CN113759040B - 猫爪草及其制剂特征图谱及其构建方法和猫爪草及其制剂的含量测定方法 - Google Patents
猫爪草及其制剂特征图谱及其构建方法和猫爪草及其制剂的含量测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于中药检测技术领域，具体提供了猫爪草及其制剂特征图谱及其构建方法和猫爪草及其制剂的含量测定方法，所述猫爪草及其制剂特征图谱的构建方法中，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含醋酸的水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，经大量实验筛选得到特定的洗脱程序，在该程序下得到4个共有特征峰，并实现了这些共有特征峰的很好分离，得到的特征图谱的特征峰分离度高，峰形好，基线平稳，测定成分可实现完全分离，为猫爪草及其制剂的质量检测和控制提供依据，实现对猫爪草及其制剂整体成分表征，方法操作简单，能适用于猫爪草不同的制剂类型的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种猫爪草及其制剂特征图谱及其构建方法和猫爪草及其制剂的含量测定方法。
背景技术
猫爪草为毛莨科植物小毛莨兰Ranunculus ternatus Thunb.的干燥块根，其味甘、辛，性温，归肝、肺经，具有化痰消肿,解毒散结之功效，用于瘰疬痰核,疔疮肿毒,蛇虫咬伤。近年来,猫爪草及其制剂在治疗肺结核、淋巴结核和多种癌症及淋巴瘤,取得一定疗效,已成为国家重点发展的三类药材之一。猫爪草的化学成分主要涉及挥发油、内脂类、甾醇类、不饱和脂肪酸、微量元素、多糖、氨基酸等。传统医学认为猫爪草具有化瘀散结、消肿解毒、抗菌、抗病毒的功效。主治淋巴结核等疾病。
近年来，国内外医药工作者对猫爪草的研究，尤其是在猫爪草制剂的质量控制方面研究比较简单。《中国药典》2015年版、2020年版一部项下猫爪草标准项下并无关于猫爪草的含量测定项和特征谱图项，仅采用简单的薄层鉴别和浸出物等检查项目，无高效液相色谱法对其单一指标成分含量和特征图谱进行质量控制的方法，不能实现对猫爪草产品整体质量进行准确描述和评价。
目前有文献研究报道了采用气相色谱法建立猫爪草中挥发性成分的指纹图谱，所研究的内容仅针对猫爪草药材中的一类成分，且此类成分并非猫爪草中所含有的大类成分，含量较低(参见于生等，《猫爪草药材顶空气相色谱指纹图谱研究》，治法方药，第47页-48页)。另有研究报道过采用HPLC 液相色谱法测定猫爪草中吡咯丁酸的含量，然此研究中的吡咯丁酸为实验室自制成分，不易推广(参见应弘梅等，《猫爪草中吡咯丁酸的含量测定研究》，中国药杂志，2012,02,101-103)。
于生等发表的《中药猫爪草指纹图谱分析方法的研究》，建立了猫爪草药材指纹特征图谱的共有模式，方法下尿苷峰和腺苷峰均无法良好分离，在指纹图谱中未见对照品参照峰，无法对特征峰进行准确定位，不能充分的反映猫爪草药材的整体性和特征性，而且研究发现该方法不适用于猫爪草制剂的检测，用于检测猫爪草配方颗粒时，峰形差，峰高低，分离度低，检测效果不佳。
发明内容
因此，本发明的目的在于解决现有技术中猫爪草指纹图谱的构建方法得到的指纹图谱的准确性较低、分离度不佳以及无法适用于检测猫爪草制剂的问题，提供了一种猫爪草及其制剂特征图谱及其构建方法和猫爪草及其制剂的含量测定方法。
具体的，本发明公开了猫爪草及其制剂特征图谱的构建方法，包括以下步骤，
(1)猫爪草供试品溶液的制备；
(2)取猫爪草供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含醋酸的水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→18分钟→30分钟→43分钟→54 分钟→62分钟，流动相中乙腈的体积百分比为0％→0％→1％→3％→16％→18％。
根据本发明任一项所述的构建方法，其中，步骤(1)包括：
1)称取猫爪草供试品，加溶剂提取，得到提取液；
2)将提取液固液分离，取液体，即为供试品溶液。
根据本发明任一项所述的构建方法，步骤(1)满足A-C中任意一项或者多项：
A、步骤1)中，溶剂选自水或者甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分数不大于30％；加入10-200倍量溶剂，所述倍量表示每克猫爪草供试品中加入溶剂的毫升数。优选加入20-100倍量溶剂。
B、提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为10min-5h。
优选的，提取时间为20-40min。
优选的，猫爪草供试品经研磨处理得到粉末。
C、所述固液分离独立地选自离心或者过滤；
根据本发明任一项所述的构建方法，所述步骤(1)包括：取本品0.3-0.7g，加溶剂5-15ml，超声提取10-30min，取出放凉，称定，加溶剂补足减失的重量，过滤，取续滤液，即得。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述步骤(2)包括：检测波长为258-262nm，流速为 0.75-0.85ml/min，柱温38-42℃，进样量为2-20μl。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述步骤(2)中，所述含醋酸的水溶液中所含醋酸的体积百分数为0.3-0.7％，优选为0.5％。
某些优选的实施方式中，构建方法还包括，采用尿苷和/或腺苷制备对照品溶液的步骤，以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤。
