CN114487240B - 茜草炭及其制剂的特征图谱及其构建方法和含量测定方法 - Google Patents

茜草炭及其制剂的特征图谱及其构建方法和含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药检测技术领域，具体提供了茜草炭及其制剂的特征图谱及其构建方法和含量测定方法，所述茜草炭及其制剂特征图谱的构建方法中包括(1)茜草炭供试品溶液的制备；(2)取茜草炭供试品溶液采用高效液相色谱法检测，填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶，流动相包括乙腈和水，梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→1分钟→3分钟→9分钟→12分钟→20分钟，流动相中乙腈的体积百分比为10％→20％→20％→30％→30％→35％，经大量实验筛选得到特定的洗脱程序，得到5个共有特征峰，并实现了包含异茜草素的特征峰的有效分离，峰形好，基线平稳，检测时间短。

Description

茜草炭及其制剂的特征图谱及其构建方法和含量测定方法
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种茜草炭及其制剂的特征图谱及其构建方法和含量测定方法。
背景技术
茜草是茜草科植物茜草Rabia cardifolia L.的干燥根和根茎，性味苦、寒，归肝经，具有凉血通经，化瘀止血的功效，临床主要用于吐血、衄血、崩漏、外伤出血、瘀阻经闭、关节痹痛、跌扑肿痛。茜草炭是由中药茜草经炒炭炮制而成的饮片，临床主要用于治疗由瘀血阻滞而引起的吐血、崩漏、外伤出血等出血症。茜草炭饮片化学成分研究主要集中在醌类、鞣质、微量元素等。其中醌类成分中异茜草素是茜草炭中主要的止血成分之一。
茜草炭配方颗粒是茜草炭饮片经现代制药技术提取、浓缩、分离、干燥、制粒包装精制而成的中药产品，具有较强的临床应用价值，市场需求广阔。现行的法定标准《中国药典》2020版只以浸出物作为定量考察项目，其量值关系不能全面反映中药成分的整体作用，其他文献研究报道《HPLC测定茜草炭饮片中1,3-二羟基蒽醌含量》，作者康辉，张振凌，周艳等。UPLC测定茜草炭中4种醌类成分的含量，作者陈星、王侃等，两篇文献主要侧重于对茜草炭饮片含测成分的研究。无法从整体上对茜草炭及其制剂进行质量检测。
目前有文献研究报道了采用高效液相色谱法建立茜草及其制剂的指纹图谱的方法。但是由于茜草炭在炮制过程中化学成分已经发生较大改变，这些针对茜草及其制剂特征图谱的构建方法并不适用于茜草炭及其制剂，当采用这些方法检测茜草炭及其制剂时，出现峰形差，峰高低，检测时间长，分离度低的问题，导致检测效果不佳。
发明内容
因此，本发明的第一个目的在于解决现有技术中的方法检测茜草炭及其制剂时得到的指纹图谱的峰形差、峰高低、检测时间长，分离度低的问题，提供了一种茜草炭及其制剂特征图谱及其构建方法和茜草炭及其制剂的含量测定方法。
具体的，本发明公开了茜草炭及其制剂特征图谱的构建方法，包括以下步骤，
(1)茜草炭供试品溶液的制备；
(2)取茜草炭供试品溶液采用高效液相色谱法检测，填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶，流动相包括乙腈和水，梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→1分钟→3分钟→9分钟→12分钟→20分钟，流动相中乙腈的体积百分比为10％→20％→20％→30％→30％→35％。
根据本发明任一项所述的构建方法，其中，步骤(1)包括：
1)取茜草炭供试品，加溶剂提取，得到提取液；
2)将提取液固液分离，取液体，即为供试品溶液。
根据本发明任一项所述的构建方法，还满足如下A-D中的任意一项或者多项：
A、步骤1)中，溶剂选自水、甲醇、乙醇中的至少一种；
B、步骤1)中茜草炭供试品的质量与溶剂的体积之比为0.2-0.5:10-40；
C、步骤1)中，提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为10min-5h；
D、步骤2)中，所述固液分离为离心或者过滤。
进一步地，步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为272-280nm，流速为0.28-0.32ml/min，柱温32-38℃，进样量为2-20μl。
优选的，色谱柱采用CORTECS T3(2.1mm×100mm，1.6μm)柱。
某些优选的实施方式中，构建方法还包括，采用异茜草素制备对照品溶液的步骤，以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到异茜草素对照品参照物峰的步骤。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述茜草炭及制剂选自茜草炭饮片和茜草炭制剂中的至少一种；其中茜草炭制剂是由茜草炭提取后得到的提取液(例如煎煮后得到的汤剂)按照药学上常规工艺，加入或者不加药学上常规辅料制成的中药制剂。
优选地，所述茜草炭制剂可以但不局限于干粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、软膏剂、溶液剂等。
更优选地，本发明提供的茜草炭及其制剂特征图谱的构建方法可以同时适用于茜草炭饮片、茜草炭标准汤剂冻干粉和茜草炭配方颗粒，即所述茜草炭及其制剂选自茜草炭饮片、茜草炭标准汤剂冻干粉和茜草炭配方颗粒中的至少一种。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取异茜草素对照品，加溶剂制成每1ml含异茜草素0.9～45μg(例如15-45μg)的对照品溶液。
优选的，所述溶剂选自水、纯乙醇、纯甲醇、乙醇水溶液、甲醇水溶液。
本发明还提供了一种茜草炭及其制剂的特征图谱，所述茜草炭及其制剂的特征图谱选自如下(1)-(3)中的任意一项：
(1)其具有5个特征峰，以4号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；规定值为：0.45(峰1)、0.67(峰2)、0.75(峰3)、1.00(峰4)、1.08(峰5)；
(2)呈现5个特征峰，与异茜草素对照品参照峰相应的峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内，规定值为：0.45(峰1)、0.67(峰2)、0.75(峰3)、1.00(峰4)、1.08(峰5)；
(3)茜草炭或者茜草炭制剂按照上述任一所述的构建方法得到。
本发明还提供了一种茜草炭及其制剂的对照特征图谱，所述茜草炭及其制剂的对照特征图谱选自如下(1)-(4)中的任意一项：
(1)其具有5个共有特征峰，以4号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；规定值为：0.45(峰1)、0.67(峰2)、0.75(峰3)、1.00(峰4)、1.08(峰5)；
