CN104198617A - 同时测定小柴胡颗粒中环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时测定小柴胡颗粒中环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸含量的方法，其特点是，包括如下步骤：(1)制备对照品储备液；(2)制备供试品溶液；(3)高效液相色谱测定：用高效液相色谱仪进行测定；分别进样，按色谱条件测定，以峰面积和对照品体积做校正曲线，得到环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸的回归方程分别为：Y＝242.17X-35.103，R2＝0.9969；Y＝178.38X+97.653,R2＝0.9998；Y＝113.69X+94.29，R2＝0.9987。通过本发明的方法采用超声波提取，RP-HPLC同时测定小建中颗粒中的环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸取得了较好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时测定小柴胡颗粒中环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸含量的方法，是一种环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸含量的高效液相色谱测定法。
背景技术
小柴胡颗粒是小柴胡汤原方药材提取加工制成，由柴胡、黄芩、炙甘草、党参、制半夏、生姜和大枣组成，具有解表散热、疏肝和胃的功能。现代药理研究表明，小柴胡汤具有广泛的药效,该方有较好的解热作用,能抑制发热动物体温的升高，体外可抑制多种细菌生长，对肝脏、胰脏、肺脏和胃肠功能有调节和保护作用,在临床上有广泛的应用。
环磷酸腺苷(cAMP)是大枣的主要有效成分，是核苷酸的衍生物，为蛋白激酶致活剂，它是生物界普遍存在的一种生物活性物质，一般含量极低，据报道，大枣成熟果肉中cAMP含量为10-300nmol/g，是所有已测植物材料中最高的，为一般动植物材料环磷酸腺苷含量的数千至万倍，颇具有开发潜力。cAMP具有第二信使的作用，参与广泛的生理生化过程的调节，临床医学研究证明cAMP能舒张平滑肌、扩张血管、改善肝功能、激活蛋白，此外，环磷酸腺苷还对心肌梗塞、冠心病、心源性休克、牛皮鲜等疾病有显著疗效。
甘草酸作为药用甘草的主要成分具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、增强免疫功能、诱生干扰素等多种生物活性，用于肝病的治疗，可使症状、肝功能及组织学明显改善，且疗效确切，是甘草的重要控制指标。随着研究的深入，甘草酸类的其他作用也正得到逐步开发。
黄芩苷是从黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有显著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、抗变态及解痉作用，并且具有较强的抗癌反应等生理效能，在临床医学已占有重要地位。
小柴胡颗粒是传统中药，主要由柴胡、黄芩、甘草、大枣、姜半夏、党参和生姜七味药材制成，已应用于临床多年，在2010版《中国药典》中，主要以黄芩苷作为其评价指标，除此之外，目前研究较多的是小柴胡颗粒中甘草酸和柴胡皂苷a的测定，而大枣也是小柴胡颗粒的主要组成，但未见对其主要成分环磷酸腺苷的含量测定的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、专属性强的同时测定小柴胡颗粒中环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸含量的方法，能够快速、准确的测定它们各自的含量。
一种同时测定小柴胡颗粒中环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸含量的方法，其特别之处在于，包括如下步骤：
(1)制备对照品储备液：
分别精密称取环磷酸腺苷、甘草酸和黄芩苷对照品各0.0020g，首先用50％甲醇(V:V)溶解，再转移至10mL容量瓶中，然后用50％甲醇(V:V)定容至刻度，摇匀，分别配制成三个0.20mg/mL的对照品溶液，分别记为1号样品、2号样品、3号样品；
(2)制备供试品溶液：
将小柴胡颗粒研磨至粉末后，过80目筛，准确称取5.000g至锥形瓶内，加入50mL的50％的甲醇(V:V)摇匀，放入数控超声波清洗器内超声30min，离心5min，用定性滤纸过滤，取上清液，用50％的甲醇(V:V)定容至50mL，用0.45um的定性滤纸过滤后，制成供试品溶液；
(3)高效液相色谱测定：