某些优选的实施方式中，构建方法还包括，采用猫爪草对照药材制备对照药材溶液的步骤，以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照药材溶液得到对照药材参照图谱的步骤。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述猫爪草及制剂选自猫爪草药材、猫爪草饮片和猫爪草制剂中的至少一种；其中猫爪草制剂是由猫爪草提取后得到的提取液(例如煎煮后得到的汤剂)按照药学上常规工艺，加入或者不加药学上常规辅料制成的中药制剂。
优选地，所述猫爪草制剂可以但不局限于干粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、软膏剂、溶液剂等。
更优选地，本发明提供的猫爪草及其制剂特征图谱的构建方法可以同时适用于猫爪草药材、猫爪草饮片、猫爪草标准汤剂冻干粉和猫爪草配方颗粒，即所述猫爪草及其制剂选自猫爪草药材、猫爪草饮片、猫爪草标准汤剂冻干粉和猫爪草配方颗粒中的至少一种。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取尿苷、腺苷对照品，加溶剂制成每1ml含尿苷15-45μg、腺苷15-45μg的对照品溶液。
优选的，所述溶剂选自水或者甲醇水溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数不大于30％。
优选的，所述梯度洗脱程序还包括62分钟→64分钟→66分钟，流动相中乙腈的体积百分比为 18％→0％→0％。
根据本发明任一项所述的构建方法，对照药材溶液的制备方法包括如下步骤：取猫爪草对照药材制备加水煎煮，固液分离，取上清液，干燥后按照与供试品溶液同法制得对照药材溶液。
本发明还提供了一种猫爪草及其制剂的特征图谱，由上述任一所述的构建方法得到。
本发明还提供了一种猫爪草及其制剂的特征图谱，所述特征图谱的特征峰至少包括尿苷峰和腺苷峰。
本发明还提供了一种猫爪草及其制剂的特征图谱，所述特征图谱的特征峰包括4个特征峰，以1 号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；规定值为：1.00(峰 1)、2.15(峰2)、2.34(峰3)、5.21(峰4)。
本发明还提供了一种猫爪草及其制剂的对照特征图谱，其具有4个共有特征峰，所述特征图谱的特征峰包括4个特征峰，以1号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；规定值为：1.00(峰1)、2.15(峰2)、2.34(峰3)、5.21(峰4)；
本发明还提供了一种猫爪草及其制剂的对照特征图谱，其具有4个共有特征峰，所述特征图谱的特征峰包括4个特征峰，以1号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；规定值为：1.00(峰1)、2.15(峰2)、2.34(峰3)、5.21(峰4)；而且其中有1-2个特征峰分别与1-2个对照品参照峰相对应；所述对照品参照图谱为权利要求4所述的对照品参照图谱；
本发明中，相对应是指两个峰的保留时间的RSD<5％、<3％或者1％。和/或，相对应是指两个峰重合度不小于50％。
本发明中，猫爪草及其制剂的对照特征图谱还可以使用多批次猫爪草药材、猫爪草饮片或者猫爪草制剂按照本发明任一所述的构建方法得到的特征图谱；可选的，猫爪草及其制剂的对照特征图谱还可以使用多批次猫爪草、猫爪草饮片或者猫爪草制剂按照本发明任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
可选的，至少采用15批猫爪草药材、猫爪草饮片或者猫爪草制剂得到对照特征谱图，例如采用 15个批次的猫爪草药材、18批猫爪草标准汤剂冻干粉。
本发明还提供了一种猫爪草及其制剂中尿苷的含量测定方法，包括如下步骤：
猫爪草供试品溶液的制备；
尿苷对照品溶液的制备；
测试步骤：取猫爪草供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含醋酸的水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→18分钟→30 分钟→43分钟→54分钟→62分钟，流动相中乙腈的体积百分比为0％→0％→1％→3％→16％→18％。
作为具体的实施方式，所述猫爪供试品溶液是按照本发明任一所述的猫爪草及其制剂特征图谱的构建方法中的步骤(1)的方法进行制备；所述测试步骤是按照本发明任一所述的猫爪草及其制剂特征图谱的构建方法中的步骤(2)的方法进行测试。
本发明还提供了本发明的猫爪草及其制剂特征图谱的构建方法和/或本发明的猫爪草及其制剂的对照特征图谱和/或猫爪草及其制剂中尿苷的含量测定方法在猫爪草产品的质量检测中的用途。
本发明还提供了一种猫爪草及其制剂的质量检测方法，包括将待测猫爪草产品的特征图谱与猫爪草及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测猫爪草产品的特征图谱为使用待测猫爪草产品按照本发明任一所述的构建方法得到，所述猫爪草及其制剂的对照特征图谱为本发明所述的猫爪草及其制剂的对照特征图谱；和/或，包括按照本发明所述的猫爪草及其制剂中尿苷的含量测定方法测定待测猫爪草产品中尿苷的含量的步骤。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述猫爪草产品选自猫爪草药材、猫爪草饮片和猫爪草制剂中的至少一种；其中猫爪草制剂是由猫爪草提取后得到的提取液(例如煎煮后得到的汤剂)按照药学上常规工艺，加入或者不加药学上常规辅料制成的中药制剂。优选地，所述猫爪草制剂可以但不局限于干粉剂、胶囊剂、片剂、软膏剂、溶液剂、颗粒剂等。更优选地，本发明提供的猫爪草产品选自猫爪草药材、猫爪草饮片、猫爪草标准汤剂冻干粉和猫爪草配方颗粒中的至少一种。
