CN113376274B - 一种泻白散基准样品指纹图谱的检测及控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种泻白散。本发明进一步提供了一种泻白散基准样品(物质基准)的制备方法及其应用。本发明还提供了一种泻白散基准样品的指纹图谱的检测方法。本发明另外提供一种泻白散的标准指纹图谱的构建方法和泻白散的指纹图谱的质量控制方法。此外，本发明提供一种泻白散中地骨皮乙素、地骨皮甲素含量的检测方法。本发明提供的一种泻白散基准样品指纹图谱的检测及控制方法，能够获得具有优异质量的泻白散基准样品，其质量稳定、不合格率低，还建立了泻白散的高效液相指纹图谱，有利于整体控制泻白散的内在质量，为更好地建立泻白散整体质量控制评价体系提供科学试验依据。
Description
技术领域
本发明属于中药制备及其成分的质量控制与检测的技术领域，涉及一种泻白散基准样品指纹图谱的检测及控制方法；具体涉及一种泻白散及其泻白散基准样品的制备方法，泻白散基准样品的指纹图谱的检测方法，泻白散的标准指纹图谱的构建方法，泻白散的指纹图谱的质量控制方法，泻白散中地骨皮乙素、地骨皮甲素含量的测定方法。
背景技术
“经典名方物质基准”，是指以古代医籍中记载的经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质的标准，应按照国家发布的古代经典名方关键信息及古籍记载，研究、制备基准样品(物质基准)。
泻白散出自《小儿药证直诀》(宋·钱乙)“治小儿肺盛，气急喘嗽。”其处方包括有地骨皮(洗去土，焙)、桑白皮(细锉炒黄)各一两，甘草(炙)一钱。具体制备时，采用上锉散，入粳米一撮，水二小盏，煎七分，食前服。方中桑白皮甘寒入肺，清肺热，泻肺气，平喘咳，为君药。地骨皮甘淡而寒归肺肾经，直入阴分泻肺中伏火，并退虚热，为臣药。君臣相伍，清泻肺火，以复肺气肃降之职。炙甘草、粳米养胃和中，培土生金，以扶肺气，兼调药性，共为佐使药。四药合用，清热而不伤阴，泻肺而不伤正，肺脾并调，咳止喘平。
泻白散的基准样品中含有多种有效化学成分。例如，桑皮苷A是一种化学物质，分子式是C26H32O14，是桑白皮、桑枝中一种二苯乙烯苷类活性成分；研究表明其具有镇咳平喘、抑制酪氨酸酶以及抗氧化等活性。地骨皮乙素、地骨皮甲素是同分异构体，为中药地骨皮里面的主要活性成分，属于精胺生物碱；地骨皮乙素体外可以从源头阻断细胞的炎症活化，避免免疫反应紊乱，也是降血压有效成分。甘草苷和甘草酸是甘草中的主要活性成分，研究表其具有解毒、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用，同时还有报道表明甘草苷和甘草酸具有增加免疫，保护阿尔茨海默脑，抗氧化、抗糖尿病、抗哮喘等作用。
目前，已有对泻白散的中成分进行检测的方法。如申请号为“201811344359.5”的发明专利申请，提供了一种泻白散的含量测定方法，但是仅测定泻白散中桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵的含量，并没有对臣药地骨皮中有效成分含量做限定。再如申请号为“202010666660.9”的发明专利申请，提供了一种泻白散颗粒中地骨皮乙素和桑皮苷A的UPLC含量检测方法，但是仅测定泻白散中桑皮苷A、地骨皮乙素的含量，而且该方法中地骨皮乙素分离度并未达标。由于地骨皮乙素和地骨皮甲素为同分异构体，分离困难，目前未有文献同时对泻白散中地骨皮乙素和地骨皮甲素进行含量测定，也没有泻白散指纹图谱的报道中将地骨皮乙素和地骨皮甲素分开并指认的文献。可见，上述专利针对泻白散的基准样品中成分检测不全面。本专利针对方中臣药地骨皮中主要有效成分地骨皮乙素、地骨皮甲素在方中的含量测定方法，提高了其稳定性，补充以上专利的不足，并且提高了泻白散指纹图谱的的标准。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种泻白散基准样品指纹图谱的检测及控制方法，能够提供质量稳定、不合格率低的泻白散，并通过可靠的制备方法及色谱条件摸索出泻白散基准样品的高效液相指纹图谱，并对泻白散中地骨皮乙素、地骨皮甲素含量进行测定，可以客观、全面、准确的评价泻白散的质量，从而能够达到更加全面、有效地控制泻白散组合物制剂产品质量的目的，对控制泻白散的质量和保证临床疗效具有重要意义。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种泻白散，由炒桑白皮、地骨皮、炙甘草、粳米经水提制得，采用高效液相色谱(HPLC)法测定获得泻白散的标准指纹图谱，符合下列条件：
1)所述泻白散的标准指纹图谱中，共有特征峰面积占总色谱峰面积的百分比≥65％；
2)所述泻白散的标准指纹图谱中，以各共有峰的保留时间与参照峰的保留时间比值作为相对保留时间，包括19个共有指纹峰，以6号峰为参照峰S峰，保留时间为1.0000±0.0000，其他18个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰0.3912、2号峰0.4301、3号峰0.6258、4号峰0.7265、5号峰0.8065、7号峰1.0437、8号峰1.1725、9号峰1.2216、10号峰1.2768、11号峰1.3476、12号峰1.3871、13号峰1.4666、14号峰1.5049、15号峰1.8411、16号峰1.8958、17号峰2.3548、18号峰2.4704、19号峰2.7589；上述除6号峰外18个共有特征峰的相对保留时间的相对偏差均≤±10％；其中，定位确定7个指纹峰：6号峰为桑皮苷A、7号峰为绿原酸、9号峰为地骨皮乙素、10号峰为地骨皮甲素、16号峰为甘草苷、18号峰为甘草素、19号峰为甘草酸铵。