用高效液相色谱仪进行测定；依次分别从步骤(1)得到的1号样品吸取0.1ul、0.3ul、1ul、2.5ul、5ul、10ul，2号样品吸取1ul、2.5ul、5ul、10ul、30ul、50ul，3号样品吸取1ul、2.5ul、5ul、10ul、20ul、30ul，分别进样，按色谱条件测定，以峰面积和对照品体积做校正曲线，Y代表峰面积，X代表体积，R代表相关系数，得到环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸的回归方程分别为：Y＝242.17X-35.103，R2＝0.9969；Y＝178.38X+97.653,R2＝0.9998；Y＝113.69X+94.29，R2＝0.9987。
步骤(2)中用数控超声波清洗器进行超声是在200W，40kHz，30℃的条件下。
步骤(2)中离心是在2000转/分钟条件下进行的。
步骤(3)中按照如下色谱条件进行测定：色谱柱：Zorbax TC-C18柱(5μm，150mm×4.6mm)，流动相：甲醇(A)：0.01MKH2PO4(B)(10：90)(0min)—A：B(10：90)(12min)—A：B(70：30)(17min)—A：B(10：90)(30min)；检测波长：250nm；流速：1.0mL/min；进样量：50μL；柱温：30℃。
经过试用证明，通过本发明的方法采用超声波提取，RP-HPLC同时测定小建中颗粒中的环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸取得了较好的效果，证明该方法可行，该方法为小柴胡颗粒的质量控制提供了参考。采用本发明的方法可以有效测定小柴胡颗粒中环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸的含量，该方法准确度和灵敏度高，重现性好。
附图说明
图1为本发明中混合标品的色谱图；
图2为本发明中实际样品测定色谱图(黄芩苷、甘草酸)；
图3为本发明中实际样品测定色谱图(环磷酸腺苷)。
具体实施方式
本发明方法采用超声波提取，高效液相色谱进行同时测定，主要依据环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸的最大吸收峰确定了紫外检测波长，依据它们的极性不同采用流动相梯度洗脱，能够在短时间内达到环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸同时很好地分离。
具体通过以下措施来实现：环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸的高效液相色谱含量同时测定，采用紫外检测器，检测波长230-270nm。其色谱条件中固定相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用甲醇-磷酸二氢钾体系。
实施例1：
1.1仪器和材料：
AGILENT 1100高效液相色谱仪，AL204型电子天平，101A-1E型电热鼓风干燥箱，TDL80-2B型台式离心机，KQ-250DE型数控超声波清洗器，SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵。
1.2药品与试剂：
甲醇、磷酸二氢钾(分析纯)，环磷酸腺苷、黄芩苷、甘草酸对照品(中国药品生物制品鉴定所)，小柴胡颗粒(云南白药集团股份有限公司)，实验室用水为超纯水。
1.3对照品储备液：
分别精密称取环磷酸腺苷、甘草酸和黄芩苷对照品各0.0020g，用50％(V:V，下同)甲醇溶解，转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，分别配制成0.20mg/mL的对照品溶液，分别记为1号、2号、3号样品。
2方法：
2.1色谱条件：
色谱柱：Zorbax TC-C18柱(5μm，150mm×4.6mm)，流动相：甲醇(A)：0.01MKH2PO4(B)(10：90)(0min)—A：B(10：90)(12min)—A：B(70：30)(17min)—A：B(10：90)(30min)；检测波长：250nm；流速：1.0mL/min；进样量：50μL；柱温：30℃。
2.2供试品前处理方法：
将小柴胡颗粒研磨至粉末，过80目筛，准确称取5.000g至锥形瓶内，加入50mL的50％的甲醇摇匀，放入数控超声波清洗器内超声30min，过滤，离心，用50％的甲醇定容至50mL，用0.45um过滤后，制成供试品溶液，供测定。
2.3线性范围：
依次分别从1.3项下的1号(样品)吸取0.1ul、0.3ul、1ul、2.5ul、5ul、10ul，2号吸取1ul、2.5ul、5ul、10ul、30ul、50ul，3号吸取1ul、2.5ul、5ul、10ul、20ul、30ul，分别进样，按2.1色谱条件测定，以峰面积和对照品体积做校正曲线，Y代表峰面积，X代表体积，得到环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸的回归方程分别为：Y＝242.17X-35.103，R2＝0.9969；Y＝178.38X+97.653,R2＝0.9998；Y＝113.69X+94.29，R2＝0.9987。
上述实施例中未提及的部分可以参见发明内容。
2.4方法学考察：
