CN114965741B - 一种蓼大青叶水提取物及其制剂的特征图谱及其构建方法 - Google Patents

一种蓼大青叶水提取物及其制剂的特征图谱及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药质量检测领域，具体公开了一种蓼大青叶水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法，包括以下步骤，(1)供试品溶液的制备；(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相包括水和甲醇，梯度洗脱程序如说明书所定义。得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离度高，而且可以准确定位鸟苷、尿苷和腺苷峰的峰位置，充分的反映蓼大青叶水提取物以及水提取制剂(例如配方颗粒等制剂)的整体性和特征性，为蓼大青叶配方颗粒的质量检测和控制提供依据。

Description

一种蓼大青叶水提取物及其制剂的特征图谱及其构建方法
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种蓼大青叶水提取物及其制剂的特征图谱及其构建方法。
背景技术
蓼大青叶为蓼科植物蓼蓝Polygonum tinctorium Ait.的干燥叶。本品具有清热解毒、凉血消斑的功效。用于温病发热、发斑发疹、肺热喘咳、喉痹、痄腮、丹毒和痈肿等症。该药材的质量标准收载于《中国药典》2020年版一部。长期以来，蓼大青叶的质量评价方法限于以靛蓝、靛玉红等化合物作为质量控制指标，其中的靛蓝成分是2020年版《中国药典》中蓼大青叶项下含量测定指标。
蓼大青叶制剂常见的制剂类型有粉末剂、配方颗粒等，例如配方颗粒是由蓼大青叶饮片经过提取、浓缩、干燥、制剂等步骤得到的配方颗粒，其物质基础与药材的物质基础存在较大的差异。目前，关于蓼大青叶配方颗粒的研究未见报道。文献研究报道《大青叶及其3种类似品中靛蓝、靛玉红含量测定及其指纹图谱初步研究》，作者詹雅娴，付强，段然等。该文献主要侧重于对蓼大青叶的研究。
然而由于中药配方颗粒已经不具备药材性状鉴别的特征，上述方法不适于蓼大青叶配方颗粒等由蓼大青叶水提取物制得的制剂的质量检测，特征峰少，分离效果差，且对照品靛蓝、靛玉红为脂溶性成分，无法适用于配方颗粒等制剂的研究。采用高效液相色谱法对蓼大青叶水提取及其制剂进行特征图谱的定性检测目前还是一个空白，如何提高蓼大青叶水提取及其制剂的检测标准，全面地控制成品质量是本发明需要解决的技术问题。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种蓼大青叶水提取物及其制剂特征图谱及其建立方法，该方法根据水提取物及其制剂的特点，建立该品种的特征图谱，实现各特征峰的有效分离，为全面建立蓼大青叶配方颗粒的质量控制标准提供科学依据。
具体的，本发明公开了一种蓼大青叶水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法，包括以下步骤，
(1)供试品溶液的制备；
(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相包括水和甲醇，梯度洗脱程序包括：0→9-11min→13.5-16.5min→18-22min→22.5-27.5min→31.5-38.5min，流动相中甲醇的体积百分数为：2.7-3.3％→2.7-3.3％→22.5-27.5％→49.5-60.5％→57.6-70.4％→81-99％。
在某些优选的实施方式中，步骤(2)还满足如下1)-4)中的至少一项：
1)检测波长为258-262nm，流速为0.9-1.1mL/min，柱温为28-32℃；
2)流动相为甲醇和水的混合液；
3)所述梯度洗脱程序还包括：31.5-38.5min→40.5-49.5min，流动相中甲醇的体积百分数为：81％-99％→81％-99％，优选的，所述梯度洗脱程序还包括：35min→45min，流动相中甲醇的体积百分数为：90％→90％。
4)梯度洗脱程序还包括：31.5-38.5min→40.5-49.5min→41.4-50.6min，流动相中甲醇的体积百分数为：81％-99％→81％-99％→2.7％-3.3％；优选的，所述梯度洗脱程序还包括：35min→45min→46min，流动相中甲醇的体积百分数为：90％→90％→3％。
进一步地，梯度洗脱程序包括：0→10min→15min→20min→25min→35min，流动相中甲醇的体积百分数为：3％→3％→25％→55％→64％→90％。
