CN112326846A - Hplc法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法，包括，分别制备供试品溶液和对照品溶液后各量取10μl，注入高效液相色谱仪中，检测后按外标法计算得到黄芩苷含量，色谱柱型号为岛津C18，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相A为甲醇，流动相B为0.08‑0.12％磷酸水溶液，以A：B＝45‑55：55‑45(v/v)等度洗脱。本发明所提供的检测方法耐用性良好，基线噪音小，灵敏度高；峰形好，拖尾因子小；检测过程无需其他复杂前处理，可避免不必要的干扰；柱温较低，色谱条件温和，操作便捷；具有适用浓度范围广、检测速度快、灵敏度高、精确度高和重复性好等优点，检测效果优异。
Description
技术领域
本发明涉及药物活性成分的检测技术领域，更具体地，涉及HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法。
背景技术
小儿柴桂退热颗粒的主要成分包括柴胡、桂枝、葛根、浮萍、黄芩、白芍和蝉蜕，具有发汗解表和清里退热功效，主要用于小儿外感发热，具有较好的效果，因其疗效显著、副作用小，受到医务工作者及患者的好评。
现有小儿柴桂退热颗粒的质量标准是采用高效液相色谱法检测葛根素的含量；然而，却忽视了黄芩苷含量的检测，黄芩苷具有泻火和除湿等功效，其含量与小儿柴桂退热颗粒治疗小儿外感发热的效果密切相关。
综上所述，如何准确定量检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量是本领域技术人员亟需解决的关键技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法，该方法具有适用浓度范围广、检测速度快、灵敏度高、精确度高和重复性好等优点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法，包括以下步骤：
S1、供试品溶液的制备：称取小儿柴桂退热颗粒溶解于甲醇水溶液中，超声处理后过滤，取滤液即得供试品溶液；
S2、对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品，加入甲醇水溶液中，搅匀后定容，即得已知浓度的对照品溶液；
S3、HPLC法测定：分别取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中，检测后按外标法计算得到黄芩苷含量。
具体地，步骤S3中，色谱柱型号为岛津C18，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料。
本发明研究发现，采用上述型号的色谱柱能够较好地实现小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷与其他成分的分离，峰形好，拖尾因子小；该型号的色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，可实现卓越性和耐久性，并且获得良好的色谱峰形。
具体地，步骤S3中，流动相A为甲醇，流动相B为0.08-0.12％磷酸水溶液，以A：B＝45-55：55-45(v/v)等度洗脱。
本发明研究发现，采用现有方法的常规流动相，色谱出峰极易拖尾，峰形较差，对准确定量造成一定的难度；进一步地研究发现，采用本发明流动相能够改善黄芩苷的峰形，减少拖尾效应，从而有效地将黄芩苷与其他成分进行分离，达到更加准确定量的目的。
在一个优选实施例中，在HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法中，所述流动相A为甲醇，所述流动相B为0.10％磷酸水溶液，并加入1.2％的三乙胺，以A：B＝50：50(v/v)等度洗脱。
进一步地，在上述技术方案中，在HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法中，柱温为35-48℃，进一步优选为42.5℃。
进一步地，在上述技术方案中，在HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法中，流速为0.8-1.2ml/min，进一步优选为1.0ml/min。
进一步地，在上述技术方案中，在HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法中，检测波长为280nm。
本发明研究发现，采用上述检测条件对于小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的检测更有针对性，检测效果更佳。
再进一步地，在上述技术方案中，在HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法中，步骤S2中，所述对照品溶液的浓度为60.8685μg/ml。
优选地，在一个具体实施方式中，所述对照品溶液的制备方法具体包括，
精密称取纯度为93.5wt％的黄芩苷对照品6.51mg，置于100ml棕色容量瓶中，加70％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀后即得。
再进一步地，在上述技术方案中，在HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法中，步骤S1中，将所述小儿柴桂退热颗粒溶解于70％甲醇水溶液中，常温下超声处理。
优选地，在一个具体实施方式中，所述供试品溶液的制备方法具体包括，
精密称取小儿柴桂退热颗粒1.0g，置于具有密封塞的锥形瓶中，加入50ml 70％甲醇水溶液，密封后精密称重，超声处理后放置冷却，用70％甲醇水溶液补足减失重量，摇匀后用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液。
具体地，在一个具体实施方式中，在供试品溶液的制备过程中，所述超声处理的具体工艺条件为：
超声频率为50KHz，超声功率为250W，超声处理时间为25-40min。
又进一步地，在上述技术方案中，在HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法中，步骤S3中，所述高效液相色谱仪的检测器为二极管阵列检测器。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所提供的检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法通过优化流动相，并采用等度洗脱的方法，耐用性良好，基线噪音小，检测方法灵敏度高；