(2)其具有5个共有特征峰，与异茜草素对照品参照物峰相应的峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内，规定值为：0.45(峰1)、0.67(峰2)、0.75(峰3)、1.00(峰4)、1.08(峰5)；
(3)使用单批次或者多批次茜草炭或者茜草炭制剂按照上述任一所述的构建方法得到的特征图谱；
(4)使用多批次茜草炭或者茜草炭制剂按照上述任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
本发明中，相对应是指两个峰的保留时间的RSD<5％、<3％或者1％。和/或，相对应是指两个峰重合度不小于50％。
本发明中，茜草炭及其制剂的对照特征图谱还可以使用多批次茜草炭或者茜草炭制剂按照本发明任一所述的构建方法得到的特征图谱；可选的，茜草炭及其制剂的对照特征图谱还可以使用多批次茜草炭或者茜草炭制剂按照本发明任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
可选的，至少采用3批茜草炭饮片或者茜草炭制剂得到对照特征谱图，例如采用3个批次的茜草炭配方颗粒、15个批次的茜草炭饮片、15批茜草炭标准汤剂冻干粉。
本发明的第二个目的在于解决现有技术中的方法无法检测茜草炭中止血有效成分异茜草素是茜草炭的缺陷，从而提供了茜草炭及其制剂中异茜草素的含量测定方法。
为此，本发明还提供了一种茜草炭及其制剂中异茜草素的含量测定方法，包括如下步骤：
茜草炭供试品溶液的制备；
异茜草素对照品溶液的制备；
测试步骤：取茜草炭供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法检测，填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶，流动相包括乙腈和水，梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→1分钟→3分钟→9分钟→12分钟→20分钟，流动相中乙腈的体积百分比为10％→20％→20％→30％→30％→35％。
作为具体的实施方式，所述茜草炭供试品溶液是按照本发明任一所述的茜草炭及其制剂特征图谱的构建方法中的步骤(1)的方法进行制备；所述测试步骤是按照本发明任一所述的茜草炭及其制剂特征图谱的构建方法中的步骤(2)的方法进行测试。
本发明还提供了本发明的茜草炭及其制剂特征图谱的构建方法和/或本发明的茜草炭及其制剂的对照特征图谱和/或茜草炭及其制剂中异茜草素的含量测定方法在茜草炭产品的质量检测中的用途。
本发明的第三个目的在于解决现有技术中的方法无法对比茜草炭饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱及指标成分的差异和变化，从而无法对整个工艺进行有效监控的缺陷。从而提供了一种茜草炭及其制剂的质量检测方法。建立统一的茜草炭饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱和含量测定方法，有利于整体评价从饮片到配方颗粒的工过程的合理性、科学性，也能定量控制茜草炭饮片、标准汤剂、配方颗粒的指标成分含量，保证茜草炭成品的临床疗效。
本发明还提供了一种茜草炭及其制剂的质量检测方法，包括将待测茜草炭产品的特征图谱与茜草炭及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测茜草炭产品的特征图谱为使用待测茜草炭产品按照本发明任一所述的构建方法得到，所述茜草炭及其制剂的对照特征图谱为本发明所述的茜草炭及其制剂的对照特征图谱；和/或，包括按照本发明所述的茜草炭及其制剂中异茜草素的含量测定方法测定待测茜草炭产品中异茜草素的含量的步骤。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述茜草炭产品选自茜草炭饮片和茜草炭制剂中的至少一种；其中茜草炭制剂是由茜草炭提取后得到的提取液(例如煎煮后得到的汤剂)按照药学上常规工艺，加入或者不加药学上常规辅料制成的中药制剂。优选地，所述茜草炭制剂可以但不局限于干粉剂、胶囊剂、片剂、软膏剂、溶液剂、颗粒剂等。更优选地，本发明提供的茜草炭产品选自茜草炭、茜草炭标准汤剂冻干粉和茜草炭配方颗粒中的至少一种。
某些实施方式中，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成茜草炭及其制剂的对照特征图谱。
某些优选的实施方式中，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成茜草炭及其制剂的对照特征图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的茜草炭及其制剂特征图谱的构建方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相包括乙腈和水，梯度洗脱，经大量实验筛选得到特定的洗脱程序，得到5个共有特征峰，并实现了包含异茜草素的特征峰的有效分离，峰形好，基线平稳，测定成分可实现完全分离，检测时间短，为茜草炭及其制剂的质量检测和控制提供依据，能充分的反映茜草炭及其制剂的整体性和特征性，方法操作简单，能适用于茜草炭不同的制剂类型的质量控制。
2.本发明提供的茜草炭及其制剂特征图谱的构建方法，经对照品指认，4号峰为异茜草素峰，分离均良好，面积适中，以它为参照可通过定性方式实现茜草炭质控的精确性。特征图谱中确定的5个特征峰为15批不同产地不同批次的茜草炭饮片、茜草炭标准汤剂冻干粉以及茜草炭颗粒的稳定共有峰，能很好的保证该方法应用于茜草炭质控方面的准确性。
3.本发明提供的茜草炭及其制剂中异茜草素的含量测定方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相包括乙腈和水，梯度洗脱，经大量实验筛选得到特定的洗脱程序，在该梯度下可准确地测定茜草炭及其制剂中有效成分即异茜草素的含量，在0.96～19.11μg/ml范围内线性满足分析要求，定量限低，且具有重现性好、稳定性好、准确度高、分析速率快的优点。
4.本发明提供的茜草炭制剂的检测方法，包括特征图谱构建方法和异茜草素含量测试方法，既能定量控制茜草炭饮片、茜草炭标准汤剂、茜草炭配方颗粒中指标成分的物质传递，又能整体控制茜草炭饮片、茜草炭标准汤剂、茜草炭配方颗粒特征成分质量的稳定，且方法操作简单，精密度高、稳定性好、重复性好、准确度高、分析速率快。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例1中茜草炭颗粒UPLC 3D色谱图；图2为本发明实验例1中15批茜草炭标准汤剂冻干粉的特征图谱及共有模式图；图3为本发明实验例1中3批茜草炭配方颗粒的特征图谱及共有模式图；图4为本发明实验例1中茜草炭标准汤剂冻干粉和茜草炭配方颗粒的对照特征图谱；图5为本发明实验例1中茜草炭配方颗粒与异茜草素的对比图；图6为本发明实验例1中15批茜草炭饮片的特征图谱及共有模式图；图7为本发明实验例5专属性考察中茜草炭颗粒的色谱图；图8为本发明实验例5专属性考察中异茜草素对照品的色谱图；图9为本发明实验例5专属性考察中阴性对照品的色谱图；