本发明中，蓼大青叶水提取物及其制剂指可以是蓼大青叶水提取物，也可以是由蓼大青叶水提取物制成的制剂，例如粉剂、颗粒剂、片剂等。
在某些优选的实施方式中，步骤(1)包括，称取蓼大青叶供试品，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液；
在某些优选的实施方式中，所述步骤(1)还满足如下A-E中的任意一项或者多项：
A、蓼大青叶配方颗粒的质量与溶剂的体积之比为1：500～1：80，优选为1：300～1：80；质量与体积的关系为g/mL。
B、提取方式为回流提取或者超声提取；
C、提取时间为≥10min，优选为15-40min，更优选为15-25min；
D、所述固液分离选自离心或者滤膜过滤；
E、溶剂选自50-70％甲醇水溶液、水或者65-75％乙醇水溶液；优选为水。
在某些优选的实施方式中，所述的构建方法还包括采用鸟苷对照品、尿苷对照品和腺苷对照品中的至少一种加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照本发明任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品图谱的步骤。
优选的，每1mL对照品溶液中含5-30μg鸟苷和/或含5-30μg尿苷和/或5-30μg腺苷；和/或，对照品溶液制备中所采用的溶剂选自甲醇或甲醇水溶液。
某些优选的实施方式中，所述蓼大青叶水提取物和/或其制剂的特征图谱选自如下(1)-(2)中的任意一项：
(1)具有10个共有特征峰，以5号峰为参照峰，各特征峰与参照峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；规定值为：0.34(峰1)、0.39(峰2)、0.48(峰3)、0.58(峰4)、1.00(峰5)、1.09(峰6)、1.46(峰7)、2.30(峰8)、2.35(峰9)、2.47(峰10)；
(2)具有10个共有特征峰，以鸟苷峰为参照峰，各特征峰与参照峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；规定值为：0.34(峰1)、0.39(峰2)、0.48(峰3)、0.58(峰4)、1.00(峰5)、1.09(峰6)、1.46(峰7)、2.30(峰8)、2.35(峰9)、2.47(峰10)。
某些优选的实施方式中，还包括蓼大青叶配方颗粒的对照特征图谱的构建，对多批蓼大青叶配方颗粒供试品检测得到的特征图谱，利用中药色谱特征图谱相似度评价系统生成蓼大青叶配方颗粒的对照特征图谱。至少采用2批蓼大青叶配方颗粒，例如采用4个批次、7个批次、8个批次、15个批次的蓼大青叶配方颗粒。
某些优选的实施方式中，利用中药色谱特征图谱相似度评价软件生成蓼大青叶配方颗粒的对照特征图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。
采用蓼大青叶水提取物和/或其制剂按照本发明任一所述的构建方法得到的蓼大青叶水提取物及其制剂的特征图谱。
本发明还提供了一种蓼大青叶水提取物及其制剂的对照特征图谱，其具有10个共有特征峰，以鸟苷峰为参照峰，各特征峰与参照峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内；规定值为0.34(峰1)、0.39(峰2)、0.48(峰3)、0.58(峰4)、1.00(峰5)、1.09(峰6)、1.46(峰7)、2.30(峰8)、2.35(峰9)、2.47(峰10)。
本发明中，蓼大青叶水提取物及其制剂的对照特征图谱还可以使用单批次或者多批次蓼大青叶水提取物和/或其制剂按照本发明任一所述的构建方法得到的蓼大青叶水提取物和/或其制剂的特征图谱；可选的，蓼大青叶水提取物及其制剂的对照特征图谱还可以使用多批次蓼大青叶水提取物和/或其制剂供试品按照本发明任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成特征图谱。
本发明还提供了上述任一项所述的蓼大青叶水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法在蓼大青叶水提取物及其制剂的质量检测中的应用。
本发明还提供了一种蓼大青叶配方颗粒的质量检测方法，包括将待测蓼大青叶产品的特征图谱与蓼大青叶水提取物及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测蓼大青叶产品的特征图谱为使用待测蓼大青叶产品按照上述任一所述的构建方法得到，所述蓼大青叶水提取物及其制剂对照特征图谱为上述所述的蓼大青叶水提取物及其制剂对照特征图谱。