本发明第二方面提供一种泻白散基准样品的制备方法，包括：取各药材成分混合后水提，获得的水提液进行冷冻干燥，以提供泻白散基准样品。
优选地，所述药材成分按重量份计，包括如下组分：
炒桑白皮3-4份；
地骨皮3-4份；
炙甘草0.1-1份；
粳米0.5-3份。
更优选地，所述药材成分按重量份计，包括如下组分：
炒桑白皮3.93份；
地骨皮3.93份；
炙甘草0.39份；
粳米1份。
优选地，所述水提中加水量按重量份计，加入量为100-140份，加入量为120份。
上述泻白散中，桑白皮甘寒入肺，清肺热，泻肺气，平喘咳，为君药。地骨皮甘淡而寒归肺肾经，直入阴分泻肺中伏火，并退虚热，为臣药。君臣相伍，清泻肺火，以复肺气肃降之职。炙甘草、粳米养胃和中，培土生金，以扶肺气，兼调药性，共为佐使药。四药合用，清热而不伤阴，泻肺而不伤正，肺脾并调，咳止喘平。临床证见咳声清高，无痰者，若投本方，可以获效。表证忌用，吴鞠通谓表证用之，如油入面，将成锢结不可解之劳怯，故用时宜慎。
优选地，所述各药材成分粉碎后的粒度为4-24目，优选为4目。
优选地，所述水提为加水进行浸泡，先武火后文火煎煮后过滤。
更优选地，所述浸泡在煎药壶中加盖浸泡。
更优选地，所述浸泡时间为1-30min，优选为15min。
更优选地，所述武火的温度为180-220℃。
更优选地，所述文火煎煮的温度为100-120℃。
更优选地，所述武火煮沸的时间为5-40min，优选为10min。
更优选地，所述文火煎煮的时间为5-100min，优选为10min。
更优选地，所述文火煎煮后水提液的体积为加水量体积的65-75％，优选为70％。
更优选地，所述过滤提取的过滤尼龙布为100-300目，优选为100目。
优选地，所述冷冻干燥使水提液至粉末状冻干粉。
更优选地，所述冷冻的温度为-18～-80℃；干燥的温度为10-35℃。
更优选地，所述冷冻干燥的冷冻时间为11-13h，优选为12h；干燥时间为46-50h，优选为48h。
本发明第三方面提供一种泻白散基准样品，由上述方法制备获得。
本发明第四方面提供一种泻白散的制剂，包含上述泻白散基准样品。
优选地，所述制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、注射剂或外用药物制剂中的一种。
本发明第五方面提供一种泻白散基准样品的指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：将泻白散样品加水溶解，获得的溶解液加有机溶剂定容，离心、过滤，获得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备：提供对照品溶液，所述对照品溶液包括桑皮苷A、绿原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、甘草苷、甘草素、甘草酸铵对照品和有机溶剂；
3)测定：采用相同色谱条件的高效液相色谱(HPLC)法分别测定供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行比较，对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位，从而获得泻白散基准样品的指纹图谱。
优选地，步骤1)中，所述泻白散样品为泻白散水提液进行冷冻干燥的产物，所述泻白散水提液与水加入的体积之比为1:1-2，优选为1:1。
优选地，步骤1)或2)中，所述有机溶剂为甲醇。
优选地，步骤1)中，所述溶解液的取液量与有机溶剂的加入的体积之比为1:1-2，优选为1:1。
优选地，步骤1)中，所述离心条件为：离心时间为5-10min，离心速率为5000-10000rpm。
优选地，步骤1)中，所述过滤采用的滤膜为0.22-0.45μm微孔滤膜。
优选地，步骤2)中，所述桑皮苷A的CAS号为102841-42-9，所述绿原酸的CAS号为327-97-9，所述地骨皮乙素的CAS号为164991-67-7，所述地骨皮甲素的CAS号为75288-96-9，所述甘草苷的CAS号为551-15-5，所述甘草素的CAS号为578-86-9，所述甘草酸铵的CAS号为53956-04-0。桑皮苷A为桑白皮的入血成分，具有平喘止咳的功效，为桑白皮的有效成分。地骨皮为方中臣药，其中主要有效成分为地骨皮乙素和地骨皮甲素，可以从源头阻断细胞的炎症活化，避免免疫反应紊乱。甘草项下定量指标为甘草苷和甘草酸。