图10为本发明实验例5专属性考察中茜草炭标准汤剂冻干粉、空白试剂和异茜草素对照品的色谱图；
图11为本发明实验例5专属性考察中茜草炭饮片、空白试剂和异茜草素对照品的色谱图；图12为本发明实验例5线性关系示意图；图13为本发明实施例1中茜草炭配方颗粒的特征图谱；图14为本发明对比例1中茜草炭配方颗粒水溶液的特征图谱；图15为本发明对比例1中茜草炭配方颗粒水溶液与异茜草素的对比图；图16为本发明对比例1中异茜草素的光谱图；图17为本发明对比例1中茜草炭配方颗粒水溶液的光谱图；图18为本发明对比例1中茜草炭配方颗粒脂溶液的特征图谱；图19为本发明对比例2中茜草炭配方颗粒特征图谱与芦丁、异茜草素色谱图的对比图；图20为本发明对比例3中茜草炭配方颗粒特征图谱；图21为本发明对比例4和5中茜草炭配方颗粒特征图谱。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实验例1
1、试药：
茜草炭饮片均为市售。
茜草炭标准汤剂冻干粉的制备方法如下：取茜草炭饮片，置于砂锅中，浸泡30分钟，一煎加入饮片量7倍水(每克饮片加水7毫升)，武火煮沸后，文火煎煮30分钟，趁热过滤，迅速冷却，备用；二煎加饮片量6倍水(每克饮片加水6毫升)，武火煮沸后，文火煎煮20分钟，趁热过滤，迅速冷却备用；合并滤液，浓缩(65℃)，浓缩至料液比约为1:1(相对密度为1.05-1.10(60℃))，冷冻干燥，即得。
茜草炭配方颗粒的制备方法如下：取茜草炭饮片，沸腾(100℃)提取两次，一煎加入饮片量15倍水(每克饮片加水15毫升)，沸腾提取120分钟，二煎加入饮片量13倍水(每克饮片加水13毫升)，150目滤布趁热过滤，合并滤液80℃减压浓缩，至相对密度为1.05-1.10(60℃)，喷雾干燥，进风温度设定为180℃(±5℃)，干法制粒。
2、茜草炭及其制剂特征图谱的构建方法
供试品溶液的制备：分别以茜草炭、茜草炭标准汤剂冻干粉或者茜草炭配方颗粒为供试品制备各自的供试品溶液，具体方法如下：取供试品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
高效液相色谱法测试：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(CORTECS T3色谱柱，柱长为100m，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为35℃；进样量2.0μl，检测波长为276nm。
表1梯度程序
3、波长选择
对茜草炭配方颗粒供试品溶液进行3D全扫图，结果显示276nm左右的峰较丰富，且峰形较好，优于其他波长。选用276nm作为检测波长，见图1所示。
4、供试品溶液的制备
(1)提取溶剂的考察
取茜草炭配方颗粒适量，研细，取约0.5g，共9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入适当溶剂(水、30vt％乙醇、50vt％乙醇、甲醇、70vt％甲醇、50vt％甲醇、30vt％甲醇)20ml，密塞，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2.0μl，注入液相色谱仪，采用高效液相色谱法按本实施例第2项下色谱条件测定，测定各峰峰面积，结果表2。
表2提取溶剂考察表
小结：由上述结果可知，各提取溶剂特征图谱峰形相近，峰面积及分离度差异不大，考虑样品制备简单及异茜草素含量，选择甲醇为茜草炭特征图谱提取溶剂。
(2)提取方法的考察
取茜草炭配方颗粒适量，研细，取约0.5g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，分别90℃回流和超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取续滤液2.0μl，注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法按本实施例第2项下色谱条件测定，测定各峰峰面积，结果见表3。
表3提取方式考察表
小结：由上述结果可知，两种提取方法下，各特征图谱峰形相近，各特征峰峰面积、理论塔板数及分离度差异不大，考虑样品制备简单及经济性，选择超声作为茜草炭特征图谱提取方法。
(3)提取时间的考察
取茜草炭配方颗粒适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇20ml，密塞，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)20min、30min、40min，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取续滤液2.0μl，注入液相色谱仪，采用高效液相色谱法按本实施例第2项下色谱条件测定，测定各峰峰面积，结果见表4。
表4提取时间考察表
小结：由上述结果可知，不同提取时间得到的茜草炭特征图谱差别不大，为保证提取完全，选择常规时间30分钟作为供试品制备提取时间。
(4)提取浓度的考察
取茜草炭配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇20ml、40ml；取约0.5g，精密称定，分别精密加入甲醇10ml、20ml密塞，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取续滤液2.0ul注入液相色谱仪，采用高效液相色谱法按本实施例第2项下色谱条件测定，测定各峰峰面积，结果见表5。
表5不同提取浓度考察表
小结：由上述结果可知，不同样品浓度得到的茜草炭颗粒特征图谱，在0.2g-40ml和0.2g-20ml浓度时溶剂峰影响较大，考虑到批次间差异性，为保证提取完全，选择0.5g-20ml作为提取溶剂量倍数。即取样量0.5g，溶剂量20ml。因此，确定茜草炭颗粒样品制备方法为：取0.5g加入甲醇20ml，称重，超声处理30min，放冷，过滤，即得。
5、茜草炭标准汤剂冻干粉的对照特征图谱的建立以及特征峰确认
取15批茜草炭标准汤剂冻干粉和3批茜草炭配方颗粒分别按照本实施例第2项下方法制备供试品溶液并测定，获得15批茜草炭标准汤剂冻干粉的特征图谱和3批茜草炭配方颗粒的特征图谱，将这些特征图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)中进行共有峰指认与对照指纹图谱建立，建立了茜草炭标准汤剂冻干粉和配方颗粒的对照特征图谱，结果见图2、3和4所示，其中图2中S1是茜草炭标准汤剂冻干粉和配方颗粒的对照特征图谱，S2～S16分别为15批标准汤剂冻干粉。图3中，S1是茜草炭标准汤剂冻干粉和配方颗粒的对照特征图谱，S2～S4分别为3批配方颗粒。图4为茜草炭标准汤剂冻干粉和配方颗粒的对照特征图谱
取异茜草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含异茜草素10μg的对照品溶液，采用高效液相色谱法按本实施例第2项下色谱条件测定，制得对照品图谱。将茜草炭标准汤剂对照特征图谱与对照品图谱比对，见图5所示。