(2)本发明所提供的检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法采用特定型号的色谱柱，并选用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，能够较好地实现小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷与其他成分的分离，峰形好，拖尾因子小，可实现卓越性和耐久性，并且获得良好的色谱峰形；
(3)本发明所提供的检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法直接采用制剂成品颗粒，无需其他复杂前处理，可以有效地避免样品处理过程中对黄芩苷的消耗，以及避免样品处理过程中其他不稳定成分产生的干扰；
(4)本发明所提供的检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法所选用的柱温较低，能有效延长色谱柱的使用寿命，且色谱条件温和，操作便捷；
(5)本发明所提供的检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法具有适用浓度范围广、检测速度快、灵敏度高、精确度高和重复性好等优点，检测效果优异。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下实施例，仅用于说明本发明的内容，但不用来限制本发明的范围。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都应属于本发明的保护范围。
1、材料
黄芩苷对照品：中国药品生物制品检定所，批号：110715-201619，纯度：93.5％。
小儿柴桂退热颗粒：葵花药业集团(襄阳)隆中有限公司，批号：180101。
甲醇为色谱纯(阿拉丁试剂有限公司，中国)，磷酸和三乙胺为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，水为超纯水。
2、仪器
岛津液相色谱仪(包括，全自动进样器，柱温箱，并配有岛津数据工作站，检测器为二极管阵列检测器)。
普析紫外分光光度仪；
AB265-S型电子天平(梅特勒-托利多公司，十万分之一)。
3、方法
(1)供试品溶液的配制：
精密称取小儿柴桂退热颗粒1.0g，置于具有密封塞的锥形瓶中，加入50ml 70％甲醇水溶液，密封后精密称重，超声处理后放置冷却，用70％甲醇水溶液补足减失重量，摇匀后用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液即得。
其中，超声处理的具体工艺条件为：频率50KHz，功率250W，处理时间25-40min。
(2)对照品溶液的配制：
精密称取纯度为93.5wt％的黄芩苷对照品6.51mg，置于100ml的棕色容量瓶中，加70％甲醇水溶液，搅拌溶解并稀释至刻度，摇匀后即得浓度为60.8685μg/ml的对照品溶液。
(3)阴性对照溶液的配制：
取不加黄芩药材的阴性样品1.0g，同供试品溶液的配制方法配制得到阴性对照溶液。
实施例1HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法
色谱条件：
色谱柱型号为岛津C18(4.6*250mm，5μm)，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料。
所述流动相A为甲醇，所述流动相B为0.10％磷酸水溶液，并加入1.2％的三乙胺，以A：B＝50：50(v/v)等度洗脱。
流速为1.0ml/min。
检测波长为280nm。
柱温为42.5℃。
进样量为10μl。
分别取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中，按照上述色谱条件进行检测，检测后按外标法以峰面积计算得到供试品黄芩苷含量。
按相同方法，对多批次小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷的含量进行检测。
检测结果如下表1所示。
表1多批次小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷的含量测定结果
此外，检测结果显示，黄芩苷与其他成分的分离度均大于1.6，拖尾因子小于1.5。
实施例2HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法
色谱条件和检测方法均与实施例1相似，区别仅在于，所述流动相A为甲醇，所述流动相B为0.12％磷酸水溶液，以A：B＝45：55(v/v)等度洗脱；柱温为38℃；流速为0.8ml/min。
检测结果显示，黄芩苷与其他成分的分离度均大于1.5，拖尾因子小于1.5。
对比例1 HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法
色谱条件和检测方法均与实施例1相似，区别仅在于，将色谱柱替换为其他厂商(北京迪科马科技有限公司)普通C18色谱柱。
分别取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中，按照上述色谱条件进行检测。
检测结果显示，黄芩苷峰形不好，拖尾严重，拖尾因子均大于1.5，表明该方法的准确定量性较差。
对比例2 HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法
色谱条件和检测方法均与实施例1相似，区别仅在于，采用现有方法的常规流动相；具体地，流动相A为乙腈，流动相B为0.2％甲酸水溶液，以A：B＝50：50(v/v)等度洗脱。
分别取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中，按照上述色谱条件进行检测。
检测结果显示，黄芩苷峰形相比于对比例1要好，但如果色谱条件没有达到最佳条件，其拖尾因子也大于1.5，表明该对比例的准确定量性低于实施例1和2中的方法。
方法学验证
如无特殊说明，以下色谱条件与实施例1相同。
1、最大吸收波长的测定
精密称取黄芩苷对照品6.51mg(批号：110715-201619，纯度：93.5％)，置于100ml棕色量瓶中，加70％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，再精密量取2ml置10ml棕色量瓶中，加70％甲醇水溶液稀释至刻度，制得12.1737μg/ml的溶液，摇匀即得。
用紫外分光光度计依法测定黄芩苷在280nm处有最大吸收。
2、专属性
分别取供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中，进行检测。