优选地，步骤3)中，所述供试品溶液的指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行比较，是根据对照品溶液的指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出供试品溶液的指纹图谱中的相应特征峰，从而对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的色谱柱为C18亲水性毛细管色谱柱，优选为Agilent Zorbax SB-Aq毛细管色谱色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的检测器为光电二极管阵列检测器(DAD)。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的柱温为20-30℃。更优选地，所述高效液相色谱法中的柱温为25℃。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中的进样量为5-30μL。更优选地，所述高效液相色谱法中的进样量为20μL。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中，流速为0.5-2.0mL/min。更优选地，所述高效液相色谱法中，流速为1.0mL/min。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中，检测波长为210-326nm，优选为273nm。
优选地，步骤3)中，所述高效液相色谱法中，流动相为0.05-0.2％三氟乙酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.05-0.2％三氟乙酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为75min；梯度洗脱。
更优选地，所述高效液相色谱法中，流动相为0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为75min；梯度洗脱。
所述0.05-0.2％三氟乙酸水溶液为体积百分数为0.05-0.2％的三氟乙酸水溶液。所述0.1％三氟乙酸水溶液为体积百分数为0.1％的三氟乙酸水溶液。
更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-40min，A相：B相体积比为95：5-80：20；
40-60min，A相：B相体积比为80：20-60：40；
60-70min，A相：B相体积比为60：40-2：98。
本发明第六方面提供一种泻白散的标准指纹图谱的构建方法，包括：通过采用前述泻白散基准样品的指纹图谱的检测方法分别对多批泻白散样品进行检测，获得多批泻白散样品的指纹图谱生成共有模式对照图谱，以图谱中均存在的色谱峰作为共有特征峰，确定共有特征峰的相对保留时间、各共有特征峰面积与总峰面积的比值，并根据相对保留时间对泻白散样品指纹图谱中指标成分进行归属定位，建立泻白散的标准指纹图谱。
优选地，所述泻白散样品的检测批次为10～20批，优选为15批。
优选地，所述共有模式对照图谱中，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版软件对多批泻白散样品的指纹图谱进行相似度比较。
更优选地，所述多批泻白散样品的指纹图谱的相似度≥0.85。
优选地，所述泻白散的标准指纹图谱如图1所示，以各共有峰的保留时间与参照峰的保留时间比值作为相对保留时间，包括19个共有指纹峰，以6号峰为参照峰(S峰，保留时间为1.0000±0.0000)，其他18个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰0.3912、2号峰0.4301、3号峰0.6258、4号峰0.7265、5号峰0.8065、7号峰1.0437、8号峰1.1725、9号峰1.2216、10号峰1.2768、11号峰1.3476、12号峰1.3871、13号峰1.4666、14号峰1.5049、15号峰1.8411、16号峰1.8958、17号峰2.3548、18号峰2.4704、19号峰2.7589；上述除6号峰外18个共有特征峰的相对保留时间的相对偏差均≤±10％。优选地，所述泻白散的标准指纹图谱中共有特征峰面积占总色谱峰面积的百分比≥65％。
更优选地，所述泻白散的标准指纹图谱中共有特征峰面积占总峰面积的百分比范围为69.91±2.482％。
更优选地，所述泻白散的标准指纹图谱中如图1所示，定位确定7个指纹峰：6号峰为桑皮苷A、7号峰为绿原酸、9号峰为地骨皮乙素、10号峰为地骨皮甲素、16号峰为甘草苷、18号峰为甘草素、19号峰为甘草酸铵。本发明第七方面提供一种泻白散的指纹图谱的质量控制方法，包括：采用前述泻白散基准样品的指纹图谱的检测方法获得泻白散基准样品的指纹图谱，与采用前述泻白散的标准指纹图谱的构建方法获得的泻白散的标准指纹图谱，进行相似度比较。
优选地，所述相似度比较时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版软件进行。
优选地，所述相似度≥0.85。
本发明第八方面提供一种泻白散中地骨皮乙素、地骨皮甲素含量的检测方法，包括以下步骤：
A)供试品溶液的制备：将泻白散样品加水复溶，获得的复溶液加第一溶剂定容，离心，取上清液，获得供试品溶液；
B)对照品溶液的制备：提供对照品溶液，所述对照品溶液包括地骨皮乙素对照品、地骨皮甲素对照品和第二溶剂；
C)测定：采用高效液相色谱法，分别测定步骤A)的供试品溶液和步骤B)的对照品溶液；采用外标法计算供试品溶液中地骨皮乙素、地骨皮甲素的含量。
优选地，步骤A)中，所述泻白散样品为泻白散水提液进行冷冻干燥的产物，所述泻白散水提液与水加入的体积之比为1:1-2，优选为1:1。