某些实施方式中，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成猫爪草及其制剂的对照特征图谱。
某些优选的实施方式中，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成猫爪草及其制剂的对照特征图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。
本发明中，0.5％醋酸是指含0.5％(体积百分数)醋酸的水溶液。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的猫爪草及其制剂特征图谱的构建方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含醋酸的水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，经大量实验筛选得到特定的洗脱程序，得到4个共有特征峰，并实现了这些共有特征峰的很好分离，得到的特征图谱中包含尿苷和腺苷的特征峰均得到有效分离，峰形好，基线平稳，测定成分可实现完全分离，为猫爪草及其制剂的质量检测和控制提供依据，能充分的反映猫爪草药材的整体性和特征性，方法操作简单，能适用于猫爪草不同的制剂类型的质量控制。
2.本发明提供的猫爪草及其制剂特征图谱的构建方法，经对照品指认，1号峰为尿苷峰，3号峰为腺苷峰，分离均良好，面积适中，尤其是1号峰，以它为参照可通过定性方式实现猫爪草质控的精确性。特征图谱中确定的4个特征峰为18批不同产地不同批次的猫爪草制剂的稳定共有峰，能很好的保证该方法应用于猫爪草质控方面的准确性；并且这4个特征峰峰形、峰的分离效果和峰对称性均较好，能很好的对特征峰的保留时间和相对保留时间进行控制，大大提升了该方法的重现性与适用性。
3.本发明提供的猫爪草及其制剂中尿苷的含量测定方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含醋酸的水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，经大量实验筛选得到特定的洗脱程序，在该梯度下可准确地测定猫爪草及其制剂中有效成分即尿苷的含量，在0.00766-0.19144mg/ml范围内线性满足分析要求，定量限低，且具有重现性好、稳定性好、准确度高、分析速率快的优点。
4.本发明提供的猫爪草制剂的检测方法，包括特征图谱构建方法和尿苷含量测试方法，既能定量控制猫爪草药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中指标成分的物质传递，又能整体控制猫爪草药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征成分质量的稳定，且方法操作简单，精密度高、稳定性好、重复性好、准确度高、分析速率快。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例1中对照品种类的考察的色谱图；
图2为本发明实验例1中方法一的梯度条件下的色谱图；
图3为本发明实验例1中方法二的梯度条件下的色谱图；
图4为本发明实验例1中猫爪草标准汤剂冻干粉延迟性谱图；
图5为本发明实验例1中18批猫爪草标准汤剂冻干粉特征图谱及共有模式图；
图6为本发明实验例1中猫爪草标准汤剂冻干粉的对照特征图谱；
图7和8为本发明实验例3中尿苷含量测定检测波长的选择；
图9和10为本发明实验例3中尿苷峰纯度的检测图谱；
图11为本发明实验例5专属性考察中猫爪草标准汤剂冻干粉供试品的色谱图；
图12为本发明实验例5专属性考察中猫爪草供试品的色谱图；
图13为本发明实验例5专属性考察中尿苷对照品的色谱图；
图14为本发明实验例5专属性考察中腺苷对照品的色谱图；
图15为本发明实验例5专属性考察中10％甲醇阴性对照的色谱图；
图16为本发明实验例5专属性考察中辅料糊精阴性对照的色谱图；
图17为本发明实验例5线性关系示意图；
图18为本发明实施例1中猫爪草药材特征图谱；
图19为本发明实施例2中猫爪草饮片特征图谱；
图20为本发明实施例3中猫爪草标准汤剂冻干粉特征图谱；
图21为本发明实施例4中猫爪草配方颗粒特征图谱；
图22为本发明实施例5中猫爪草标准汤剂冻干粉特征图谱；
图23为对比例1中猫爪草药材特征图谱；
图24为对比例2中猫爪草标准汤剂冻干粉特征图谱；
图25为对比例3中猫爪草标准汤剂冻干粉特征图谱。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实验例1
1、仪器与试药：
Waters高效液相色谱仪，配有TUV检测器等，甲醇与乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯；猫爪草对照药材(批号：121593-201202，来源中国食品药品检定研究院)；尿苷对照品(批号： 110887-201803，纯度99.5％,来源中国食品药品检定研究院)；腺苷对照品(批号：110879-201703，来源中国食品药品检定研究院)；猫爪草药材来源：见下表。
表1猫爪草各批样品信息
猫爪草饮片采用上述猫爪草药材按照《中国药典》的方法制备。
猫爪草标准汤剂冻干粉的制备方法如下：置于砂锅中，浸泡30分钟，一煎加入饮片量8倍水(每克饮片加水8毫升)，武火煮沸后，文火煎煮30分钟，趁热过滤，迅速冷却，备用；二煎加饮片量6 倍水(每克饮片加水6毫升)，武火煮沸后，文火煎煮25分钟，趁热过滤，迅速冷却备用；合并滤液，浓缩(65℃)，浓缩至料液比约为1:1(相对密度为1.05-1.10(65℃))，冷冻干燥，即得。