结果表明，阴性对照溶液在与对照品溶液峰相应的位置上，无干扰峰出现，说明小儿柴桂退热颗粒的处方中其它味药对测定黄芩苷含量的结果无影响；此外，黄芩苷的保留时间为9.217min，出峰时间合理，主峰的峰形良好。
3、精密度
精密量取上述供试品溶液，加水稀释，摇匀，平行配制6份，分别精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，并计算主峰峰面积的RSD值。结果如下表2所示。
表2精密度实验的测定结果
结果显示，主峰面积的RSD值为0.17％，小于2.0％，表明其精密度良好。
4、线性与范围
精密称取黄芩苷对照品(批号：110715-201619，纯度：93.5％)，配置得到不同浓度(0.121737μg/ml-1.21737μg/ml)的溶液，并分别精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算其回归方程。结果如下表3所示。
表3线性实验的测定结果
表3的结果显示，在上述色谱条件下，黄芩苷浓度在0.121737μg/ml-1.21737μg/ml范围内，相关系数为1.0，与峰面积呈良好的线性关系。
5、重复性
按上述检测方法，对同一批样品共6份进行检测，求得相对标准偏差。
结果如下表4所示。
表4重复性实验的测定结果
表4的结果显示，平均含量为5.28mg/g，RSD值为0.44％，小于2.0％，表明该方法重复性良好。
6、回收率
精密称取已知含量(5.28mg/g))的小儿柴桂退热颗粒样品约0.5g，共取6份，分别加入一定量的黄芩苷对照品，置于50ml棕色量瓶中，加70％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，按供试品制备方法制成供试品溶液，并按含量测定方法进行测定，计算回收率。
结果如下表5所示。
表5的结果显示，6次平均回收率为97.5％，RSD＝0.83％，说明该测定方法测定结果准确。
表5回收率实验的测定结果
7、溶液稳定性
分别精密称取小儿柴桂退热颗粒样品1.0g，按供试品溶液的配制方法配置后，于室温下放置0h、2h、4h、6h、8h和10h，精密吸取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，考察主峰峰面积变化情况。
结果如下表6所示。
表6溶液稳定性实验的测定结果
表6的结果显示，本品供试品溶液在室温下放置10小时，黄芩苷峰面积的RSD值为0.95％，小于2.0％，说明本品溶液在室温条件下10小时内稳定性良好。
8、耐用性
分别在标准条件，改变流速为0.8、1.0和1.2ml/min，改变柱温为35、40、42.5、45和48℃的条件下，样品的含量测定结果无明显差异，本方法的耐用性良好。
综上所述，按上述方法检测小儿柴桂退热颗粒样品中黄芩苷的含量，结果表明，其平均含量为5.28mg/g，成品标准中规定本品的含量不得低于4.0mg/g，以作为小儿柴桂退热颗粒黄芩苷考察的依据。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法，其特征在于，
包括以下步骤：
S1、供试品溶液的制备：称取小儿柴桂退热颗粒溶解于甲醇水溶液中，超声处理后过滤，取滤液即得供试品溶液；
S2、对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品，加入甲醇水溶液中，搅匀后定容，即得已知浓度的对照品溶液；
S3、HPLC法测定：分别取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中，检测后按外标法计算得到黄芩苷含量；
步骤S3中，
色谱柱型号为岛津C18，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；
流动相A为甲醇，流动相B为0.08-0.12％磷酸水溶液，以A：B＝45-55：55-45(v/v)等度洗脱。
2.根据权利要求1所述的HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法，其特征在于，
所述流动相A为甲醇，所述流动相B为0.10％磷酸水溶液，并加入1.2％的三乙胺，以A：B＝50：50(v/v)等度洗脱。
3.根据权利要求1或2所述的HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法，其特征在于，
柱温为35-48℃，优选为42.5℃。
4.根据权利要求1或2所述的HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法，其特征在于，
流速为0.8-1.2ml/min，优选为1.0ml/min。
5.根据权利要求1或2所述的HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法，其特征在于，
检测波长为280nm。
6.根据权利要求1-5任一项所述的HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法，其特征在于，
步骤S2中，
所述对照品溶液的浓度为60.8685μg/ml；
优选地，所述对照品溶液的制备方法具体包括，精密称取纯度为93.5wt％的黄芩苷对照品6.51mg，置于100ml棕色容量瓶中，加70％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀后即得。
7.根据权利要求1-5任一项所述的HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法，其特征在于，
步骤S1中，
将所述小儿柴桂退热颗粒溶解于70％甲醇水溶液中，常温下超声处理；
优选地，所述供试品溶液的制备方法具体包括，精密称取小儿柴桂退热颗粒1.0g，置于具有密封塞的锥形瓶中，加入50ml70％甲醇水溶液，密封后精密称重，超声处理后放置冷却，用70％甲醇水溶液补足减失重量，摇匀后用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液。
8.根据权利要求7所述的HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法，其特征在于，
所述超声处理的具体工艺条件为：频率50KHz，功率250W，处理时间30min。
9.根据权利要求1-8任一项所述的HPLC法检测小儿柴桂退热颗粒中黄芩苷含量的方法，其特征在于，
步骤S3中，
所述高效液相色谱仪的检测器为二极管阵列检测器。
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