CN110940748B - 一种小儿金青颗粒的hplc指纹图谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小儿金青颗粒的HPLC指纹图谱检测方法。本发明对测定指纹图谱的仪器、色谱柱、流动相、检测波长等条件进行了优选，建立了液相指纹图谱测定条件并进行了方法学考察，根据多批次中试样品建立了小儿金青颗粒的标准指纹图谱，并确定了14个共有峰，并对相关共有峰进行了药材归属和成分指认。本发明方法能有效地表征小儿金青颗粒的质量，有利于指导本品中试试制及商业化生产，全面监控药品质量，确保临床用药的安全性和有效性。本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

一种小儿金青颗粒的HPLC指纹图谱检测方法
技术领域
本发明属于中药检测分析领域，具体涉及一种小儿金青颗粒的HPLC指纹图谱分析方法的建立及其指纹图谱。
背景技术
小儿金青颗粒为健民药业集团股份有限公司正在研发的中药六类新药，其处方来源于名老中医的临床经验方，由青黛、金果榄、青果、蒲公英、绿茶、胖大海六味药材组成，经现代工艺研制而成，具有清热解毒、利咽止痛的功效，用于外感火毒热邪蕴结壅遏上焦引起的小儿咽喉红肿疼痛、溃烂，兼口舌生疮等，小儿咽炎、喉炎、扁桃体炎、上呼吸道感染及疱疹性咽峡炎见上述证候者。
指纹图谱作为从整体上对中药进行质量控制的一种技术，自2010版开始已载入中国药典，其优势比起单一组分甚至多组分定性定量更加明显，特别是针对药物来源广、成分复杂、物质基础不明确的中药复方制剂，指纹图谱可实现对中药内在质量的综合评价和对其整体物质的有效控制，是目前中药及其制剂质量控制的有效手段之一。为了更好的监控和评价本品质量，指导后续的工艺研究、中试试制及规范化生产，本发明提供一种小儿金青颗粒的液相指纹图谱分析方法。
发明内容
本发明的目的在于建立一种小儿金青颗粒的HPLC指纹图谱检测分析方法，从而达到从整体上全面表征和评价本品质量，指导本品研制开发和工业化生产。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种小儿金青颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，所述小儿金青颗粒由以下重量份数的原料制成：青黛20-40份、金果榄60-120份、青果60-120份、蒲公英60-120份、绿茶叶40-80份、胖大海20-40份，该检测方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：将待测小儿金青颗粒研细，取0.5-5重量份，加入有机溶剂5-50体积份进行提取，提取液用微孔滤膜过滤，取续滤液；
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取没食子酸、靛玉红、古伦宾、咖啡酸对照品，用甲醇配制成每1体积份分别含没食子酸、靛玉红、古伦宾、咖啡酸0.00005-0.0015重量份的各单一对照品溶液；
(3)分别精密吸取供试品溶液和各对照品溶液5-20μl，用高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为220-270nm，所述高效液相色谱仪的固定相为C18色谱柱，流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸水溶液，采用梯度洗脱，流速为0.5-2ml/min，柱温为25～35℃，理论板数不低于3000；
(4)分别记录供试品溶液和对照品溶液0～95min的色谱图，利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液和对照品溶液的色谱图分别经过数据导入、多点矫正和数据匹配，得到小儿金青颗粒的标准指纹图谱，并进行相似度评价；
所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。
优选地，所述有机溶剂为甲醇。
优选地，所述提取的方法为超声。
优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.45um。
优选地，所述紫外检测器的设定检测波长为220nm。
优选地，所述梯度洗脱中，各时间段及流动相B的体积比变化分别为：0～20min，流动相B 90～75％；20～30min，流动相B 75～65％；30～60min，流动相B 65～40％；60～80min，流动相B 40～10％；80～93min，流动相B10％；93～95min，流动相B10～90％。具体洗脱程序见表1。
表1HPLC梯度洗脱程序
时间min 流动相A(％) 流动相B(％)
0～20 10-25 90-75
20～30 25-35 75-65
30～60 35-60 65-40
60～80 60-90 40-10
80～93 90 10
93～95 90-10 10-90
优选地，所述柱温为25℃。