猫爪草配方颗粒的制备方法如下：取猫爪草饮片，沸腾(100℃)提取两次，一煎加入饮片量12 倍水(每克饮片加水12毫升)，二煎加入饮片量10倍水(每克饮片加水10毫升)，每次0.5小时， 200目滤布趁热过滤，合并滤液65℃减压浓缩，至相对密度为1.05g/ml(60℃)，喷雾干燥，进风温度设定为175℃以下，粉碎，干法制粒。
2、猫爪草制剂特征图谱的构建
(1)对照品溶液的制备：取尿苷、腺苷对照品适量，精密称定，加体积百分数为10％的甲醇水溶液制成每1ml含尿苷30μg、腺苷30μg的对照品溶液；
(2)对照药材溶液的制备：取猫爪草对照药材1.0g，加水50ml，煎煮45min，离心取上清液减压旋蒸至干，精密加入体积百分数为10％的甲醇水溶液10ml，超声20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材溶液；
(3)供试品溶液制备：取猫爪草标准汤剂冻干粉0.5g，精密称定，精密加入体积百分数为10％的甲醇水溶液10ml，称定重量，(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(4)高效液相法检测：以十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱(
HSST3色谱柱， 4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动性A，以含0.5vt％醋酸的水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱，检测波长为260nm；柱温40℃；流速为每分钟0.8ml。理论板数按尿苷峰计算应不低于4000。
表2梯度洗脱条件
得到猫爪草制剂的特征图谱，该特征图谱具有4个共有特征峰，以1号峰为参比峰(1S)，各特征峰与1号峰的相对保留时间的比值为：1.00(峰1S)、2.15(峰2)、2.34(峰3)、5.21(峰4)，这 4个峰构成了猫爪草制剂的指纹特征，可作为猫爪草制剂的对照特征图谱。
3、对照品种类的考察
分别取鸟苷、肌苷、豆甾醇、L-色氨酸对照品适量，精密称定，加体积百分数为10％的甲醇水溶液，分别制成每1ml含鸟苷40μg的对照品溶液，每1ml含肌苷30μg的对照品溶液，每1ml含豆甾醇20μg的对照品溶液，每1ml含L-色氨酸30μg的对照品溶液，每1ml含尿苷30μg的对照品溶液和含腺苷30μg的对照品溶液，将各对照品溶液按照本实施例第2项的色谱条件进行测试。
结果见图1所示，图1中，1为L-色氨酸；2为肌苷；3为豆甾醇；4为鸟苷；5为猫爪草样品溶液，结果显示，供试品色谱中L-色氨酸、肌苷、豆甾醇和鸟苷峰不显示，或者峰形差、分离度低。
4、洗脱梯度程序确定
取同一份猫爪草标准汤剂冻干粉供试品溶液，考察不同的梯度程序对猫爪草标准汤剂冻干粉的分离效果的影响，除了梯度程序之外，其余工艺和条件均与本实验例第2项相同，梯度洗脱条件见表 3-4，结果见表5所示。
表3梯度洗脱表(方法一)
| 时间min | 乙腈％ | 0.5％醋酸 |
| 0～10 | 0 | 100 |
| 10～30 | 0 | 100 |
| 30～45 | 0-25 | 100-75 |
| 45～50 | 25-60 | 75-40 |
表4梯度洗脱表(方法二)
| 时间min | 乙腈％ | 0.5％醋酸 |
| 0～13 | 0 | 100 |
| 13～25 | 0-1 | 100-99 |
| 25～37 | 1-3 | 99-97 |
| 37～52 | 3-15 | 97-85 |
| 52～60 | 15-18 | 85-82 |
| 60～64 | 18-0 | 82-100 |
表5各梯度色谱峰系统适用性参数
由上表和图2-3可知，方法一的梯度条件下，该方法所得到的6个特征峰均未能实现基线分离，且相邻的色谱峰较近，需要进一步进行调整。
方法二的梯度条件下，经过方法调整，猫爪草液相特征图谱中的色谱峰相比于方法一，进一步实现了分离，峰1和峰2的色谱峰峰形也有所改善，峰3和峰4需要延长保留时间，保证色谱峰可以基线分离，并互不影响，然而各特征峰分离度较低，需要进一步进行调整。
5、延迟性实验
取猫爪草标准汤剂冻干粉按照本实验例第2项步骤(3)制得供试品溶液，按本实验例第2项步骤(4)的色谱条件进样，记录2倍流动相保留时间色谱图，结果见图4。
小结：从图4中可以看出，在60分钟之后没有明显的滞后峰出现，此色谱方法符合分析要求。
6、系统适用性试验
重复检测5次本实验例第2项的方法，以尿苷峰为参照，进行系统适用性试验，其结果见表6。
表6系统适用性试验结果
小结：尿苷峰理论板数、分离度、拖尾因子及重复性均符合分析要求。
7、特征峰确认
分别取18批猫爪草标准汤剂冻干粉，按照本实验例第2项步骤(3)中的方法制备猫爪草标准汤剂冻干粉供试品溶液，并按照步骤(4)的色谱条件测定，见表7、图5，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.1版本)，以S1液相图谱为参照图谱，按中位数计算，得出猫爪草标准汤剂冻干粉对照图谱，并进行共有峰的标识，见图6。
表7猫爪草标准汤剂冻干粉样品列表
小结：使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.1版本)，对18批猫爪草标准汤剂冻干粉进行共有峰标识，共标识4个共有峰。
9、相似度
使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.1版本)，计算18批猫爪草标准汤剂的特征图谱与对照特征图谱的相似度，其结果见表8。
表8相似度计算结果