小结：对照特征图谱中呈现5个特征峰，经对照品指认，其中4号峰为异茜草素峰，并将此峰标记为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间为规定值，规定值为：0.45(峰1)、0.67(峰2)、0.75(峰3)、1.00(峰4)、1.08(峰5)。
表6 3批茜草炭配方颗粒的相对保留时间
结论：茜草炭配方颗粒3批生产验证的特征图谱相对保留时间与标准特征图谱的相对保留时间符合，特征图谱重现性较好。
6、茜草炭饮片的对照特征图谱的建立以及特征峰确认
取15批茜草炭饮片分别按照本实施例第2项下方法制备供试品溶液并测定，获得15批茜草炭饮片的特征图谱，将15批茜草炭饮片的特征图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)中进行共有峰指认与对照指纹图谱建立，建立了茜草炭饮片特征图谱的对照图谱，结果见图6所示，其中图6中S1是茜草炭饮片的对照特征图谱，S2～S16分别为15批茜草炭饮片的特征图谱。
小结：茜草炭饮片的对照特征图谱中呈现5个特征峰，4号峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间为规定值，规定值为：0.45(峰1)、0.67(峰2)、0.75(峰3)、1.00(峰4)、1.08(峰5)。
7、相似度评价
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)得到3批茜草炭配方颗粒、15茜草炭标准汤剂冻干粉和15批茜草炭饮片指纹图谱相似度分布在0.95～0.99之间，相似度均大于0.90。
实验例2方法学验证
1、精密度
(1)重复性
采用Waters UPLC H-Class，TUV检测器，取茜草炭颗粒(批号：K469CP01)样品适量，研细，取0.5g，取6份，按实验例1第2项下的方法制备供试品溶液并测定，获得其特征图谱，以4号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD，结果见下表所示。
表7茜草炭重复性考察保留时间及相对保留时间表
表8茜草炭重复性考察峰面积及相对峰面积表
重复性实验结果显示：六个重复性实验样品的5个标识峰的相对保留时间RSD在0.03％～0.06％范围内，相对峰面积RSD在1.04％～2.27％范围内，表明该特征图谱的重复性较好。
分别采用茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉代替茜草炭配方颗粒按照上述方法考察重复性。
结果显示，茜草炭饮片六个重复性实验样品的5个标识峰的相对保留时间RSD在0.02％～0.17％范围内，相对峰面积RSD在0.96％～2.24％范围内，表明该特征图谱的重复性较好。茜草炭标准汤剂冻干粉六个重复性实验样品的5个标识峰的相对保留时间RSD在0.13％～0.14％范围内，相对峰面积RSD在1.04％～2.27％范围内，表明该特征图谱的重复性较好。
(2)中间精密度
采用Waters UPLC H-Class，PDA检测器，取茜草炭颗粒(批号：K469CP01)样品适量，研细，取0.5g，取6份，按实验例1第2项下的方法制备供试品溶液并测定，获得其特征图谱，以4号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。结果见下表所示。
表9茜草炭颗粒中间精密度考察保留时间及相对保留时间表
表10茜草炭中间精密度考察峰面积及相对峰面积表
中间精密度实验结果显示：六个中间精密度实验样品的5个标识峰的相对保留时间RSD在0.03％～0.08％范围内，相对峰面积的RSD在2.05％～2.23％范围内，表明该特征图谱的中间精密度较好。
分别采用茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉代替茜草炭配方颗粒按照上述方法考察中间精密度。
结果显示，茜草炭饮片六个中间精密度实验样品的5个标识峰的相对保留时间RSD在0.56％～1.13％范围内，相对峰面积RSD在1.25％～2.77％范围内，表明该特征图谱的重复性较好。茜草炭标准汤剂冻干粉六个中间精密度样品的5个标识峰的相对保留时间RSD在0.02％～0.12％范围内，相对峰面积RSD在0.20％～3.10％范围内，表明该特征图谱的中间精密度较好。
2、耐用性
(1)稳定性
取茜草炭颗粒(批号：K469CP01)，样品适量，研细，取0.5g，按实验例1第2项下的方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24h按实验例1第2项下的色谱条件进行测定，获得其特征图谱，以4号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。结果见下表所示。
表11稳定性相对保留时间表
表12稳定性相对峰面积表
稳定性实验结果显示：经过考察24小时溶液稳定性，5个标识峰的相对保留时间RSD在0.54％～0.84％范围内，相对峰面积RSD在2.89％～4.34％范围内本实验所采用的茜草炭颗粒特征图谱分析方法稳定、可靠、重现性好。
分别采用茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉代替茜草炭配方颗粒按照上述方法考察稳定性。
结果显示，茜草炭饮片经过考察24小时溶液稳定性，5个标识峰的相对保留时间RSD在0.45％～1.16％范围内，相对峰面积RSD在1.57％～3.21％范围内，表明分析方法稳定、可靠、重现性好。茜草炭标准汤剂冻干粉经过考察24小时溶液稳定性，5个标识峰的相对保留时间RSD在0.47％～1.07％范围内，相对峰面积RSD在2.89％～4.34％范围内，表明分析方法稳定、可靠、重现性好。
(2)不同波长考察
取同一茜草炭颗粒供试品溶液(批号：K469CP01，按实验例1第2项下的方法制备得到)，按实验例1第2项下的色谱条件测定。本实验考察了272nm、276nm及280nm，考察实验方法对于不同检测波长的耐用性，结果见下表所示。
表13不同波长保留时间与相对保留时间结果表
小结：由以上数据可以看出，不同波长下，各特征峰相对保留时间RSD值在0.37％～3.44％范围内，该方法对波长的耐用性较好。
分别采用茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉代替茜草炭配方颗粒按照上述方法考察不同波长的耐用性。
结果显示，茜草炭饮片不同波长下，5个标识峰的相对保留时间RSD在0.28％～1.02％范围内，相对峰面积RSD在2.21％～4.20％范围内，该方法对波长的耐用性较好。茜草炭标准汤剂冻干粉不同波长下，5个标识峰的相对保留时间RSD在0.24％～1.31％范围内，相对峰面积RSD在1.57％～3.48％范围内，该方法对波长的耐用性较好。
(3)不同流速考察
取同一茜草炭颗粒供试品溶液(批号：K469CP01，按实验例1第2项下的方法制备得到)，按实验例1第2项下的色谱条件测定。本实验考察了流速0.28ml/min、0.30ml/min及0.32ml/min，考察实验方法对于不同流速的耐用性，结果见下表所示。