其中，本发明中蓼大青叶产品可以是蓼大青叶水提取物，也可以是由蓼大青叶水提取物制成的制剂，例如粉剂、颗粒剂、片剂等。
采用相似度评价待测蓼大青叶配方颗粒产品的质量，当待测蓼大青叶配方颗粒产品的特征图谱与蓼大青叶配方颗粒的对照特征图谱的相似度如果不低于0.90-1.00(例如0.95)，则为质量合格；如果低于0.90-1.00(例如0.89)，则为不合格；具体地，所述相似度通过中药色谱特征图谱相似度评价软件得到。
本发明中，vt％表示体积百分数，vt％甲醇或％甲醇均是指甲醇水溶液中甲醇的体积百分数，vt％乙醇或者％乙醇是指乙醇水溶液中乙醇的体积百分数。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明所述的蓼大青叶水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相包括水和甲醇，通过优选梯度洗脱程序，梯度洗脱程序包括：0→9-11min→13.5-16.5min→18-22min→22.5-27.5min→31.5-38.5min，流动相中甲醇的体积百分数为：2.7-3.3％→2.7-3.3％→22.5-27.5％→49.5-60.5％→57.6-70.4％→81-99％；最终得到10个共有特征峰，并实现了10个共有特征峰的有效分离，而且得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、峰高或峰面积均匀，为全面建立蓼大青叶配方颗粒的质量控制标准提供科学依据。而且还可以准确定位鸟苷、尿苷和腺苷峰的峰位置，充分的反映蓼大青叶水提取物以及水提取制剂(例如配方颗粒等制剂)的整体性和特征性。
2.本发明所述的蓼大青叶水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法，通过优化色谱条件、提取溶剂、提取时间等提取条件进行考察，确定了最佳提取工艺和色谱条件，使得峰面积更高，分离效果更好，能够更加全面的对蓼大青叶配方颗粒进行质量监控。
3.本发明所述的蓼大青叶水提取物及其制剂的质量检测方法，通过待测蓼大青叶配方颗粒产品的特征图谱与蓼大青叶配方颗粒的对照特征图谱进行比较，可以全面、清楚、有效的对蓼大青叶配方颗粒进行质量检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为方法一条件下的色谱图；
图2为方法二条件下的色谱图；
图3为方法三条件下的色谱图；
图4为不同提取溶剂构建的色谱图；由下至上依次为：95％甲醇、水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇的色谱图；
图5为不同提取时间构建的色谱图；
图6为不同提取溶剂用量构建的色谱图；
图7为蓼大青叶配方颗粒与对照品对比色谱图；
图8为8批蓼大青叶配方颗粒的特征图谱；
图9为蓼大青叶配方颗粒的对照特征图谱；
图10为不同柱温的色谱图；
图11为不同流速的色谱图；
图12为实施例1构建的蓼大青叶配方颗粒的特征图谱；
图13为实施例2构建的蓼大青叶水提取的特征图谱；
图14为实施例3构建的蓼大青叶标准汤剂冻干粉的特征图谱；
图15为对比例1构建的蓼大青叶配方颗粒的特征图谱；
图16为对比例2构建的蓼大青叶配方颗粒的特征图谱。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实验例1构建方法的考察
1、仪器、试剂及试药
仪器：Waters e2695高效液相色谱仪(TUV Detector检测器)，ML204T电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，JA1002电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)，MSA6.6S-0CE-DM电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，KQ-100DE数控超声波清洗(昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP(4.6×250mm，5μm)
鸟苷对照品(批号：111977-201501，中国食品药品检定研究院，纯度93.6％)
尿苷对照品(批号：110887-201803，中国食品药品检定研究院，纯度99.5％)
腺苷对照品(批号：110879-201703，中国食品药品检定研究院，纯度99.7％)
试剂：甲醇为色谱纯，乙醇为分析纯，水为屈臣氏蒸馏水。