小结：18批猫爪草标准汤剂冻干粉特征图谱与对照特征图谱的相似度为0.919～0.998，均高于 0.90，表明图谱的差异较小。
10、相对保留时间
对18批猫爪草标准汤剂特征图谱进行数据处理，其结果表9。
表9 18批猫爪草标准汤剂相对保留时间表
小结：由18批猫爪草标准汤剂冻干粉特征图谱可知，各特征峰相对保留时间差异较小，均在±10％范围内，符合质量控制要求，选择相对保留时间的平均值作为测定值；规定值为：1.00(峰1S)、2.15 (峰2)、2.34(峰3)、5.21(峰4)，允许误差：±10％。
实验例2方法学验证
1、精密度
(1)重复性
取猫爪草标准汤剂冻干粉(批号：200602-464400-01)6份，按实验例1第2项下的方法制备供试品溶液并进行高效液相法检测，获得其特征图谱，以1号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD，结果显示，各特征峰的相对保留时间RSD在0.0％～0.1％范围内，相对峰面积的RSD在0.2％～0.4％范围内，表明该特征图谱的重复性较好。
(2)中间精密度
采用Waters e2695，TUV检测器，取猫爪草标准汤剂冻干粉(批号：200602-464400-01)6份，按实验例1第2项下的方法制备供试品溶液并进行高效液相法检测，获得其特征图谱，以1号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。结果显示，采用Waters UPLC H-Class，TUV 检测器获得的特征图谱中，各特征峰的相对保留时间RSD在0.0％～0.01％范围内，相对峰面积的RSD 在0.3％～1.1％范围内。不同仪器间相对保留时间RSD范围是0.0％～0.01％，相对峰面积RSD％范围是 0.0％～0.1％，表明该特征图谱的在不同仪器间相对峰面积符合分析要求。
2、稳定性
取猫爪草标准汤剂冻干粉(200602-464400-01)，按正文方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、 6、8、12、24h按实验例1第2项下的方法制备供试品溶液并进行高效液相法检测，获得其特征图谱，以1号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。结果显示，溶液中化学成分在24小时稳定性，各特征峰的相对保留时间RSD在0.1％～0.2％范围内，相对峰面积的RSD在 0.6％～1.6％范围内。
实验例3含量测定方法中色谱条件的考察
1、仪器与试药
与实验例1相同。
2、猫爪草制剂中尿苷含量的测试方法
(1)对照品溶液的制备：取尿苷对照品适量，精密称定，加体积百分数为10％的甲醇水溶液制成每1ml含尿苷30μg的对照品溶液；
(2)供试品溶液制备：取猫爪草标准汤剂冻干粉0.5g，精密称定，精密加入体积百分数为10％的甲醇水溶液10ml，称定重量，(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)高效液相法检测：以十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱(
HSST3色谱柱， 4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动性A，以含0.5vt％醋酸的水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱，检测波长为260nm；柱温40℃；流速为每分钟0.8ml。理论板数按尿苷峰计算应不低于4000。
表10梯度洗脱条件
3、波长选择
本实验例第2项下的方法制备尿苷对照品溶液，利用二极管阵列检测器进行检测，确定尿苷的最大吸收波长260nm为检测波长，见图7-8。
4、峰纯度的检验
分别取猫爪草标准汤剂冻干粉和猫爪草按照本实验例第2项下的方法制备供试品溶液，利用二极管阵列检测器对尿苷峰进行峰纯度检验，见表11、图9-10。
表11猫爪草标准汤剂冻干粉和猫爪草尿苷峰纯度表
结果显示，猫爪草标准汤剂冻干粉和猫爪草的色谱图中，尿苷的3点指数相接近，且趋近于0，表明该方法获得的尿苷峰纯度符合分析要求。
5、系统适用性
本实验例第2项下的方法制备尿苷对照品溶液并在本实验例第2项下下高效液相色谱法的条件下，进行系统适用性试验，其结果见表12。
表12系统适用性试验结果
结果显示，对照品尿苷理论板数为19336.2、拖尾因子为0.2、重复性RSD值为0.1，样品中尿苷峰的分离度RSD值为0.9，系统适用性符合分析要求。
实验例4供试品溶液的制备方法考察
供试品溶液的制备方法参考猫爪草所含的化学成分种类，对提取溶剂的类型、溶液的浓度、提取方式和提取时间进行了考察。
1、提取溶剂的考察
分别取同一批猫爪草标准汤剂冻干粉七份，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入适当溶剂(50％乙醇、10％乙醇、乙醇、水、50％甲醇、10％甲醇、甲醇)20ml，分别取同一批猫爪草五份，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入适当溶剂(70％乙醇、10％乙醇、乙醇、水、70％甲醇、10％甲醇、甲醇)20ml；密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30 分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液 20μl，注入高效液相色谱仪，按实验例3第2项的色谱条件测定，测定峰面积，计算尿苷的含量，结果见表13。
表13不同提取溶剂的比较