优选地，步骤A)中，所述复溶液与第一溶剂的加入的体积之比为1:1-2。
优选地，步骤A)中，所述第一溶剂为含0.5-2％(v/v)乙酸的甲醇溶液，优选为含1％(v/v)乙酸的甲醇溶液。
优选地，步骤A)中，所述离心条件为：离心时间为10-20min，优选为15min；离心速率为10000-20000rpm，优选为15000rpm。优选地，步骤B)中，所述第二溶剂为40-60％甲醇的水溶液(v/v)和0.4-0.6％乙酸的水溶液(v/v)。
更优选地，所述第二溶剂为50％甲醇的水溶液(v/v)和0.5％乙酸的水溶液(v/v)。优选地，步骤B)中，所述对照品溶液中，地骨皮乙素的含量范围为15.1-604μg/mL，地骨皮甲素的含量范围为2.72-108.8μg/mL。
优选地，步骤C)中，所述高效液相色谱法的色谱条件中，色谱柱：C18亲水性毛细管色谱柱，优选为Agilent Zorbax SB-Aq毛细管色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测波长：275-285nm，优选为280nm；流动相：0.05-0.2％三氟乙酸水溶液-乙腈，优选为0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈，其中，A相为：0.05-0.3％三氟乙酸水溶液，优选为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为45min；梯度洗脱。
更优选地，如表1所示，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-30min，A相：B相体积比为90：10-90：10；
30-31min，A相：B相体积比为90：10-30：70；
31-35min，A相：B相体积比为30：70-30：70；
35-36min，A相：B相体积比为30：70-90：10；
36-45min，A相：B相体积比为90：10-90：10。
所述地骨皮乙素和地骨皮甲素专属性的高效液相色谱图中如图5所示。
表1
| 时间(min) | A相(％) | B相(％) |
| 0 | 90 | 10 |
| 30 | 90 | 10 |
| 31 | 30 | 70 |
| 35 | 30 | 70 |
| 36 | 90 | 10 |
| 45 | 90 | 10 |
优选地，步骤C)中，所述高效液相色谱法的色谱条件中，柱温：20-30℃，优选为25℃；流速：0.5-2.0mL/min，优选为1.0mL/min；进样量：1-10μL，优选为5μL。
优选地，步骤C)中，所述外标法是指：分别移取一系列不同体积的步骤B)所述对照品溶液，分别配成一系列不同浓度的溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，获得对照品溶液中地骨皮乙素、地骨皮甲素与峰面积的线性关系，以地骨皮乙素、地骨皮甲素色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到相应标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液采用高效液相色谱仪检测，将获得的供试品溶液中地骨皮乙素、地骨皮甲素的色谱峰面积，分别代入相应标准工作曲线的回归方程中，可得到相应成分的含量。
本发明中的用水均为纯净水。
如上所述，本发明提供的一种泻白散基准样品指纹图谱的检测及控制方法，经过泻白散方剂的历史沿革调研，优选泻白散的制备工艺及干燥工艺，能够获得具有优异质量的泻白散。相比常规方法制备的泻白散，其质量稳定、不合格率低，不同批次的泻白散一致性好。
同时，根据目前关于泻白散指纹图谱检测方法出现的不足，本发明采用高效液相色谱法建立分离度高、重现性好的标准指纹图谱，确认其中19个色谱峰为共有峰，采用对照品比对的方法，标定了桑皮苷A、绿原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、甘草苷、甘草素、甘草酸铵共7个特征峰。具有以下有益效果。
(1)本发明对泻白散的制备工艺进行优选，将现代提取方法与古法进行对比，以确定泻白散与传统汤剂的一致性。
(2)确定的本发明对泻白散的制备工艺采用煎药壶加盖煎煮、文武火加热、煎煮前浸泡，并以冷冻干燥方式进行基准样品的制备，并且制定了泻白散中臣药中地骨皮乙素、地骨皮甲素的含量测定方法，地骨皮乙素和地骨皮甲素在中性溶液中不稳定，可能是因为邻二氢咖啡酰胺氧化成醌的原因，当溶液中加入乙酸调节pH值，在酸性溶液中酚羟基和溶剂分子之间形成氢键，保护酚羟基不被氧化，提高了地骨皮乙素和地骨皮甲素的稳定性。该方法充分保证了泻白散中的各味药材成分的更多保留及制备工艺的稳定性。
(3)本发明提供了泻白散的指纹图谱，从整体上评价泻白散的内在化学物质的种类、传递规律及其含量。
(6)本发明可保证临床用药的安全、有效和稳定，也为泻白散复方制剂后续的制备工艺研究、质量标准建立及稳定性考察提供了详实可靠的研究基础。
附图说明
图1显示为本发明中泻白散的标准指纹图谱，其中，6：桑皮苷A，7：绿原酸，9：地骨皮乙素，10：地骨皮甲素，16：甘草苷，18：甘草素，19：甘草酸铵。
图2显示为本发明中泻白散指纹图谱有关精密度实验的色谱图。
图3显示为本发明中泻白散指纹图谱有关稳定性实验的色谱图。
