD冻干粉水溶液配制情况，试验选择1mg·mL-1作为QJHTD抑制PDE酶活性的检测浓度。
表7 IBMX对PDE抑制率的影响(x±s,n＝6)
Figure BDA0003246386090000113
Figure BDA0003246386090000121
结果表明：在2.47-66.67μmol·L-1浓度范围随给药浓度的增大，PDE酶抑制率增大，但浓度越低，实验误差越大，当IBMX浓度为22.22μmol·L-1，抑制率为50.27％，RSD为8.89％，抑制效果稳定，综合以上实验结果，选择IBMX作为阳性对照品的浓度为22.22μmol·L-1。
实施例7
仪器精密度试验：
参照表8，精密吸取12.50μmol·L-1cAMP对照品溶液20μL，连续进样测定6次，记录cAMP的峰面积，计算RSD值；
表8精密度试验结果
Figure BDA0003246386090000122
结果表明cAMP峰面积的RSD分别为0.87％，表明精密度良好。
实施例8
样品稳定性试验：
参照表9，在冰浴条件下，制备37.5μL cAMP(50μmol·L-1)，30μLPDE酶(4U·mL-1)和7.5μL QJHTD溶液(终浓度1mg·mL-1)的待测样品，置于37℃恒温孵育60min，在100℃水浴中加热3min，终止反应，离心取上清，按上述色谱条件在0、2、4、8、12、24小时分别进样20μL，测得cAMP峰面积，计算RSD值；
表9清金化痰汤供试品溶液稳定性试验结果
Figure BDA0003246386090000131
测定结果表明在24小时内，样品稳定性良好，RSD值为1.00％。
实施例9
重复性试验：
参照表10，取批次为19112602的QJHTD以及IBMX，按实施例5的方法重复实验6次，测得cAMP面积，测定PDE酶抑制率，并计算RSD；
表10 IBMX和QJHTD(Lot.19112602)对PDE酶抑制率的影响(x±s,n＝6)
Figure BDA0003246386090000132
由此可知，重复6份1mg·mL-1QJHTD溶液PDE酶抑制率为51.09％，RSD为6.22％，同理重复6份22.22μmol·L-1IBMX溶液PDE酶抑制率为41.99％，RSD为12.25％，表明重复性结果良好。
实施例10
中间精密度考察：
不同仪器对测定结果的影响：
参照表11，对重复性试验的样品换台仪器重新进样检测，测得cAMP面积，测定PDE酶抑制率，并计算RSD；
表11不同仪器测定IBMX和QJHTD对PDE酶抑制率的影响(x±s,n＝6)
Figure BDA0003246386090000141
结果表明：与实施例8的数据对比发现，不同仪器对测定结果的影响并无差异。
不同实验人员对测定结果的影响：
参照表12，由实验室另外一名人员对批次为19112602的QJHTD以及IBMX进行测定，测得cAMP面积，测定PDE酶抑制率，并计算RSD。
表12不同实验人员测定IBMX和QJHTD对PDE酶抑制率的影响(x±s,n＝6)
Figure BDA0003246386090000142
结果表明：参照实施例8、实施例9的数据，即综合2位操作者的测定结果)，IBMX和QJHTD抑制PDE酶活性稳定，RSD值均小于15％，说明不同实验人员对测定结果的影响不大，中间精密度较好
实施例11
方法适用性考察：
参考表13，按拟采用的生物活性测定方法和剂量对QJHTD待检批次19112601、19112603、19112604、19112605、19112606、19112609、19112610进行方法适用性考察，考察质量标准中该测定方法的适用性；
表13 7个批次QJHTD对PDE酶抑制率的影响(x±s,n＝3)
Figure BDA0003246386090000151
结果表明：这7批QJHTD对PDE抑制率分别为51.37±2.13％、52.79±4.36％、50.88±5.59％、58.18±1.06％、66.14±3.91％、52.63±7.85％、48.55±5.57％，7批样品抑制率为42.98-70.05％，且RSD值小于15％，判断合格。
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种基于磷酸二酯酶抑制活性的生物限值评价方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤A1，溶液配制：包括配制Ca/Mg PBS缓冲溶液、PDE溶液、cAMP溶液、QJHTD溶液、IBMX溶液；
步骤A2，cAMP标准曲线的建立；
步骤A3，cAMP底物浓度的考察；
步骤A4，酶反应的时间考察；
步骤A5，PDE酶抑制率的检测，包括如下步骤：
在冰浴条件下，向空白管中加入cAMP溶液，向对照样品管中分别加入cAMP溶液、PDE溶液，向供试品样品管中分别加入cAMP溶液，PDE溶液、不同浓度的QJHTD溶液、不同浓度的IBMX溶液，空白管和对照样品管用Ca/Mg PBS缓冲溶液补足至相同体积，将各管置于孵育箱中恒温孵育处理后，水浴加热后，用超纯水稀释，离心，取上清液，直接用于高效液相色谱检测，测得cAMP峰面积。
2.根据权利要求1所述的一种基于磷酸二酯酶抑制活性的生物限值评价方法，其特征在于：步骤A2中cAMP标准曲线的建立的步骤为：精密吸取各浓度的cAMP对照品溶液进入液相色谱仪，绘制标准曲线。
3.根据权利要求1所述的一种基于磷酸二酯酶抑制活性的生物限值评价方法，其特征在于：步骤A3中cAMP底物浓度的考察步骤为：在冰浴条件下，分别向空白管和测试管中加入各浓度的cAMP溶液，接着向测试管加入PDE溶液，空白管加入Ca/Mg PBS缓冲溶液，最后各管再加入Ca/Mg PBS缓冲溶液，将各管置于孵育箱中恒温孵育，水浴加热后，用超纯水稀释，离心，取上清液，直接用于高效液相色谱检测。
4.根据权利要求1所述的一种基于磷酸二酯酶抑制活性的生物限值评价方法，其特征在于：步骤A4中酶反应的时间考察步骤为：在冰浴条件下，向离心管中分别加入PDE溶液，用Ca/Mg PBS缓冲溶液补足至同一体积，将各管置于孵育箱中恒温孵育不同时间，水浴加热后，用超纯水稀释，离心，取上清液，直接用于高效液相色谱检测。
5.根据权利要求1所述的一种基于磷酸二酯酶抑制活性的生物限值评价方法，其特征在于：步骤A5中液相色谱的条件为：流动相采用5％甲醇和95％的质量分数0.5％的醋酸水溶液等度洗脱，流动相流速1.0mL/min。
6.根据权利要求1所述的一种基于磷酸二酯酶抑制活性的生物限值评价方法，其特征在于：步骤A5中液相色谱的条件为：检测波长为254nm，色谱柱温为30℃，样品运行时间为25min，进样量为20μL。
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