表14不同流速保留时间与相对保留时间结果表
小结：由以上数据可以看出，不同流速下，各特征峰相对保留时间RSD值在0.76％～3.05％范围内，说明该方法对0.28ml/min-0.32ml/min之间流速耐用性较好。
分别采用茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉代替茜草炭配方颗粒按照上述方法考察不同流速的耐用性。
结果显示，茜草炭饮片不同流速下，5个标识峰的相对保留时间RSD在1.28％～2.76％范围内，相对峰面积RSD在1.65％～3.59％范围内，该方法对流速的耐用性较好。茜草炭标准汤剂冻干粉不同流速下，5个标识峰的相对保留时间RSD在1.06％～3.06％范围内，相对峰面积RSD在1.34％～4.58％范围内，该方法对流速的耐用性较好。
(4)不同柱温的考察
取同一茜草炭颗粒供试品溶液(批号：K469CP01，按实验例1第2项下的方法制备得到)，按实验例1第2项下的色谱条件测定。本实验考察了柱温32℃、35℃及38℃，考察实验方法对于不同柱温的耐用性，结果见下表所示。
表15不同保留时间与相对保留时间结果表
小结：以上数据可以看出，不同柱温下，各特征峰相对保留时间RSD值在2.96％～4.35％范围内，该方法对柱温的耐用性较好。
分别采用茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉代替茜草炭配方颗粒按照上述方法考察不同柱温的耐用性。
结果显示，茜草炭饮片不同柱温下，5个标识峰的相对保留时间RSD在2.43％～4.79％范围内，相对峰面积RSD在2.44％～5.80％范围内，该方法对柱温的耐用性较好。茜草炭标准汤剂冻干粉不同柱温下，5个标识峰的相对保留时间RSD在2.96％～4.28％范围内，相对峰面积RSD在2.12％～4.76％范围内，该方法对柱温的耐用性较好。
实验例3含量测定方法中色谱条件的考察
1、试药
与实验例1相同。
2、茜草炭制剂中异茜草素含量的测试方法
(1)对照品溶液的制备：取异茜草素对照品适量，精密称定，加体积百分数为10％的甲醇水溶液制成每1ml含异茜草素30μg的对照品溶液；
(2)供试品溶液制备：分别以茜草炭、茜草炭标准汤剂冻干粉或者茜草炭配方颗粒为供试品制备各自的供试品溶液，具体方法如下：取供试品研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)高效液相法检测：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(CORTECS T3色谱柱，柱长为100m，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为35℃；进样量2.0μl，检测波长为276nm。
表16梯度程序
3、波长选择
本实验例第2项下的方法制备异茜草素对照品溶液，利用紫外检测器进行检测，确定异茜草素的最大吸收波长276nm为检测波长。
4、峰纯度的检验
取茜草炭颗粒供试品溶液，利用二极管阵列检测器对异茜草素峰进行峰纯度检验，见表17。
表17茜草炭颗粒异茜草素峰纯度表
结果显示，茜草炭颗粒的色谱图中，异茜草素的峰纯角度小于纯度阈值1.785＜90，表明该方法获得的异茜草素峰纯度符合分析要求。
5、系统适用性
本实验例第2项下的方法制备异茜草素对照品溶液并在本实验例第2项下高效液相色谱法的条件下，进行系统适用性试验，其结果见表18。
表18系统适用性试验结果
结果显示，对照品异茜草素理论板数为16242、拖尾因子为1.14、重复性RSD值为0.99％，样品中异茜草素峰的拖尾因子RSD值为0.66％，系统适用性符合分析要求。
实验例4供试品溶液的制备方法考察
供试品溶液的制备方法参考茜草炭所含的化学成分种类，对提取溶剂的类型、溶液的浓度、提取方式和提取时间进行了考察。
1、提取溶剂的考察
分别取茜草炭配方颗粒18份，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入适当溶剂(乙醇、70vt％乙醇、50vt％乙醇、30vt％乙醇、水、甲醇、70vt％甲醇、50vt％甲醇、30vt％甲醇)20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2μl，注入液相色谱仪，按实验例3第2项的色谱条件测定，测定峰面积，计算异茜草素的含量，结果见表19。
表19不同提取溶剂的比较
小结：以上结果表明，各提取溶剂异茜草素含量差异较大，甲醇提取含量最高，采用水溶液提取，含量最低，考虑到供试品溶液的保存，故确定提取溶剂为甲醇。
2、提取浓度的考察
取茜草炭配方颗粒适量，研细，取约0.2g、0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇20ml、40ml、10ml、20ml，制成样品浓度是5mg/ml、10mg/ml、25mg/ml、50mg/ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取续滤液2μl，注入液相色谱仪，按实验例3第2项的色谱条件测定，测定峰面积，计算异茜草素的含量。结果见表20所示。
表20提取溶剂量的比较
小结：以上结果表明，采用25mg/ml的浓度提取所得茜草炭颗粒中的异茜草素含量最高，因此确定取样量为0.5g，提取溶剂量为20ml。
3、提取时间的考察
分别称取茜草炭配方颗粒六份，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)一定时间(20分钟、30分钟、40分钟)，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，精密吸取续滤液2μl，注入液相色谱仪，按实验例3第2项的色谱条件测定，测定峰面积，计算异茜草素的含量，结果见表21。
表21提取时间的比较
小结：以上结果表明，不同超声时间所获得的供试品溶液中异茜草素含量差异不大，考虑到茜草炭颗粒中异茜草素含量的差异，因此确定提取时间为30分钟。
4、提取方式的考察
分别称取茜草炭配方颗粒四份，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，采用不同的提取方式[超声处理(功率250W，频率40kHz)、温度75℃下加热回流]提取30分钟，取出，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，精密吸取续滤液2μl，注入液相色谱仪，按正文色谱条件测定，测定峰面积，计算异茜草素的含量，结果见表22。
表22不同提取方式的比较
小结：以上结果表明，不同提取方式提取异茜草素的含量相近，从实验操作的简单性考虑，确定采用超声处理作为供试品溶液制备的提取方式。
实验例5含量测试的方法学验证
1、准确度