所述的标准指纹图谱有14个共有峰，其中1号峰归属于青果﹑绿茶，2号峰归属于绿茶，3号峰归属于青果，4、5、6、7、8号峰归属于绿茶，9号峰归属于金橄榄，10号峰归属于蒲公英，11、13、14号归属于青黛，12号峰归属于青黛、胖大海、蒲公英，并经指认其中1号峰为没食子酸、5号峰为咖啡酸、9号峰为古伦宾、11号峰为靛玉红。
优选地，与标准指纹图谱对比分析，以相似度大于0.880的判定为合格品。
本发明的有益效果是：
本发明研究建立了新药小儿金青颗粒的一种液相指纹图谱的检测分析方法及其标准液相指纹图谱，确立了14个共有特征峰，并进行了药材归属，且指认了其中4个成分，并以相似度大于0.880为合格品的判定依据，实现了从整体上对小儿金青颗粒质量的监控和评价，为本品后续的开发研制及工业化生产提供技术手段和评价方法。另外，本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、费用低等优点。
附图说明
图1是最佳条件制备的液相色谱图。
图2是30％甲醇提取后的液相色谱图。
图3是乙醇提取后的液相色谱图。
图4是50％乙醇提取后的液相色谱图。
图5是乙酸乙酯提取后的液相色谱图。
图6是波长为240nm时所得的液相指纹图谱。
图7是波长为270nm时所得的液相指纹图谱。
图8是波长为300nm时所得的液相指纹图谱。
图9是流动相梯度洗脱条件1时所得的液相指纹图谱。
图10是流动相梯度洗脱条件2时所得的液相指纹图谱。
图11是柱温为30℃时所得的液相指纹图谱。
图12是柱温为35℃时所得的液相指纹图谱。
图13是15批样品的指纹图谱叠加图。
图14是标准对照指纹图谱。
图15是样品指纹图谱与各药材色谱图对比归属图。
图16是样品指纹图谱与各对照品色谱图对比指认图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。
仪器与试药：
岛津LC-2040C CN型液相色谱仪，包括包括二极管阵列检测器、Labsolutions版工作站；PGJ-10/20-AS型超纯水仪(武汉品冠仪器设备有限公司)；UA800-DH数字式超声波清洗仪(功率800w，频率40kHz，上海欧河机械设备有限公司)；Mettler ME203E、MettlerME104E、Mettler TOLEDO XPE105电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。
没食子酸对照品(纯度90.8％，批号110831-201605)﹑靛玉红对照品(纯度99.6％，批号110717-201805)﹑古伦宾对照品(纯度99.8％，批号11837-20703)﹑咖啡酸对照品(纯度99.7％，批号110885-201703)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇﹑乙醇﹑乙酸乙酯﹑磷酸均为分析纯。小儿金青颗粒为健民药业集团研发中试试制样品，共15批(批号：180301﹑180302、180303﹑180601﹑180602﹑180901﹑180902﹑180903﹑181001﹑181002﹑190301﹑190302﹑190701、190702、190801)，以S1-S15表示。小儿金青颗粒的处方和制备工艺如下：
青黛30g、金果榄85g、青果85g、蒲公英85g、绿茶叶60g、胖大海30g
金果榄、青果、蒲公英、绿茶叶、胖大海五味药材按照处方量浸泡半小时后，水煮提取3次，每次10倍量水提取2h，提取液合并浓缩至相对密度约为1.2的浸膏后，与青黛粉末、糊精、蔗糖粉混合制粒，即制得本颗粒剂。
实施例1样品提取溶剂的考察
分别考察甲醇﹑30％甲醇﹑乙醇﹑50％乙醇﹑乙酸乙酯5种不同的提取溶剂。
取小儿金青颗粒适量(批号：190702)，研细，混匀，精密称取约1g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇5ml，密塞，称定重量并记录，超声处理30min，取出，放冷，称重，并用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)，滤过，取续滤液，测定液相色谱图，见图1。
取小儿金青颗粒适量(批号：190702)，研细，混匀，精密称取约1g，置于具塞锥形瓶中，加入30％甲醇5ml，密塞，称定重量并记录，超声处理30min，取出，放冷，称重，并用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)，滤过，取续滤液，测定液相色谱图，见图2。
取小儿金青颗粒适量(批号：190702)，研细，混匀，精密称取约1g，置于具塞锥形瓶中，加入乙醇5ml，密塞，称定重量并记录，超声处理30min，取出，放冷，称重，并用乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)，滤过，取续滤液，测定液相色谱图，见图3。
取小儿金青颗粒适量(批号：190702)，研细，混匀，精密称取约1g，置于具塞锥形瓶中，加入50％乙醇5ml，密塞，称定重量并记录，超声处理30min，取出，放冷，称重，并用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)，滤过，取续滤液，测定液相色谱图，见图4。