小结：以上结果表明，除10％甲醇和水外的各提取溶剂对尿苷含量色谱峰有较大的影响，尿苷的分离度均没有达到分析要求，而采用水和10％甲醇提取，尿苷的分离度满足分析要求，两者含量一致，考虑到供试品溶液的保存，故确定提取溶剂为10％甲醇。
2、提取浓度的考察
分别取猫爪草标准汤剂冻干粉和猫爪草适量，研细，分别取约0.1g、0.2g、0.5g、0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入10％甲醇20ml、20ml、20ml、10ml，制成样品稀释倍数是0.01g/ml 浓度的0.5倍、1倍、2.5倍、5倍，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，精密吸取续滤液 20μl，注入高效液相色谱仪，按实验例3第2项的色谱条件测定，测定峰面积，计算尿苷的含量。结果见表14所示。
表14猫爪草标准汤剂冻干粉提取浓度的比较
小结：以上结果表明，采用0.05g/ml的浓度提取可以将猫爪草标准汤剂冻干粉中的尿苷提取充分，因此确定取样量为0.5g，提取溶剂量为10ml。
3、提取时间的考察
分别称取同一批猫爪草标准汤剂冻干粉三份和同一批猫爪草三份，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入10％甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz) 一定时间(20分钟、30分钟、40分钟)，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，精密吸取续滤液20μl，注入高效液相色谱仪，按实验例3第2项的色谱条件测定，测定峰面积，计算尿苷的含量，结果见表15和16。
表15猫爪草标准汤剂冻干粉提取时间的比较
小结：以上结果表明，不同超声时间所获得的供试品溶液中尿苷含量差异不大，考虑到样品处理过程迅速、有效，因此确定提取时间为20分钟。
表16提取时间的比较
小结：以上结果表明，不同超声时间所获得的供试品溶液中尿苷含量差异不大，超声时间为40 分钟所得尿苷的含量最高，为保证尿苷成分提取充分，因此确定提取时间为40分钟。
4、提取方式的考察
分别称取同一批猫爪草标准汤剂冻干粉二份和猫爪草二份，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入10％甲醇20ml，密塞，称定重量，采用不同的提取方式：超声处理(功率250W，频率40kHz)、加热回流；提取时间都为30分钟，取出，放冷，称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，精密吸取续滤液20μl，注入高效液相色谱仪，按实验例3第2 项的色谱条件测定，测定峰面积，计算尿苷的含量，结果见表17。
表17猫爪草标准汤剂冻干粉不同提取方式的比较
表18猫爪草不同提取方式的比较
以上结果表明，不同提取方式所获得的供试品溶液中尿苷的含量以超声处理略高，从实验操作的简单性考虑，确定采用超声处理作为供试品溶液制备的提取方式。
实验例5含量测试的方法学验证
1、准确度
取尿苷对照品适量，精密称定，加体积百分数为10％甲醇制成每1ml含17.9μg的溶液，作为对品溶液①，取尿苷对照品适量，精密称定，加体积百分数为10％甲醇制成每1ml含53.1μg的溶液，作为对品溶液②。
取已知含量的猫爪草标准汤剂冻干粉(200602-464400-01，尿苷含量为0.70mg/g)9份，每份约 0.25g，分别作为供试品，其中三份以腺苷的质量比为1:0.5的比例加入对品溶液①5ml和体积百分数为10％甲醇溶液5ml，另取三份以1:1的比例加入对品溶液①10ml，另取三份以1:1.5的比例加入对品溶液②和10％甲醇溶液5ml，按实验例3第2项的色谱条件测定。
表19回收率试验结果表
结果显示，回收率试验所测得的回收率范围为97.4％～103.3％，平均回收率为99.6％，RSD值为 1.9％，符合方法学验证回收率要求，表明利用该方法测得的结果准确。
取已知含量的猫爪草药材(200602-464400-01，尿苷含量为0.34mg/g)9份，每份约0.25g，精密称定，分别作为供试品，其中三份以腺苷的质量比为1:0.5的比例加入对品溶液①5ml和体积百分数为10％甲醇溶液5ml，另取三份以1:1的比例加入对品溶液①10ml，另取三份以1:1.5的比例加入对品溶液②和10％甲醇溶液5ml，按实验例3第2项的色谱条件测定。
表20回收率试验结果表
结果显示，回收率试验所测得的回收率范围为96.7％～103.1％，平均回收率为100.8％，RSD值为2.1％，符合方法学验证回收率要求，表明利用该方法测得的结果准确。
2、精密度
(1)重复性：取猫爪草标准汤剂冻干粉(批号：200602-464400-01)6份，按实验例3第2项的方法测定，所测得猫爪草标准汤剂冻干粉中尿苷平均含量为0.70mg/g，其RSD为0.6％，符合方法学验证重复性要求。取猫爪草药材(批号：200602-464400-01)6份，按正文方法测定，结果显示，重复性试验所测得猫爪草药材中尿苷平均含量为0.34mg/g，其RSD为1.9％，符合方法学验证重复性要求。
(2)中间精密度：不同分析人员在不同时间利用另一台Waters e2695液相色谱仪(TUV检测器) 进行中间精密度试验。取猫爪草标准汤剂冻干粉(批号：200602-464400-01)6份，按实验例3第2 项的方法进行测定，所测得猫爪草标准汤剂冻干粉中的尿苷平均含量为0.73mg/g，RSD值为0.7％，与重复性试验的检测结果的RSD为3.3％，符合方法学验证精密度要求。不同分析人员在不同时间利用另一台Waters e2695液相色谱仪(TUV检测器)进行中间精密度试验。取猫爪草药材(批号： 200602-464400-01)6份，按正文方法进行测定，结果显示，中间精密度试验所测得猫爪草药材中的尿苷平均含量为0.35mg/g，RSD值为1.9％，与重复性试验的检测结果的RSD为2.0％，符合方法学验证精密度要求。