150％标准品溶液精密称取异茜草素对照品1.016mg，置于100ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，得150％标准品溶液。50％标准品溶液精密量取150％标准溶液30ml，置于100ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，得50％标准品溶液。100％标准品溶液精密量取150％标准溶液25ml，置于50ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，得100％标准品溶液。
精密称取茜草炭配方颗粒0.25g，9份，分为三组，每组分别精密加入上述制得的50％、100％、150％标准品溶液10ml，分别加入甲醇10ml，称重，超声30分钟后取出，放冷，补足减失重量，过滤即得样品。余下操作同实验例3第2项的测定项下，测定异茜草素的含量，按照下式计算回收率，结果见表23。
表23茜草炭颗粒回收率试验结果表
分别采用茜草炭饮片和茜草炭配方颗粒代替茜草炭标准汤剂冻干粉按照上述方法测定的回收率。
茜草炭标准汤剂冻干粉、茜草炭饮片以及茜草炭配方颗粒的回收率试验所测得的回收率范围分别为89.06％～100.95％、97.2％～100.2％和89.6％～102.2％，符合方法学验证回收率要求，表明利用该方法测得的结果准确。
2、精密度
(1)重复性
取茜草炭配方颗粒(批号：K469CP01)6份，按实验例3第2项的方法测定，结果见表24。
表24茜草炭颗粒重复性试验
分别采用茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉代替茜草炭配方颗粒按照上述方法考察重复性。
茜草炭配方颗粒、茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉的重复性试验所测得茜草炭颗粒中异茜草素平均含量分别为0.26mg/g、0.62mg/g、0.23mg/g，其RSD分别为1.67％、1.7％、2.4％，符合方法学验证重复性要求。
(2)中间精密度
不同分析人员在不同时间利用另一台Waters UPLCH-Class液相色谱仪(TUV检测器)进行中间精密度试验。取茜草炭(批号：K469CP01)6份，按实验例3第2项的方法进行测定，结果见表25。
表25茜草炭颗粒中间精密度试验结果表
分别采用茜草炭配方颗粒和茜草炭标准汤剂冻干粉代替茜草炭按照上述方法考察重复性。
茜草炭饮片、茜草炭配方颗粒和茜草炭标准汤剂冻干粉的中间精密度试验所测得茜草炭样品中的异茜草素平均含量为0.61mg/g、0.25mg/g、0.24mg/g，RSD值为2.4％、1.45％、1.02％，与重复性试验的检测结果的RSD为0.96％、2.71％、1.6％，符合方法学验证精密度要求。
3、专属性
取茜草炭配方颗粒所使用的辅料(糊精)适量，按照实验例3第2项的方法中供试品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液；取茜草炭颗粒供试品溶液、异茜草素对照品溶液、阴性对照溶液按实验例3第2项的方法获得其色谱图，取甲醇(空白试剂)、茜草炭标准汤剂冻干粉、茜草炭饮片、异茜草素对照品溶液按实验例3第2项的方法获得其色谱图，其结果见图7～11。专属性良好。
4、线性
取异茜草素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.02mg的溶液，作为异茜草素对照品母液；分别精密吸取异茜草素对照品母液1ml、5ml、15ml，分别置于20ml容量瓶中，另精密吸取异茜草素对照品母液5ml置于10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2μl，注入液相色谱仪，按正文方法测定异茜草素色谱峰峰面积，以异茜草素色谱峰的峰面积为纵坐标，异茜草素的浓度为横坐标，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归，求得回归方程为y＝39947.8157x-9679.0364，R2＝0.9993，其线性范围为0.96～19.11μg/ml。结果见图12，表26。
表26异茜草素标准曲线
5、范围
根据精密度、准确度和线性实验结果及多批次茜草炭中异茜草素含量的结果，茜草炭配方颗粒成品范围为0.10mg/g～1.0mg/g。
6、耐用性
(1)稳定性考察
取茜草炭配方颗粒(K469CP01)，按实验例3第2项的方法制备供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h按实验例3第2项的方法进行测定，记录异茜草素峰峰面积的变化情况，结果见表27。
表27茜草炭配方颗粒稳定性考察结果表
分别采用茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉代替茜草炭配方颗粒按照上述方法考察稳定性。
结果显示，茜草配方颗粒、茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉24小时内异茜草素峰的含量RSD值为1.96％、0.12％、0.50％，符合系统适用性试验要求。
(2)不同柱温的考察
取茜草炭颗粒(批号：K469CP01)，按实验例3第2项供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，分别于不同柱温(32℃、35℃及38℃)按实验例3第2项的方法进行测定，考察实验方法对于柱温的耐用性。结果如表28所示。
表28茜草炭配方颗粒不同柱温含量测定
分别采用茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉代替茜草炭配方颗粒按照上述方法考察不同柱温的稳定性。
结果显示，不同柱温下获得的色谱图，茜草配方颗粒、茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉测得异茜草素的含量RSD值为1.91％、3.8％、2.2％，符合系统适用性要求。表明该方法对柱温耐用性较好。
(3)不同流速的考察
取茜草炭配方颗粒(批号：K469CP01)，按实验例3第2项的供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，分别采用不同流速(0.28ml/min、0.30ml/min及0.32ml/min)按实验例3第2项的方法进行测定，考察实验方法对于流速的耐用性。结果如表29所示。
表29茜草炭配方颗粒不同流速含量测定结果表
分别采用茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉代替茜草炭配方颗粒按照上述方法考察不同流速的稳定性。
结果显示，采用不同流速获得的色谱图，茜草炭配方颗粒、茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉测得异茜草素的含量RSD值为2.54％、2.1％、2.2％，符合系统适用性要求。表明该方法对流速耐用性较好。
(4)不同波长的考察
取茜草炭配方颗粒(批号：K469CP01)，按实验例3第2项的供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，分别采用不同波长(272nm、276nm及280nm)按实验例3第2项的方法进行测定，考察实验方法对于波长的耐用性。结果如表30所示。