试药：蓼大青叶配方颗粒可以采用本领域常规方法制备，例如本发明中按照如下步骤制备：取蓼大青叶饮片150kg，沸腾(100℃)提取两次，一煎加水量为饮片量12倍(每克饮片加水12毫升)，二煎加水量为饮片量10倍(每克饮片加水10毫升)提取1小时，150目滤布趁热过滤，滤液80℃减压浓缩，至相对密度为1.05～1.10(60℃)，进行喷雾干燥，进风温度设定为180℃±5，干法制粒，包装规格为1g/袋、100g/瓶包装、250g/瓶包装，密封储存。采用不同批次的蓼大青叶饮片制得批号为K478CP01、K478CP02、K478CP03、K478CP04、K478CP05、K478CP06、K478CP07以及K478CP08的蓼大青叶配方颗粒。
蓼大青叶水提物可以采用本领域常规方法提取，例如加热回流提取、超声提取等，本发明按照如下步骤制备：取蓼大青叶饮片1g，置具塞锥形瓶中，精密加入水15ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
蓼大青叶标准汤剂冻干粉可以采用本领域常规方法制备，例如本发明按照如下步骤制备：取蓼大青叶饮片100g，置于煎药壶中，浸泡30分钟，一煎加入饮片量10倍水(每克饮片加水10毫升)，武火煮沸后，文火煎煮20分钟，趁热过滤，迅速冷却，备用；二煎加饮片量8倍水(每克饮片加水8毫升)，武火煮沸后，文火煎煮15分钟，趁热过滤，迅速冷却，备用；合并两煎滤液，低温减压浓缩(65℃)，浓缩至料液比约为1:1(相对密度为1.05-1.10)，冷冻干燥，密封保存，即得。
2、供试品溶液的制备
精密称取蓼大青叶配方颗粒，研细，取约0.1g，置具塞锥形瓶中，精密加入水15ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得到蓼大青叶配方颗粒供试品溶液。
3、色谱条件的优化
(1)流动相梯度优化
方法一：采用高效液相色谱法对按照本实验例第2项下制得的供试品溶液进行检测，用Agilent ZORBAX Bonus-RP(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃，检测波长为260nm，进样10μl；结果如图1和表4所示，峰主要聚集在0～15min，15～30min基本无色谱峰出现，分离效果差，且10min左右出现了裂峰。
表1方法一下的梯度程序
Figure BDA0003603659280000061
方法二：采用高效液相色谱法对按照本实验例第2项下制得的供试品溶液进行检测，用Agilent ZORBAX Bonus-RP(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃，检测波长为260nm，进样10μl，结果如图2和表4所示，裂峰分开，色谱峰仍聚集在前半部分，部分峰分离度小于1.5，部分峰峰高过低，特征峰个数少。
表2方法二下的梯度程序
Figure BDA0003603659280000062
方法三：采用高效液相色谱法对按照本实验例第2项下制得的供试品溶液进行检测，用Agilent ZORBAX Bonus-RP(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃，检测波长为260nm，进样10μl，结果如图3和表4所示，蓼大青叶配方颗粒色谱峰分离效果佳(表格中10个特征峰的分离度均大于1.5)，峰高均匀，特征峰个数多，信息丰富。
表3方法三下的梯度程序
Figure BDA0003603659280000063
Figure BDA0003603659280000071
表4各梯度色谱峰系统适用性参数
Figure BDA0003603659280000072
4、供试品溶液的制备
(1)提取溶剂选择
取蓼大青叶配方颗粒，研细，取约0.1g，9份，分别精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入提取溶剂(水、30vt％甲醇、50vt％甲醇、70vt％甲醇、95vt％甲醇、30vt％乙醇、50vt％乙醇、70vt％乙醇、95vt％乙醇)25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，分别以相应的提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入高效液相色谱仪，按本实验例第3项方法三的色谱条件测定，测定各峰峰面积和分离度。
表5各提取溶剂的峰面积结果
Figure BDA0003603659280000081
表6各提取溶剂的分离度结果
Figure BDA0003603659280000082
其中斜线表示色谱峰缺失。