3、专属性
取猫爪草配方颗粒所使用的辅料(糊精)适量，按实验例3第2项的供试品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液；取猫爪草标准汤剂冻干粉供试品溶液、猫爪草对照药材对照品溶液、尿苷对照品溶液、腺苷对照品溶液、10％甲醇阴性对照溶液、辅料糊精对照溶液按实验例3第2项的方法获得其色谱图，其结果见图11～图16。
4、线性
取尿苷对照品适量，加10％甲醇制成每1ml含0.1914mg的溶液，作为尿苷对照品母液，记作⑥；精密吸取尿苷对照品母液1ml置于25容量瓶中，其余分别精密吸取尿苷对照品母液2ml、3ml、5ml、 7ml，置于10ml容量瓶中，均加10％甲醇至刻度，摇匀，滤过，分别记作①～①，精密吸取①～⑥续滤液10μl，注入高效液相色谱仪，按实验例3第2项的方法测定尿苷色谱峰峰面积，以尿苷色谱峰的峰面积为纵坐标，尿苷的浓度为横坐标，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归，求得回归方程为y＝29238036.75x+6892.28，R＝1.0，其线性范围为0.00766-0.19144mg/ml，见图17。
5、耐用性
(1)稳定性考察：取猫爪草药材(200602-464400-01)和猫爪草标准汤剂冻干粉(200602-464400-01)，分别按实验例3第2项的方法制备供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、 10h、12h、24h按实验例3第2项的方法进行测定，记录尿苷峰峰面积的变化情况。
结果显示，24小时内猫爪草标准汤剂冻干粉的尿苷峰的峰面积RSD值为0.4％，24小时内猫爪草的尿苷峰的峰面积RSD值为4.1％，符合系统适用性试验要求，表明尿苷成分在24小时内稳定性较好。
(2)不同柱温的考察：取猫爪草药材(批号：200602-464400-01)和取猫爪草标准汤剂冻干粉 (批号：200602-464400-01)，分别按实验例3第2项的供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，分别于不同柱温(38℃、40℃及42℃)按实验例3第2项的方法进行测定，考察实验方法对于柱温的耐用性。结果显示，不同柱温下获得的色谱图，尿苷峰的理论板数、拖尾因子、分离度均符合系统适用性要求；测得尿苷的含量RSD值为0.8％和1.2％，符合系统适用性要求。表明该方法对柱温耐用性较好。
(3)不同流速的考察：取猫爪草标准汤剂冻干粉(批号：200602-464400-01)和猫爪草药材(批号：200602-464400-01)分别按实验例3第2项供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，分别采用不同流速(0.6ml/min、0.8ml/min及1.0ml/min)按实验例3第2项的方法进行测定，考察实验方法对于流速的耐用性。结果显示，采用不同流速获得的色谱图，尿苷峰的理论板数、拖尾因子、分离度均符合系统适用性要求；测得尿苷的含量RSD值为0.4％和6.2％，符合系统适用性要求。表明该方法对流速耐用性较好。
(4)不同色谱柱的考察：取猫爪草标准汤剂冻干粉(200602-464400-01)和猫爪草药材(批号： 200602-464400-01)分别按实验例3第2项的方法制备供试品溶液液，采用不同型号色谱柱按实验例 3第2项的方法进行测定，考察实验方法对于不同色谱柱的耐用性。
固定相：Waters 
HSS T3(4.6*250mm，5μm)，SN：0143909213224；
岛津Shim-pack GIST C18-AQ(4.6*250mm，5μm)；
Waters 
HSS T3(4.6*250mm，5μm)，SN：01253635615002。
结果显示，采用不同色谱柱获得的色谱图，尿苷峰的理论板数、拖尾因子、分离度均符合系统适用性要求；测得尿苷的含量RSD值为1.6％，符合系统适用性要求。表明该方法对不同色谱柱耐用性较好。
(5)不同酸浓度的考察：取猫爪草标准汤剂冻干粉(批号：200602-464400-01)和猫爪草药材 (批号：200602-464400-01)分别按实验例3第2项供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，分别采用不同醋酸浓度溶液(0.3％、0.5％及0.7％)按实验例3第2项的方法进行测定，考察实验方法对于酸浓度的耐用性。结果显示，采用不同浓度的醋酸溶液作为流动相获得的色谱图，尿苷峰的理论板数、拖尾因子、分离度均符合系统适用性要求；测得尿苷的含量RSD值为0.7％和0.6％，符合系统适用性要求。表明该方法对酸浓度耐用性较好。
6、样品检测数据
分别按实验例3第2项方法测定各批次药材、饮片、标准汤剂冻干粉以及颗粒中的尿苷的含量，结果如下表所示。
表21猫爪草样品含测数据
实施例1猫爪草药材
本实施例提供了一种猫爪草药材特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液制备：取猫爪草药材粉末(过三号筛)0.5g，精密称定，精密加入体积百分数为10％的甲醇水溶液10ml，称定重量，(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用 10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)高效液相法检测：以十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱(具体型号：