2.4.1精密性实验：
对一定浓度的混合标品进行精密性试验，重复进样3次，三种混合标品(浓度为0.20mg/mL)峰面积的RSD值均小于1.0％，说明仪器具有较好的精密性。
2.9.2重复性试验：
按2.2供试品前处理方法制备小柴胡颗粒(云南白药集团股份有限公司)供试品溶液3份，标号，进样，所得数据如表2-1所示，说明此样品前处理方法具有较好的重复性。
表2-1 重复性实验
2.9.3稳定性试验：
取供试品1做稳定性实验，经过0h、6h、12h后，测得结果分别如表2-2所示，由此可见，供试品在12h内基本稳定。
表2-2 稳定性实验
2.9.4加标回收率：
分别称取3份已测过的小柴胡颗粒(环磷酸腺苷含量0.0180mg/g，黄芩苷含量4.82mg/g，甘草酸含量0.855mg/g)各5.0g，相应地加入一定量的环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸标准品，按2.2样品制备方法提取，测定加标后的样品中的环磷酸腺苷和甘草酸含量，计算加标回收性，结果如表2-3、2-4、2-5所示：
表2-3 环磷酸腺苷回收性试验
表2-4 黄芩苷回收性试验
表2-5 甘草酸回收性试验
3样品测定结果：
按2.2样品前处理方法提取云南白药集团股份有限公司生产的小柴胡颗粒，制得供试品溶液各3份，各取50μL进样，测定，由标准曲线方程计算样品中环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸含量如表3-1所示，环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸的标准品色谱图及小柴胡颗粒的色谱图如附图1、图2、图3所示。
表3-1 小柴胡颗粒中环磷酸腺苷、黄芩苷、和甘草酸的含量
由以上方法学考察结果看出，采用超声波提取，RP-HPLC同时测定小建中颗粒中的环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸取得了较好的实验效果，证明此方法可行，为小建中颗粒的质量控制提供一定的参考价值。
Claims (4)
1.一种同时测定小柴胡颗粒中环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备对照品储备液：
分别精密称取环磷酸腺苷、甘草酸和黄芩苷对照品各0.0020g，首先用50％甲醇(V:V)溶解，再转移至10mL容量瓶中，然后用50％甲醇(V:V)定容至刻度，摇匀，分别配制成三个0.20mg/mL的对照品溶液，分别记为1号样品、2号样品、3号样品；
(2)制备供试品溶液：
将小柴胡颗粒研磨至粉末后，过80目筛，准确称取5.000g至锥形瓶内，加入50mL的50％的甲醇(V:V)摇匀，放入数控超声波清洗器内超声30min，离心5min，用定性滤纸过滤，取上清液，用50％的甲醇(V:V)定容至50mL，用0.45um的定性滤纸过滤后，制成供试品溶液；
(3)高效液相色谱测定：
用高效液相色谱仪进行测定；依次分别从步骤(1)得到的1号样品吸取0.1ul、0.3ul、1ul、2.5ul、5ul、10ul，2号样品吸取1ul、2.5ul、5ul、10ul、30ul、50ul，3号样品吸取1ul、2.5ul、5ul、10ul、20ul、30ul，分别进样，按色谱条件测定，以峰面积和对照品体积做校正曲线，Y代表峰面积，X代表体积，R代表相关系数，得到环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸的回归方程分别为：Y＝242.17X-35.103，R2＝0.9969；Y＝178.38X+97.653,R2＝0.9998；Y＝113.69X+94.29，R2＝0.9987。
2.如权利要求1所述的同时测定小柴胡颗粒中环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸含量的方法，其特征在于：步骤(2)中用数控超声波清洗器进行超声是在200W，40kHz，30℃的条件下。
3.如权利要求1所述的同时测定小柴胡颗粒中环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸含量的方法，其特征在于：步骤(2)中离心是在2000转/分钟条件下进行的。
4.如权利要求1所述的同时测定小柴胡颗粒中环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸含量的方法，其特征在于：步骤(3)中按照如下色谱条件进行测定：色谱柱：Zorbax TC-C18柱(5μm，150mm×4.6mm)，流动相：甲醇(A)：0.01MKH2PO4(B)(10：90)(0min)—A：B(10：90)(12min)—A：B(70：30)(17min)—A：B(10：90)(30min)；检测波长：250nm；流速：1.0mL/min；进样量：50μL；柱温：30℃。
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