小结：由上表和图4可以看出，采用30％甲醇、30％乙醇、50％乙醇、95％甲醇及95％乙醇均有色谱峰缺失，可以采用体积百分数为50-70％的甲醇水溶液、水或者体积百分数为65-75％的乙醇水溶液(例如70％乙醇水溶液)作为提取溶剂，优选以水作为提取溶剂，各特征峰峰的分离度更佳。
(2)提取时间选择
取蓼大青叶配方颗粒，研细，取约0.1g，3份，分别精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)20、30、40分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入高效液相色谱仪，按本实验例第3项方法三的色谱条件测定，测定各峰峰面积和分离度。
表7提取时间的峰面积结果
Figure BDA0003603659280000083
表8提取时间的分离度结果
Figure BDA0003603659280000084
小结：超声提取15-25分钟(例如20分钟)即可提取完全，由上表和图5可知，提取20分钟各特征峰峰面积较高，且分离度较佳。
(3)提取溶剂用量选择
取蓼大青叶配方颗粒，研细，取约0.1g，3份，分别精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入水15ml、25ml、50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入高效液相色谱仪，按本实验例第3项方法三的色谱条件测定，测定各峰峰面积和分离度。
表9提取溶剂用量的峰面积结果
Figure BDA0003603659280000091
表10提取溶剂用量的分离度结果
Figure BDA0003603659280000092
小结：由上表和图6可以看出，提取溶剂为15-50ml都能满足色谱分离的要求，相对来说，提取溶剂用量为8-30ml(例如15ml)时多数特征峰的峰面积更高。
(4)供试品溶液制备方法的确定
根据上述研究结果，确定的供试品溶液制备方法为：精密称取蓼大青叶配方颗粒，研细，取约0.1g，置具塞锥形瓶中，精密加入水15ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得到蓼大青叶配方颗粒供试品溶液。
5、特征峰的指认
分别取鸟苷、尿苷、腺苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇水溶液制成每1ml含20μg鸟苷、20μg尿苷、20μg腺苷的溶液，得到鸟苷对照品溶液、尿苷对照品溶液和腺苷对照品溶液。按照本实验例第4(4)项确定的供试品溶液制备方法制得蓼大青叶配方颗粒供试品溶液，将鸟苷对照品溶液、尿苷对照品溶液、腺苷对照品溶液及蓼大青叶配方颗粒供试品溶液，按上述方法三的色谱条件进行检测比对，结果如图7。
小结：蓼大青叶配方颗粒供试品色谱图中3号峰、5号峰、7号峰分别与尿苷、鸟苷、腺苷对照品色谱峰图谱保留时间一致，可确认3号峰为尿苷、5号峰为鸟苷、7号峰为腺苷。
6、特征峰的确定及对照图谱的建立
(1)构建方法
取8批蓼大青叶配方颗粒分别按照下述方法制备供试品溶液，精密称取蓼大青叶配方颗粒，研细，取约0.1g，置具塞锥形瓶中，精密加入水15ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得到蓼大青叶配方颗粒供试品溶液。
对上述8批蓼大青叶配方颗粒供试品溶液进行高效液相色谱法检测：AgilentZORBAX Bonus-RP(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按下表规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为260nm。理论板数按鸟苷峰计算应不低于3000，各溶液进样量均为10μl。
表11梯度程序
Figure BDA0003603659280000101
结果如图8所示，其中S1(10)-S8(10)为8批蓼大青叶配方颗粒供试品溶液的特征图谱。
(2)采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对8批样品进行合成，建立了蓼大青叶配方颗粒特征图谱的对照图谱(即对照特征图谱)，见图9所示，根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了10个重复性较好的峰作为特征峰。5号峰为鸟苷参照物峰(S峰)，各特征峰与S峰的相对保留时间为0.34(峰1)、0.39(峰2)、0.48(峰3)、0.58(峰4)、1.00(峰5)、1.09(峰6)、1.46(峰7)、2.30(峰8)、2.35(峰9)、2.47(峰10)。