图4显示为本发明中泻白散指纹图谱有关重复性实验的色谱图。
图5显示为本发明中地骨皮乙素、地骨皮甲素专属性的高效液相色谱图A、B、C，其中，图A显示为地骨皮乙素对照品、地骨皮甲素对照品的HPLC图；图B显示为地骨皮阴性的HPLC图；图C显示为泻白散的HPLC图；上述图A、C中1为地骨皮乙素对照品，2为地骨皮甲素对照品。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
1、试剂
桑皮苷A(批号110098-201810，纯度94.8％，购自安徽西青果生物科技有限公司)、绿原酸(批号110753-201817，纯度96.8％，购自中国食品药品检定研究院)、地骨皮乙素(批号8636，纯度≥98％，购自上海诗丹德标准技术服务有限公司)、地骨皮甲素(批号9327，纯度≥98％，购自上海诗丹德标准技术服务有限公司)、甘草苷(批号111610-201908，纯度95.0％，购自中国食品药品检定研究院)、甘草素(批号wkq18030505，纯度≥98％，购自安徽西青果生物科技有限公司)、甘草酸铵(批号110731-202021，纯度96.2％，购自中国食品药品检定研究院)。
泻白散，由上海上药杏灵科技有限公司提供，批号为202101。桑白皮，由康桥饮片厂提供，批号为20201001。甘草，由宁夏拓明农业开发有限公司提供，批号为20190803。地骨皮由陕西澄城县质胜中药材商贸有限公司提供，批号为20200101。粳米由中粮食品营销有限公司提供，批号为20180522。
甲醇、乙腈、三氟乙酸(色谱级，霍尼韦尔中国有限公司)；碳酸钠、乙酸乙酯、甲醇、醋酸、盐酸、冰醋酸、甲酸、硫酸、乙醇、乙酸(纯度≥98％，国药集团化学试剂有限公司)，超纯水(CascadaIII超纯水系统制备)。
2、仪器
Agilent1260系列高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；12ND型冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；CascadaIII超纯水系统(上海百翱杰生物科技有限公司)。
实施例1
按重量份计，精密称取3.93g炒桑白皮、3.93g地骨皮、0.39g炙甘草、1g粳米混合后加水二小盏为120mL，于药罐加盖浸泡15min后，武火在200℃煮沸10min后，文火在110℃加热煎煮10min，形成“煎七分”，至84mL，在100目的过滤尼龙布过滤提取，获得水提液。
精密量取水提液5mL，放入10mL棕色安瓿瓶中，冻干机中-80℃冷冻12h，在25℃进行干燥48h，即得泻白散样品1#。
实施例2
按重量份计，精密称取3.90g炒桑白皮、3.90g地骨皮、0.39g炙甘草、1g粳米混合后加水二小盏为120mL，于药罐加盖浸泡20min后，武火在190℃煮沸15min后，文火在100℃加热煎煮15min，形成“煎七分”，至84mL，在100目的过滤尼龙布过滤提取，获得水提液。
精密量取水提液5mL，放入10mL棕色安瓿瓶中，冻干机中-60℃冷冻13h，在20℃进行干燥50h，即得泻白散样品2#。
实施例3
1、溶液配制
取实施例1制备的5mL泻白散水提液进行冷冻干燥后的泻白散样品1#，加入5mL水复溶，精密移取1mL至2mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，以10000rpm的速率离心5min，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液1#。
提供对照品溶液，所述对照品溶液包括地桑皮苷A、绿原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、甘草苷、甘草素、甘草酸铵对照品和甲醇。
2、色谱条件
高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测器为光电二极管阵列检测器(DAD)；柱温：25℃；检测波长：273nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；流动相：0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为75min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0-40min，A相：B相体积比为95：5-80：20；
40-60min，A相：B相体积比为80：20-60：40；
60-70min，A相：B相体积比为60：40-2：98。
3、测定
采用上述步骤2中的色谱条件的高效液相色谱法分别测定上述步骤1中供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱。其中，所述供试品溶液的指纹图谱，要与对照品溶液的指纹图谱进行比较，根据对照品溶液的指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出供试品溶液的指纹图谱中的相应特征峰，从而对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位，获得泻白散基准样品的指纹图谱。
实施例4