表30茜草炭配方颗粒不同波长含量测定结果表
分别采用茜草炭饮片和茜草炭标准汤剂冻干粉代替茜草炭配方颗粒按照上述方法考察不同流速的稳定性。
结果显示，采用不同波长获得的色谱图，茜草炭饮片、茜草配方颗粒和茜草炭标准汤剂冻干粉测得异茜草素的含量RSD值为0.80％、2.56％、1.2％，符合系统适用性要求。表明该方法对检测波长耐用性较好。
(5)样品测定
取3批茜草炭颗粒按实验例3第2项的方法制备成供试品溶液并测定异茜草素含量，结果见表31。
表31不同批次茜草炭颗粒含量测定表
小结：茜草炭颗粒每1g茜草炭颗粒含异茜草素应为0.10mg～1.00mg。
实施例1
本实施例提供了一种茜草炭配方颗粒的特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：取茜草炭配方颗粒适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
高效液相色谱法测试：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(CORTECS T3色谱柱，柱长为100m，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为35℃；进样量2.0μl，检测波长为276nm。
表32梯度程序
见图13，该特征图谱具有5个特征峰，以4号峰为参比峰(4S)，各特征峰与1号峰的相对保留时间的比值为：0.45(峰1)、0.69(峰2)、0.75(峰3)、1.00(峰4)，1.07(峰5)，峰结果见表23所示。
表33峰结果
保留时间 峰面积 分离度 拖尾 理论塔板数 峰占比/％
峰1 6.425 876368 >1.5 1.11 34704 44.10
峰2 10.183 415288 18.71 1.03 41574 20.90
峰3 11.326 208236 4.02 0.99 29000 10.48
峰4 15.536 271582 9.23 1.01 15751 13.66
峰5 16.522 215977 2.04 1.05 19173 10.87
由上表和图13可知，上述5个特征峰分离度均在1.5％以上，且各峰高均匀，峰形好。各峰面积占总面积比值在10.48％～44.10％之间。
对比例1
采用专利文献CN104133028A实施例中公开的方法检测本发明实施例1采用的茜草炭配方颗粒。采用本申请实施例1同批次茜草炭配方颗粒代替该文献的茜草配方颗粒按照该文献实施例的方法制备供试品溶液并该文献实施例的方法进行高效液相色谱分析。
分别得到茜草炭配方颗粒水溶液的特征图谱和茜草炭配方颗粒脂溶液的特征图谱，如图14-18。峰结果见下表所示。
表34茜草炭配方颗粒水溶液的峰结果
峰 保留时间/min 峰面积 不对称度 分离度 塔板数 峰占比/％
1 4.433 7.516 1.75 4.76 16175 5.3
2 5.087 6.065 0.97 1.32 22387 4.3
3 6.267 12.135 0.72 1.24 12923 8.6
4 6.707 2.794 0.8 0.51 23024 2.0
5 6.953 3.384 1.06 0.62 26392 2.4
6 7.477 1.92 1.16 1.03 22909 1.4
7 8.873 2.917 0.91 3.24 33646 2.1
8 11.117 1.721 0.86 2.64 24941 1.2
9 12.127 1.988 1 0.84 52827 1.4
10 13.653 10.188 1.11 10.71 38785 7.2
11 17.203 1.894 0.92 0.96 43268 1.3
12 17.71 37.466 1.07 1.42 42251 26.4
13 23.81 1.589 1.18 1.56 59760 1.1
14 24.79 6.362 0.99 1.52 128945 4.5
15 25.96 1.943 0.99 2.89 214028 1.4
16 27.053 3.174 1.1 1.03 178740 2.2
17 28.617 1.824 1.48 1.24 347647 1.3
18 29.987 5.731 0.97 1.4 289150 4.0
19 38.47 2.269 1.19 1.32 211352 1.6
20 39.243 5.574 0.83 1.41 231036 3.9
21 39.687 12.606 1.43 2.81 274626 8.9
22 43.843 1.908 1.01 7.31 340172 1.3
23 46.453 1.831 1.12 1.01 199704 1.3
24 49.61 3.268 1.01 0.98 482308 2.3
25 50.077 1.732 1.02 0.87 485056 1.2
26 50.697 1.953 1.03 6.4 487157 1.4
表35茜草炭配方颗粒脂溶液的峰结果
中药分析方法中，构建的指纹图谱或特征图谱中特征峰的分离度需要大于1.5，峰面积占比是大于5％，最好大于10％，此外还需要峰形良好。其中峰面积占比是指各特征峰面积分别占特征峰面积总和的百分比。
从上表中可以看出，采用对比例1的方法构建的脂溶性特征峰中只有1个色谱峰基本满足要求。而水溶液的特征图谱只有3个勉强满足要求，但是检测试剂过长，其余色谱均不能作为特征图谱特征峰。
23号峰与异茜草素峰位置重叠，但是该峰分离度低下，而且根据茜草炭和异茜草素的光谱图分析可知(图16和17)，在茜草炭颗粒样品色谱中，与异茜草素保留时间相同位置上的色谱峰，最大吸收波长与异茜草素对照品光谱最大吸收波长不一致，两者不是相同物质的峰。
对比例2
采用专利文献CN106770785A实施例1中公开的方法检测本发明实施例1采用的茜草炭配方颗粒，采用本申请实施例1同批次茜草炭配方颗粒代替该文献中的茜草藤药材按照该文献实施例1方法制备供试品溶液。
取芦丁对照品加甲醇制成每1ml含0.00010g的溶液，摇匀，作为芦丁对照品溶液。
取异茜草素对照品适量，精密称定，加体积百分数为10％的甲醇水溶液制成每1ml含异茜草素30μg的对照品溶液，作为异茜草素对照品溶液。
取供试品溶液、芦丁对照品溶液和异茜草素对照品溶液按照该文献的方法进行高效液相测试。得到茜草炭配方颗粒的特征图谱，见图19所示。
表36茜草炭配方颗粒脂溶液的峰结果
从上表中可以看出，采用对比例2的方法构建的峰中有5个色谱峰基本满足要求，但是检测试剂过长(长达60min)，其余色谱均不能作为特征图谱特征峰，采用对比例2方法，未在本专利样品中检测到芦丁成分，而异茜草素成分在整个图谱的后半段，检测时间上无优势，且分离度低下，无法进行特征分析和含量测定。
通过对比分析可以知道，茜草炭经炮制后，物质成分发生了很大变化，在茜草和茜草炭方法中应该存在的特征峰在本专利的样品中均未检测到，本专利方法对茜草炭炮制后增加的成分进行优化，并进行定量测定。
对比例3
本对比例提供了一种茜草炭配方颗粒的特征图谱的构建方法，与实施例1的区别仅在于流动性和梯度洗脱程序不同，本对比例采用下表的流动相和梯度洗脱程序。