因此规定：供试品特征图谱中应呈现10个特征峰，以5号峰为参照峰(S峰)，各特征峰与S峰的相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.34(峰1)、0.39(峰2)、0.48(峰3)、0.58(峰4)、1.00(峰5)、1.09(峰6)、1.46(峰7)、2.30(峰8)、2.35(峰9)、2.47(峰10)。
(3)相似度计算
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)计算8批蓼大青叶配方颗粒的相似度，结果见表12。
表12相似度结果
Figure BDA0003603659280000102
Figure BDA0003603659280000111
各批次蓼大青叶配方颗粒的相似度均大于0.99。
实验例2方法学验证
1、重复性
取蓼大青叶配方颗粒6份，按照实施例1的方法测定，获得其特征图谱，以5号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。结果如表13、表14所示。
表13蓼大青叶重复性考察保留时间及相对保留时间
Figure BDA0003603659280000112
表14蓼大青叶重复性考察峰面积及相对峰面积
Figure BDA0003603659280000113
Figure BDA0003603659280000121
小结：根据重复性考察结果，各特征峰的相对保留时间RSD为0.0％～0.5％，相对峰面积的RSD在0.0％～3.2％范围内，表明该特征图谱的重复性较好。
2、中间精密度
采用另一台高效液相色谱仪，取蓼大青叶配方颗粒6份，按照实施例1的方法测定，获得其特征图谱，以5号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。结果如表15～18所示。
表15蓼大青叶中间精密度考察保留时间及相对保留时间
Figure BDA0003603659280000122
表16蓼大青叶中间精密度考察峰面积及相对峰面积
Figure BDA0003603659280000123
表17不同仪器相对保留时间
Figure BDA0003603659280000124
Figure BDA0003603659280000131
表18不同仪器相对峰面积
Figure BDA0003603659280000132
小结：中间精密度结果显示：六个中间精密度实验样品的10个标识峰的相对保留时间RSD在0.0％～0.5％范围内，相对峰面积RSD在1.1％～14.4％；与重复性样品进行比较，其中间精密度的相对保留时间RSD在0.0％～2.0％范围内，相对峰面积RSD在0.0％～19.6％，由数据可知相对峰面积RSD值波动较大，因此不建议对相对峰面积做规定。
3、溶液稳定性考察
取蓼大青叶配方颗粒适量，按实施例1的方法制备蓼大青叶配方颗粒供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h，按照实施例1的方法测定，对其中的特征峰进行分析，结果表明供试品溶液在24h内稳定。见表19和表20。
表19蓼大青叶耐用性考察保留时间及相对保留时间
Figure BDA0003603659280000133
Figure BDA0003603659280000141
表20蓼大青叶耐用性考察峰面积及相对峰面积
Figure BDA0003603659280000142
小结：经过考察24小时溶液稳定性，10个标识峰的相对保留时间RSD在0.0％～0.7％范围内，相对峰面积RSD％在0.0％～2.7％，本实验所采用的蓼大青叶配方颗粒特征图谱分析方法稳定、可靠、重现性好。
4、耐用性实验
(1)不同柱温的考察
考察柱温的微小变化对检测方法的影响程度，取蓼大青叶配方颗粒适量，按实施例1的方法制备供试品溶液，分别采用28℃、30℃及32℃，其余均按照实施例1的方法对蓼大青叶配方颗粒供试品溶液进行特征图谱检测，结果表明本方法对于不同柱温的耐用性良好，见图10。
表21蓼大青叶不同柱温考察保留时间及相对保留时间
Figure BDA0003603659280000143
小结：样品中10个标识峰的相对保留时间RSD均在规定值±10％范围内，本方法对于不同柱温的耐用性良好。
(2)不同流速考察
取蓼大青叶配方颗粒适量，按实施例1的方法制备供试品溶液并测定。分别采用不同流速(0.9ml/min、1.0ml/min及1.1ml/min)，考察色谱方法对于流速的耐用性，见图11。
表22蓼大青叶不同流速考察保留时间及相对保留时间
Figure BDA0003603659280000151
小结：样品中10个标识峰的相对保留时间RSD均在规定值±10％范围内，本方法对于不同流速的耐用性良好。
实施例1