采用上述实施例3中建立的泻白散基准样品的指纹图谱的检测方法对15批次泻白散进行检测，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱，得到的供试品的指纹图谱数据导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012.1版软件中，以相似度≥0.85为标准，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积、供试品图谱中各共有指纹峰面积与总峰面积的比值。共标定出泻白散的标准指纹图谱包括19个共有指纹峰，其中6号为参照峰(S峰)。
泻白散的标准指纹图谱如图1所示，以各共有峰的保留时间与参照峰的保留时间比值作为相对保留时间，包括19个共有指纹峰，以6号峰为参照峰(S峰，保留时间为1.0000)，其他18个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰(0.3912)、2号峰(0.4301)、3号峰(0.6258)、4号峰(0.7265)、5号峰(0.8065)、7号峰(1.0437)、8号峰(1.1725)、9号峰(1.2216)、10号峰(1.2768)、11号峰(1.3476)、12号峰(1.3871)、13号峰(1.4666)、14号峰(1.5049)、15号峰(1.8411)、16号峰(1.8958)、17号峰(2.3548)、18号峰(2.4704)、19号峰(2.7589)。
泻白散的标准指纹图谱，以各共有峰相对峰面积与参照峰相对峰面积比值作为相对峰面积，包括19个共有指纹峰，以6号峰为参照峰(S峰，相对峰面积为1.000)，其他18个共有指纹峰的相对峰面积分别为：1号峰相对峰面积为0.0629；2号峰相相对峰面积为0.0232；3号峰相对峰面积为0.0362；4号峰相对峰面积为0.0243；5号峰相对峰面积为0.0430；7号峰相对峰面积为0.0231；8号峰相对峰面积为0.1762；9号峰相对峰面积为0.2716；10号峰相对峰面积为0.0383；11号峰相对峰面积为0.0521；12号峰相对峰面积为0.0383；13号峰相对保留时间为0.0612；14号峰相对峰面积为0.0457；15号峰相对峰面积为0.0201；16号峰相对峰面积为0.2314；17号峰相对峰面积为0.0316；18号峰相对峰面积为0.0164；19号峰相对峰面积为0.0185。
将上述的泻白散的标准指纹图谱，根据图1中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出泻白散的标准指纹图谱中的相应特征峰，定位确定7个指纹峰：6号峰为桑皮苷A、7号峰为绿原酸、9号峰为地骨皮乙素、10号峰为地骨皮甲素、16号峰为甘草苷、18号峰为甘草素、19号峰为甘草酸铵。
实施例5
1、精密度
取批号202101的泻白散样品1份，按上述实施例3的色谱条件进样，重复进样6次，记录色谱图，具体结果见图2、表3、4。通过指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)评价相似度。相似度均大于0.95，表明仪器的精密度良好。
表3精密度实验共有峰峰面积-273nm
表4精密度实验相似度实验结果-273nm(n＝6)
2、稳定性
取批号202101的泻白散样品的供试品溶液1份，按上述实施例3的色谱条件分别在0、3、6、9、12、18、24h进样测定，记录色谱图，具体结果见图3、表5、6。通过指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)评价相似度，相似度均大于0.95，表明供试品溶液在24h内稳定。
表5稳定性共有峰峰面积-273nm
表6稳定性相似度实验结果-273nm
3、重复性
取批号202101的泻白散样品，平行6份，按上述实施例3的供试品溶液的制备方法制备样品，按上述实施例3的色谱条件进样，记录色谱图，具体结果见图4、表7、8。通过指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)评价相似度，相似度均大于0.95，结果表明：表明方法的重复性良好。
表7重复性共有峰峰面积-273nm
表8重复性相似度实验结果-273nm
实施例6
1、溶液配制
取实施例1制备的5mL泻白散水提液进行冷冻干燥后的泻白散样品1#，加入5mL水复溶，精密移取1mL至2mL容量瓶中，用含1％(v/v)乙酸的甲醇溶液定容至刻度，以15000rpm的速率离心15min，取上清液，即得供试品溶液1*。
提供对照品溶液，对照品溶液包括地骨皮乙素、地骨皮甲素对照品和溶剂，溶剂为50％甲醇的水溶液(v/v)和0.5％乙酸的水溶液(v/v)，地骨皮乙素对照品的含量范围为：15.1-604μg/mL，地骨皮甲素对照品的含量范围为：2.72-108.8μg/mL。
2、色谱条件
采用高效液相色谱法，分别测定供试品溶液和对照品溶液；采用外标法计算供试品溶液中地骨皮乙素、地骨皮甲素的含量。
高效液相色谱法的色谱条件中，色谱柱：Agilent Zorbax SB-Aq(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长：280nm；流动相：0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈，其中，A相为：0.1％三氟乙酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为45min；梯度洗脱。