取小儿金青颗粒适量(批号：190702)，研细，混匀，精密称取约1g，置于具塞锥形瓶中，加入乙酸乙酯5ml，密塞，称定重量并记录，超声处理30min，取出，放冷，称重，并用乙酸乙酯补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)，滤过，取续滤液，测定液相色谱图，见图5。
色谱条件色谱柱：Agilent TC-C18(2)(250mm×4.6mm，5um)；检测波长220nm；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％(体积)磷酸溶液；梯度洗脱程序见表1；流速为1ml/min，柱温25℃，进样量10ul，理论板数不低于3000。色谱记录时间95min。
通过比较甲醇﹑30％甲醇﹑乙醇﹑50％乙醇﹑乙酸乙酯作为提取溶剂后的色谱图，可以看出，在相同检测条件下，纯甲醇﹑纯乙醇作为提取剂较好，色谱峰个数多，提取率高；其次为30％甲醇、50％乙醇，两者效果基本一致；乙酸乙酯提取的样品色谱图整体效果较差，峰个数少，提取率低。而甲醇提取效果，与乙醇对比，所得主要色谱图峰峰形更好，组分提取率更高，色谱图信息明显，故优选甲醇作为提取溶剂。
实施例2波长的选择
取190702批小儿金果颗粒样品进行试验，分别考察了220、240、270、300nm等不同波长下的色谱图的整体效果，见图1、6、7、8。由所测色谱图知，波长为300nm时(图8)，基线不平，峰形及分离度均较差，大部分组分响应值低；波长为270nm时(图7)，色谱图中基线较平，峰形较佳，但相较220nm、240nm时，峰个数偏少，特别是75min后未出峰；在波长为220nm(图1)、240nm(图6)时，所得色谱图整体效果均较好，所得色谱峰个数基本一致，但考虑到220nm时部分色谱峰的峰形及响应值优于240nm，故综合考虑，优选220nm为指纹图谱的最佳检测波长。
实施例3流动相洗脱程序的优化
经比较、筛选，发现(A)甲醇-(B)0.1％磷酸水溶液为流动相系统时，进行线性梯度洗脱，所得液相色谱图基线较平稳、色谱峰峰形较对称、分离度较好。在此基础上，进一步对该体系梯度洗脱程序进行了优选，具体考察了以下3种梯度洗脱条件：
Figure BDA0002308987880000061
Figure BDA0002308987880000062
Figure BDA0002308987880000063
结果：如图1、9、10所示，图9中，出峰个数少，这可能与大部分组分在该梯度条件下，尚未完全分离有关；图1、10色谱图整体效果基本一致，但条件(3)所需时间少，且峰形较好，故梯度洗脱条件优选(3)。
实施例4柱温考察
取190702批小儿金果颗粒样品进行试验，分别比较了柱温为25℃、30℃、35℃时，样品所测色谱图的整体效果，如图1、11、12所示。结果表明，柱温越高出峰越快，但分离度有所下降，但在三种柱温下，所测色谱图均达到了较好的效果，峰形及峰个数基本保持一致，特别是25℃、30℃整体效果差异不大，而35℃时分离度稍差，特别是在其保留时间23min及40min左右处，经指认为咖啡酸、古伦宾等有效成分，未完全分离。故为了节省能耗，从整体效果考虑，优选柱温为25℃。
实施例5方法学考察
1.重复性试验
取同一批小儿金青颗粒(批号：190702)，按照例1项下确定的方法制备6份供试品溶液，在确立的色谱条件下进行测定，考察重复性。以11号靛玉红色谱峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果表明，各色谱峰的相对保留时间的相对标准偏差均小于0.15％，各色谱峰的相对峰面积的相对标准偏差均小于7.0％，重复性良好。见表2-3。
表2小儿金青颗粒重复性试验各峰相对保留时间
Figure BDA0002308987880000071
Figure BDA0002308987880000081
表3小儿金青颗粒重复性试验各峰相对峰面积
峰号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD％
1 12.161 12.159 12.129 11.594 11.395 11.322 11.793 0.42％
2 0.747 0.733 0.739 0.708 0.700 0.696 0.721 5.43％
3 0.734 0.723 0.727 0.695 0.684 0.682 0.708 1.78％
4 28.145 28.054 27.934 26.631 26.196 25.949 27.152 0.31％
5 8.988 8.972 8.962 8.450 8.286 8.233 8.648 0.50％
6 10.353 10.317 10.309 9.828 9.676 9.623 10.018 0.35％
7 1.597 1.566 1.583 1.519 1.495 1.498 1.543 4.51％
8 1.521 1.557 1.459 1.487 1.598 1.389 1.502 6.60％
9 1.663 1.671 1.574 1.562 1.536 1.532 1.590 6.25％