表37梯度程序
时间/min 流动相A：甲醇(vt％) 流动相B：0.2％甲酸水溶液(vt％)
0～4 10～35 90～65
4～8 35～37 65～63
8～12 37～45 63～55
14～18 10 90
结果如图20所示，按照此方法对茜草炭配方颗粒供试品溶液进行分析，无法得到分离度较好的特征峰，表明此流动相体系不适合分析茜草炭配方颗粒。
对比例4
本对比例提供了一种茜草炭配方颗粒的特征图谱的构建方法，与实施例1的区别仅在于梯度洗脱程序不同，本对比例采用下表的梯度洗脱程序。
表38梯度程序
时间(分钟) 乙腈(vt％) 水(vt％)
0～4 10～35 90～65
4～8 35～37 65～63
8～12 37～45 63～55
结果如图21所示，茜草炭颗粒图谱的峰形差，拖尾严重。
对比例5
本对比例提供了一种茜草炭配方颗粒的特征图谱的构建方法，与实施例1的区别仅在于梯度洗脱程序不同，本对比例采用下表的梯度洗脱程序。
表39梯度程序
时间(分钟) 乙腈(vt％) 0.5％磷酸(vt％)
0～4 10～35 90～65
4～8 35～37 65～63
8～12 37～45 63～55
结果如图21所示，茜草炭颗粒图谱的峰形差，拖尾严重。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (11)

1.一种茜草炭及其制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，
（1）茜草炭供试品溶液的制备；茜草炭供试品溶液的提取溶剂选自水、甲醇、乙醇中的至少一种；
（2）取茜草炭供试品溶液采用超高效液相色谱法检测，流动相包括乙腈和水，梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→1分钟→3分钟→9分钟→12分钟→20分钟，流动相中乙腈的体积百分比为10%→20%→20%→30%→30%→35%；色谱柱采用规格为2.1mm×100mm，1.6μm的CORTECS T3柱。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）包括：
1）取茜草炭供试品，加溶剂提取，得到提取液；
2）将提取液固液分离，取液体，即为供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）还满足如下A-C中的任意一项或者多项：
A、步骤1）中茜草炭供试品的质量与溶剂的体积之比为0.2-0.5:10-40；
B、步骤1）中，提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为10min-5h；
C、步骤2）中，所述固液分离为离心或者过滤。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）超高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为272-280nm，流速为0.28-0.32ml/min，柱温32-38℃，进样量为2-20μl。
5.根据权利要求1-3中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用异茜草素制备对照品溶液的步骤，以及按照权利要求1-3中任一所述的构建方法中的超高效液相色谱法检测对照品溶液得到异茜草素对照品参照图谱的步骤。
6.根据权利要求1-4中任一所述的构建方法，其特征在于，所述茜草炭及其制剂的特征图谱选自如下（1）-（3）中的任意一项：
（1）其具有5个特征峰，以4号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10%的范围之内；峰1-峰5的规定值为：0.45、0.67、0.75、1.00、1.08；
（2）呈现5个特征峰，与异茜草素对照品参照物峰相应的峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10%的范围之内，峰1-峰5的规定值为：0.45、0.67、0.75、1.00、1.08；
（3）茜草炭或者茜草炭制剂按照权利要求1-4中任一所述的构建方法构建得到的特征图谱。
7.根据权利要求1-4中任一所述的构建方法，其特征在于，所述茜草炭及其制剂的对照特征图谱选自如下（1）-（4）中的任意一项：
（1）其具有5个共有特征峰，以4号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10%的范围之内；峰1-峰5的规定值为：0.45、0.67、0.75、1.00、1.08；
（2）其具有5个共有特征峰，与异茜草素对照品参照物峰相应的峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10%的范围之内，峰1-峰5的规定值为：0.45、0.67、0.75、1.00、1.08；
（3）使用单批次或者多批次茜草炭或者茜草炭制剂按照权利要求1-4中任一所述的构建方法得到的特征图谱；
（4）使用多批次茜草炭或者茜草炭制剂按照权利要求1-4中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
8.权利要求1-4中任一项所述的茜草炭及其制剂的特征图谱的构建方法在茜草炭产品的质量检测中的应用。
9.一种茜草炭及其制剂的质量检测方法，其特征在于，包括将待测茜草炭产品的特征图谱与茜草炭及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测茜草炭产品的特征图谱为使用待测茜草炭产品按照权利要求1-4中任一所述的构建方法得到，所述茜草炭及其制剂的对照特征图谱为权利要求7所述的茜草炭及其制剂的对照特征图谱。
10.根据权利要求9所述的茜草炭及其制剂的质量检测方法，其特征在于，还包括茜草炭制剂中异茜草素的含量测定方法，所述茜草炭制剂中异茜草素的含量测定方法，包括如下步骤：
茜草炭供试品溶液的制备；
异茜草素对照品溶液的制备；
测试步骤：取茜草炭供试品溶液和对照品溶液分别采用超高效液相色谱法检测，色谱柱采用规格为2.1mm×100mm，1.6μm的CORTECS T3柱，流动相包括乙腈和水，梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→1分钟→3分钟→9分钟→12分钟→20分钟，流动相中乙腈的体积百分比为10%→20%→20%→30%→30%→35%；茜草炭制剂是由茜草炭提取后得到的提取液按照药学上常规工艺，加入或者不加药学上常规辅料制成的中药制剂。
11.根据权利要求10所述的茜草炭及其制剂的质量检测方法，其特征在于，所述茜草炭供试品溶液是按照权利要求1-4中任一所述的茜草炭及其制剂的特征图谱的构建方法中的步骤（1）的方法进行制备；所述测试步骤是按照权利要求1-4中任一所述的茜草炭及其制剂的特征图谱的构建方法中的步骤（2）的方法进行测试。
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