如表1所示，梯度洗脱的具体程序为：
0-30min，A相：B相体积比为90：10；
30-31min，A相：B相体积比为90：10-30：70；
31-35min，A相：B相体积比为30-70；
35-36min，A相：B相体积比为30：70-90：10；
36-45min，A相：B相体积比为90：10。高效液相色谱法的色谱条件中，柱温：25℃；流速：1.0mL/min；进样量：5μL。
3、测定
采用外标法，分别移取一系列不同体积的对照品溶液，分别配成一系列不同浓度的溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，绘制标准工作曲线。再将获得的供试品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，并将分析结果代入标准工作曲线，即得供试品溶液中地骨皮乙素、地骨皮甲素的含量。
具体来说，分别移取一系列不同体积的对照品溶液，分别配成一系列不同浓度的溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，获得对照品溶液中地骨皮乙素、地骨皮甲素溶液中含量与峰面积的线性关系，以地骨皮乙素、地骨皮甲素色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到相应标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液采用高效液相色谱仪检测，将获得的供试品溶液中地骨皮乙素、地骨皮甲素的色谱峰面积，分别代入相应标准工作曲线的回归方程中，可得到相应成分的含量。
实施例7
精密称取地骨皮乙素、地骨皮甲素对照品适量，按实施例6中步骤1加溶剂配成一系列不同浓度的对照品溶液。
按实施例6中步骤2的色谱条件，分别精密吸取5μL对照品溶液注入液相色谱仪，以对照品溶液质量(μg)对数值为横坐标，峰面积对数值为纵坐标作图，测定并计算获得地骨皮乙素、地骨皮甲素的标准回归方程、相关系数和线性范围，具体结果见表9。根据表9可知，地骨皮乙素、地骨皮甲素在考察浓度范围内线性关系良好。
表9
实施例8
平行取9份已知浓度的实施例1制备的泻白散样品1#，分别准确加入一定量的地骨皮乙素、地骨皮甲素对照品，按实施例6中步骤1制备获得供试品溶液，并按实施例6中步骤2的色谱条件，分别进样分析，结果见表10。由表10可知，地骨皮乙素的平均加样回收率为101.27％、RSD值为1.02％；地骨皮甲素的平均加样回收率为101.68、RSD值为0.85％。其测定结果的回收率良好，说明本方法的准确度较好。采用冷冻干燥的工艺制备泻白散基准样品，能够避免高温浓缩和干燥对其主要成分的含量的影响，制备的泻白散基准样品的质量可靠稳定。
表10
实施例9
基准样品研究中，干膏得率对后续实验中链接古法提取和现代制药工艺中起到积极作用。取水提液25mL，至蒸发皿中，水浴蒸干后105℃烘箱加热5h，取出，放干燥器中冷却30min，称定重量，继续105℃烘箱加热1h，取出，放干燥器中冷却30min，称定重量，重复上述步骤至连续两次测定的质量差不超过5mg。干膏得率的范围为14.21～21.55％，在均值17.14％的70～130％(12.00～22.28％)之间。在现代制药时，可以通过控制干膏得率来控制产品的质量与古法制剂质量的一致性。
综上所述，本发明提供的一种泻白散基准样品指纹图谱的检测及控制方法，能够获得具有优异质量的泻白散，其质量稳定、不合格率低，还建立了泻白散的高效液相指纹图谱，有利于整体控制泻白散的内在质量，为更好地建立泻白散整体质量控制评价体系提供科学试验依据。所以，本发明克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种泻白散基准样品的指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
1）供试品溶液的制备：将泻白散样品加水溶解，获得的溶解液加有机溶剂定容，离心、过滤，获得供试品溶液；
2）对照品溶液的制备：提供对照品溶液，所述对照品溶液包括桑皮苷A、绿原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、甘草苷、甘草素、甘草酸铵对照品和有机溶剂；
3）测定：采用相同色谱条件的高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行比较，对供试品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位，从而获得泻白散基准样品的指纹图谱；
步骤3）中，所述高效液相色谱法中的色谱柱为Agilent Zorbax SB-Aq C18毛细管色谱色谱柱，250 mm×4.6 mm，5μm；检测器为光电二极管阵列检测器DAD；柱温为25℃；进样量为20μL；流速为1.0mL/min；检测波长为273nm；流动相为0.1%三氟乙酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.1%三氟乙酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为75min；梯度洗脱；