10 1.026 1.007 1.119 1.007 0.996 0.999 1.026 4.60％
11(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00％
12 0.230 0.230 0.231 0.219 0.216 0.215 0.224 0.43％
13 0.616 0.617 0.617 0.641 0.631 0.626 0.625 1.42％
14 0.468 0.470 0.481 0.521 0.513 0.511 0.494 0.78％
2.精密度试验
取同一份小儿金青颗粒(批号：190702)供试品溶液，连续重复进样6针，考察精密度。以11号靛玉红色谱峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，各共有峰的相对保留时间的相对标准偏差均小于0.2％，相对峰面积的相对标准偏差均小于3.0％，精密性良好。见表4-5。
表4小儿金青颗粒精密度试验各峰相对保留时间
Figure BDA0002308987880000082
Figure BDA0002308987880000091
表5小儿金青颗粒精密度试验各峰相对峰面积
Figure BDA0002308987880000092
Figure BDA0002308987880000101
3.稳定性试验
取同一份小儿金青颗粒(批号：190702)供试品溶液，室温放置，分别于0h﹑4h﹑8h﹑12h﹑24h注入液相色谱仪，以11号靛玉红色谱峰为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，各色谱峰的相对保留时间的相对标准偏差均小于0.4％，各色谱峰的相对峰面积的相对标准偏差均小于5.0％，稳定性良好。见表6-7。
表6小儿金青颗粒稳定性试验各峰相对保留时间
峰号 0h 4h 8h 12h 24h 平均值 RSD％
1 0.118 0.117 0.118 0.118 0.118 0.118 0.27％
2 0.182 0.180 0.181 0.181 0.181 0.182 0.29％
3 0.197 0.196 0.196 0.197 0.197 0.197 0.25％
4 0.331 0.328 0.329 0.329 0.329 0.330 0.33％
5 0.365 0.362 0.363 0.363 0.363 0.364 0.30％
6 0.423 0.423 0.423 0.423 0.423 0.424 0.06％
7 0.460 0.458 0.458 0.458 0.458 0.459 0.17％
8 0.501 0.500 0.500 0.500 0.500 0.501 0.15％
9 0.582 0.580 0.581 0.580 0.580 0.581 0.12％
10 0.597 0.596 0.596 0.595 0.596 0.597 0.12％
11(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00％
12 1.088 1.088 1.088 1.088 1.087 1.087 0.01％
13 1.165 1.167 1.165 1.165 1.165 1.165 0.06％
14 1.210 1.213 1.210 1.210 1.210 1.211 0.11％
表7小儿金青颗粒稳定性试验各峰相对峰面积
Figure BDA0002308987880000102
Figure BDA0002308987880000111
实施例6指纹图谱的建立及分析
1.标准指纹图谱的建立及共有峰的确定
按照确定的小儿金青颗粒供试品溶液制备方法和液相色谱检测条件，分别取15批小儿金青颗粒样品，进行检测分析，所得到的15批样品指纹图谱叠加图见图13。根据所得的15批小儿金青颗粒的指纹图谱所给出的相关参数，儿金青颗粒测定所得的主要色谱峰均在95分钟内出现，将所得的指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”软件中进行处理，采用中位数法，时间窗宽度设定为0.2，运用多点校正方法对色谱图进行全峰匹配，拟合生成标准对照指纹图谱，见图14，并确定14个共有峰，以11号靛玉红色谱峰为参照峰，计算了15批样品中其他各共有峰的相对保留时间，平均相对保留时间(峰号)依次为0.117(1)、0.181(2)、0.197(3)、0.329(4)、0.363(5)、0.424(6)、0.458(7)、0.500(8)、0.581(9)、0.597(10)、1.088(12)、1.166(13)、1.212(14)，其相对偏差均在0.2％以内。
2.药材与成品指纹图谱之间的相关性
药材供试品溶液的制备：分别取处方中各味药材按照本品颗粒制剂工艺进行提取，制得浸膏，按照标准指纹图谱条件进行色谱峰归属。对比图见图15，结果见表8。
表8小儿金青颗粒与药材相关性图谱
峰号 青黛 青果 金橄榄 胖大海 蒲公英 绿茶
1 + +
2 + +
3 +
4 +
5 +
6 +
7 +