本实施例提供了一种蓼大青叶配方颗粒的特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：取蓼大青叶配方颗粒适量，研细，取约0.1g，置具塞锥形瓶中，精密加入水15ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
高效液相色谱法测试：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAXBonus-RP，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；进样量10μl，检测波长为260nm。
表23梯度程序
Figure BDA0003603659280000152
见图12和下表所示。
表24峰结果
Figure BDA0003603659280000153
Figure BDA0003603659280000161
由上表和图12可知，上述10个特征峰分离度均在1.5以上，分离效果好。
实施例2
本实施例提供了一种蓼大青叶水提取的特征图谱的构建方法，与实施例1相同，区别仅在于，将供试品替换为蓼大青叶水提取。
结果见图13及下表所示。
表25峰结果
Figure BDA0003603659280000162
由上表和图13可知，上述10个特征峰分离度均在1.5以上，分离效果好。
实施例3
本实施例提供了一种蓼大青叶标准汤剂冻干粉的特征图谱的构建方法，与实施例1相同，区别仅在于，将供试品替换为蓼大青叶标准汤剂冻干粉。
表26峰结果
Figure BDA0003603659280000163
/>
Figure BDA0003603659280000171
由上表和图14可知，上述10个特征峰分离度均在1.5以上，分离效果好。
对比例1
采用文献《大青叶及其3种类似品中靛蓝、靛玉红含量测定及其指纹图谱初步研究》第22页2.4项的方法检测本发明实施例1采用的蓼大青叶配方颗粒。采用本申请实施例1同批次蓼大青叶配方颗粒代替该文献的大青叶样品按照该文献2.4.2的方法制备供试品溶液并按该文献2.4.1的方法进行高效液相色谱分析。
得到蓼大青叶配方颗粒的特征图谱，如图15。峰结果见下表所示。
表27蓼大青叶配方颗粒的峰结果
峰 保留时间/min 峰面积 不对称度 分离度 塔板数 峰占比/％
1 3.315 42726 14937.00 1.4 30548 23.34
2 5.613 47673 5135.12 1.2 9944 26.04
3 8.618 9266 12738.76 1.3 13243 5.06
4 18.000 22922 139327.79 1.3 13243 12.52
5 27.252 7727 109472.23 1.5 103736 4.22
6 38.812 24843 81767.75 1.7 75737 13.57
从上表和图15可以看出，采用该文献的方法检测配方颗粒时，样品特征峰数量较少，特征峰主要集中在前10分钟，且色谱峰分离度较差。
对比例2
本对比例提供了一种蓼大青叶配方颗粒的特征图谱的构建方法，与实施例1的区别仅在于流动相组成不同，本对比例采用乙腈替换实施例1的甲醇，其余条件和工艺均与实施例1相同。
表28峰结果
保留时间 峰面积 分离度 拖尾 理论塔板数 峰占比/％
峰1 3.840 53867 2.3 1.12 11800 2.72
峰2 4.030 152660 1.2 1.23 8909 7.70
峰3 4.725 467239 3.7 1.16 9543 23.56
峰4 5.666 105038 4.2 1.22 9007 5.30
峰5 8.117 414931 8.2 1.13 8990 20.93
峰6 9.355 534244 3.2 1.37 8206 26.94
峰7 15.022 44323 2.6 1.05 67102 2.24
峰8 21.320 210494 1.8 0.88 330316 10.60
结果如图16和上表所示，相比于实施例1缺失了2个特征峰，并且色谱峰2的分离度低于1.5，分离效果较差。
发明所做的举例，而并非是对本发明实施方法的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (12)

1.一种蓼大青叶水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，
（1）供试品溶液的制备，采用的提取溶剂选自体积百分数为50-70%的甲醇水溶液、水或者体积百分数为65-75%的乙醇水溶液；