所述梯度洗脱的具体程序为：
0-40min，A相：B相体积比为95：5-80：20；
40-60min，A相：B相体积比为80：20-60：40；
60-70min，A相：B相体积比为60：40-2：98。
2.根据权利要求1所述的一种泻白散基准样品的指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1）或2）中，包括以下条件中任一项或多项：
A1）步骤1）中，所述泻白散样品为冷冻干燥后的泻白散水提液，所述泻白散水提液与水加入的体积之比为1:1-2；
A2）步骤1）或2）中，所述有机溶剂为甲醇；
A3）所述溶解液的取液量与有机溶剂的加入的体积之比为1:1-2；
A4）所述离心条件为：离心时间为5-10min，离心速率为5000-10000rpm。
3.一种泻白散的标准指纹图谱的构建方法，包括：通过采用权利要求1-2任一所述的泻白散基准样品的指纹图谱的检测方法分别对多批泻白散样品进行检测，获得多批泻白散样品的指纹图谱生成共有模式对照图谱，以图谱中均存在的色谱峰作为共有特征峰，确定共有特征峰的相对保留时间、各共有特征峰面积与总峰面积的比值，并根据相对保留时间对泻白散样品的指纹图谱中指标成分进行归属定位，建立泻白散的标准指纹图谱。
4.根据权利要求3所述的一种泻白散的标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述泻白散的标准指纹图谱中，以各共有峰的保留时间与参照峰的保留时间比值作为相对保留时间，包括19个共有指纹峰，以6号峰为参照峰S峰，保留时间为1.0000，其他18个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰0.3912、2号峰0.4301、3号峰0.6258、4号峰0.7265、5号峰0.8065、7号峰1.0437、8号峰1.1725、9号峰1.2216、10号峰1.2768、11号峰1.3476、12号峰1.3871、13号峰1.4666、14号峰1.5049、15号峰1.8411、16号峰1.8958、17号峰2.3548、18号峰2.4704、19号峰2.7589；上述除6号峰外18个共有特征峰的相对保留时间的相对偏差均≤±10%；所述泻白散的标准指纹图谱中共有特征峰面积占总色谱峰面积的百分比≥65%。
5.根据权利要求4所述的一种泻白散的标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述泻白散的标准指纹图谱中，定位确定7个指纹峰：6号峰为桑皮苷A、7号峰为绿原酸、9号峰为地骨皮乙素、10号峰为地骨皮甲素、16号峰为甘草苷、18号峰为甘草素、19号峰为甘草酸铵。
6.一种泻白散的指纹图谱的质量控制方法，包括：采用权利要求1-2任一所述的泻白散基准样品的指纹图谱的检测方法获得泻白散基准样品的指纹图谱，与采用权利要求3-5任一所述的泻白散的标准指纹图谱的构建方法获得的泻白散的标准指纹图谱，进行相似度比较。
7.一种泻白散中地骨皮乙素、地骨皮甲素含量的检测方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：将泻白散样品加水复溶，获得的复溶液加第一溶剂定容，离心，取上清液，获得供试品溶液；
对照品溶液的制备：提供对照品溶液，所述对照品溶液包括地骨皮乙素对照品、地骨皮甲素对照品和第二溶剂；
测定：采用高效液相色谱法，分别测定步骤A）的供试品溶液和步骤B）的对照品溶液；采用外标法计算供试品溶液中地骨皮乙素、地骨皮甲素的含量；
所述高效液相色谱法的色谱条件中，色谱柱：Agilent Zorbax SB-Aq毛细管色谱柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；检测波长：275-285 nm；流动相：0.1%三氟乙酸水溶液-乙腈，其中，A相为：0.1%三氟乙酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为45 min；梯度洗脱；
所述梯度洗脱的具体程序为：
0-30min，A相：B相体积比为90：10-90：10；
30-31min，A相：B相体积比为90：10-30：70；
31-35min，A相：B相体积比为30：70-30：70；
35-36min，A相：B相体积比为30：70-90：10；
36-45min，A相：B相体积比为90：10-90：10。
8.根据权利要求7所述的一种泻白散中地骨皮乙素、地骨皮甲素含量的检测方法，其特征在于，步骤A）或B）中，包括以下条件中任一项或多项：
B1）步骤A）中，所述泻白散样品为冷冻干燥后的泻白散水提液，所述泻白散水提液与水加入的体积之比为1:1-2；
B2）步骤A）中，所述复溶液与第一溶剂的加入的体积之比为1:1-2；
B3）步骤A）中，所述第一溶剂为含0.5-2%（v/v）乙酸的甲醇溶液；
B4）步骤A）中，所述离心条件为：离心时间为10-20min；离心速率为10000-20000rpm；
B5）步骤B）中，所述第二溶剂为40-60%甲醇的水溶液和0.4-0.6%乙酸的水溶液。
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