8 +
9 +
10 +
11 +
12 + + +
13 +
14 +
3.共有峰的指认
对照品溶液的制备：分别精密称取没食子酸、靛玉红、古伦宾、咖啡酸对照品，用甲醇配制成每1ml含没食子酸0.07mg、靛玉红1mg、古伦宾0.25mg、咖啡酸0.05mg的各单一对照品溶液。
分别将没食子酸、靛玉红、古伦宾、咖啡酸对照品所测得的色谱图与样品指纹图谱进行对比，在与各对照品相同保留时间处的色谱峰即得到了指认，见图16。结果显示，共有峰中1、5、9、11号色谱峰分别被指认为没食子酸、咖啡酸、古伦宾、靛玉红。其中靛玉红为君药青黛的主要活性成分之一，且11号靛玉红色谱峰峰形及分离度较好，左右无干扰色谱峰，故选择11号靛玉红色谱峰为参照峰。
4.相似度评价及样品合格判定
将15批样品的色图谱与标准对照指纹图谱进行对比，根据《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)进行相似度评价，见表9，15批样品的相似度分别为0.968﹑0.992﹑0.957﹑0.925﹑0.937﹑0.895﹑0.979﹑0.923﹑0.917﹑0.959﹑0.942﹑0.987﹑0.946﹑0.968﹑0.991，除一批为0.895外，其余14批相似度均在0.9以上，表明样品批间质量稳定性﹑均一性良好。综合考虑，选择以相似度大于0.880的样品判定为合格品。
表9 15批小儿金青颗粒样品的相似度评价
批号 相似度 批号 相似度 批号 相似度
180301 0.968 180901 0.895 190301 0.942
180302 0.992 180902 0.979 190302 0.987
180303 0.957 180903 0.923 190701 0.946
180601 0.925 181001 0.917 190702 0.968
180602 0.937 181002 0.959 190801 0.991

Claims (3)

1.一种小儿金青颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，所述小儿金青颗粒由以下重量份数的原料制成：青黛20-40份、金果榄60-120份、青果60-120份、蒲公英60-120份、绿茶叶40-80份、胖大海20-40份，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：将待测小儿金青颗粒研细，取0.5-5重量份，加入甲醇5-50体积份进行超声提取，提取液用0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液；
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取没食子酸、靛玉红、古伦宾、咖啡酸对照品，用甲醇配制成每1体积份分别含没食子酸、靛玉红、古伦宾、咖啡酸0.00005-0.0015重量份的各单一对照品溶液；
(3)分别精密吸取供试品溶液和各对照品溶液5-20μl，用高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为220nm，所述高效液相色谱仪的固定相为C18色谱柱，流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸水溶液，采用梯度洗脱，流速为0.5-2ml/min，柱温为25℃，理论板数不低于3000；
所述梯度洗脱中，各时间段及流动相B的体积比变化分别为：0～20min，流动相B90～75％；20～30min，流动相B 75～65％；30～60min，流动相B 65～40％；60～80min，流动相B40～10％；80～93min，流动相B10％；93～95min，流动相B10～90％；
(4)分别记录供试品溶液和对照品溶液0～95min的色谱图，利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液和对照品溶液的色谱图分别经过数据导入、多点矫正和数据匹配，得到小儿金青颗粒的标准指纹图谱，并进行相似度评价；
所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。
2.如权利要求1所述小儿金青颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述的标准指纹图谱有14个共有峰，其中1号峰归属于青果﹑绿茶，2号峰归属于绿茶，3号峰归属于青果，4、5、6、7、8号峰归属于绿茶，9号峰归属于金橄榄，10号峰归属于蒲公英，11、13、14号归属于青黛，12号峰归属于青黛、胖大海、蒲公英，并经指认其中1号峰为没食子酸、5号峰为咖啡酸、9号峰为古伦宾、11号峰为靛玉红。
3.如权利要求1所述小儿金青颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：与标准指纹图谱对比分析，以相似度大于0.880的判定为合格品。
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