（2）取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相包括水和甲醇，梯度洗脱程序包括：0→10min→15min→20min→25min→35min，流动相中甲醇的体积百分数为：3%→3%→25%→55%→64%→90%。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）还满足如下1）-4）中的至少一项：
1）检测波长为258-262nm，流速为0.9-1.1mL/min，柱温为28-32℃；
2）流动相为甲醇和水的混合液；
3）所述梯度洗脱程序还包括：35min→45min，流动相中甲醇的体积百分数为：90%→90%。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）包括，称取蓼大青叶供试品，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）还满足如下A-E中的任意一项或者多项：
A、蓼大青叶供试品的质量与溶剂的体积之比为1：500~1：80；质量与体积的关系为g/mL；
B、提取方式为回流提取或者超声提取；
C、提取时间为≥10min；
D、所述固液分离选自离心或者滤膜过滤；
E、采用的提取溶剂为水。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，蓼大青叶供试品的质量与溶剂的体积之比为1：300~1：80，质量与体积的关系为g/mL。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，提取时间为15-40min。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，提取时间为15-25min。
8.根据权利要求1-7中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用鸟苷对照品、尿苷对照品和腺苷对照品中的至少一种加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照权利要求1-5中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品图谱的步骤。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，每1mL对照品溶液中含5-30µg鸟苷和/或含5-30µg尿苷和/或5-30µg腺苷；和/或，对照品溶液制备中所采用的溶剂选自甲醇或甲醇水溶液。
10.根据权利要求1-7中任一所述的构建方法，其特征在于，所述蓼大青叶水提取物和/或其制剂的特征图谱选自如下（1）-（2）中的任意一项：
（1）具有10个共有特征峰，以5号峰为参照峰，各特征峰与参照峰的相对保留时间在规定值的±10%的范围之内；峰1-峰10的规定值为：0.34、0.39、0.48、0.58、1.00、1.09、1.46、2.30、2.35、2.47；
（2）具有10个共有特征峰，以鸟苷峰为参照峰，各特征峰与参照峰的相对保留时间在规定值的±10%的范围之内；峰1-峰10的规定值为：0.34、0.39、0.48、0.58、1.00、1.09、1.46、2.30、2.35、2.47。
11.权利要求1-10中任一项所述的蓼大青叶水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法在蓼大青叶水提取物及其制剂的质量检测中的应用。
12.一种蓼大青叶水提取物及其制剂的质量检测方法，其特征在于，包括将待测蓼大青叶产品的特征图谱与蓼大青叶水提取物及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测蓼大青叶产品的特征图谱为使用待测蓼大青叶产品按照权利要求1-10中任一所述的构建方法构建得到，所述蓼大青叶水提取物及其制剂对照特征图谱选自如下（1）-（3）中的任意一项：
（1）其具有10个共有特征峰，以鸟苷峰为参照峰，各特征峰与参照峰的相对保留时间在规定值的±10%范围之内；峰1-峰10的规定值为：0.34、0.39、0.48、0.58、1.00、1.09、1.46、2.30、2.35、2.47；
（2）使用单批次或者多批次蓼大青叶水提取物和/或其制剂按照权利要求1-10中任一所述的构建方法得到的蓼大青叶水提取物和/或其制剂的特征图谱；
（3）使用多批次蓼大青叶水提取物和/或制剂按照权利要求1-10中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
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