HSST3色谱柱，4.6*250mm，5μm)；以乙腈为流动性A，以含0.5vt％醋酸的水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱，检测波长为260nm；柱温40℃；流速为每分钟0.8ml。理论板数按尿苷峰计算应不低于4000，得到猫爪草药材的特征图谱。
表22梯度洗脱条件
如图18所示，该特征图谱具有4个特征峰，以1号峰为参比峰(1S)，各特征峰与1号峰的相对保留时间的比值为：1.00(峰1S)、2.14(峰2)、2.35(峰3)、5.29(峰4)，峰结果见表23所示。
表23峰结果
由上表和图18可知，上述4个特征峰分离度均在1.5％以上，且各峰高均匀，峰形好。各峰面积占总面积比值在0.01％～0.55％之间。
实施例2猫爪草饮片
本实施例提供了一种猫爪草饮片特征图谱的构建方法，与实施例1的区别仅在于供试品采用猫爪草饮片替换掉猫爪草药材，取猫爪草饮片粉碎成粉末为供试品，其余工艺条件均与实施例1相同，得到猫爪草饮片特征图谱，见图19，该特征图谱具有4个共有特征峰，以1号峰为参比峰(1S)，各特征峰与1号峰的相对保留时间的比值为：1.00(峰1S)2.13(峰2)、2.34(峰3)、5.30(峰4)，这4 个峰构成了猫爪草制剂的指纹特征，可作为猫爪草制剂的对照特征图谱。
4个特征峰分离度均在1.5％以上，且各峰高均匀，峰形好。各峰面积占总面积比值在0.03％～0.57％之间。
实施例3猫爪草标准汤剂冻干粉
本实施例提供了一种猫爪草标准汤剂冻干粉特征图谱的构建方法，与实施例1的区别仅在于采用猫爪草标准汤剂冻干粉替换掉猫爪草药材为供试品，其余工艺条件均与实施例1相同，得到猫爪草饮片特征图谱，见图20，该特征图谱具有4个共有特征峰，以1号峰为参比峰(1S)，各特征峰与1号峰的相对保留时间的比值为：1.00(峰1S)0.16(峰2)、0.61(峰3)、0.14(峰4)，这4个峰构成了猫爪草制剂的指纹特征，可作为猫爪草制剂的对照特征图谱。
4个特征峰分离度均在1.5％以上，且各峰高均匀，峰形好。各峰面积占总面积比值在0.08％～0.53％之间。
实施例4猫爪草配方颗粒
本实施例提供了一种猫爪草配方颗粒特征图谱的构建方法，与实施例1的区别仅在于供试品采用猫爪草配方颗粒替换掉猫爪草药材，取猫爪草配方颗粒研磨为粉末为供试品，其余工艺条件均与实施例1相同，得到猫爪草颗粒特征图谱，见图21，该特征图谱具有4个共有特征峰，以1号峰为参比峰(1S)，各特征峰与1号峰的相对保留时间的比值为：1.00(峰1S)2.12(峰2)、2.33(峰3)、5.50 (峰4)，这4个峰构成了猫爪草制剂的指纹特征，可作为猫爪草制剂的对照特征图谱。
4个特征峰分离度均在1.5％以上，且各峰高均匀，峰形好。各峰面积占总面积比值在0.08％～0.48％之间。
实施例5乙腈-水
本实施例提供了一种猫爪草标准汤剂冻干粉的构建方法，基本与实施例3相同，区别仅在于流动相B不同，本实施例采用以水为流动相B，得到猫爪草特征图谱，结果见图22。该特征图谱具有4 个共有特征峰，以1号峰为参比峰(1S)，各特征峰与1号峰的相对保留时间的比值为：1.00(峰1S) 2.02(峰2)、3.11(峰3)、5.47峰4)，这4个峰构成了猫爪草制剂的指纹特征，可作为猫爪草制剂的对照特征图谱。
由附图比较可知，对于供试品溶液采用的乙腈-水和乙腈-0.5％醋酸流动相体系所呈现出的色谱图差异不大，在保留时间上略有差异，但乙腈-0.5％醋酸系统使色谱峰的分离度更好，色谱信息更全面。
对比例1猫爪草药材
本对比例提供了一种猫爪草药材特征图谱的构建方法，按照《中药材猫爪草指纹图谱分析方法的研究(I)》文献中公开的方法进行。
具体包括如下步骤：
(1)供试品溶液制备：取与实施例2同一批猫爪草药材粉碎得到粉末(60目)1.0g，精密称定，精密加入体积百分数为50％的甲醇水溶液20ml，放置30min，超声处理(功率250W，频率40kHz) 30分钟，抽滤，以50％甲醇洗涤，合并，旋转蒸发至干，残渣精密加入50％甲醇2ml溶解，12000rpm 下离心5min，取上清液，即得。
(3)高效液相法检测：以十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱(
HSST3色谱柱， 4.6mm×250mm，5μm)；流动相为甲醇-1％醋酸，流速为1.0ml/min，梯度洗脱： 0→20min→45min→50min→55min→60min，流动相中0.1％醋酸体积百分数为 0％→1％→20％→20％→90％→0％；柱温为30℃，检测波长为270nm。
得到猫爪草药材的特征图谱，如图23。
如图23所示，参考上述文献标定16个特征峰，见表24所示。
表24峰结果
在中药材及制剂分析检测中，构建的指纹图谱或特征图谱中特征峰的分离度需要满足的最低要求是大于1.2，峰面积占比是大于3％，此外还需要峰形良好。其中峰面积占比是指各特征峰面积分别占特征峰面积总和的百分比。
从上表中可以看出，采用对比例1的方法构建的16个特征峰中前4个色谱峰基本未能实现分离，满足要求的有效特征峰个数较少。其余色谱峰均有包峰现象，即峰不纯，不能作为特征图谱特征峰。
对比例2猫爪草标准汤剂冻干粉
本对比例提供了一种猫爪草标准汤剂冻干粉特征图谱的构建方法，与对比例1的区别仅在于采用猫爪草标准汤剂冻干粉替换掉猫爪草药材为供试品，其余工艺条件均与对比例1相同，得到猫爪草标准汤剂冻干粉特征图谱，见图24。如图24所示，色谱峰分离效果差，峰形差，不能满足分析要求，且无法标定腺苷、尿苷等特征峰。
对比例3
本对比例提供了一种猫爪草标准汤剂冻干粉特征图谱的构建方法，与实施例1的区别仅在于采用甲醇代替流动相中的乙腈，其余工艺条件均与对比例1相同，得到猫爪草标准汤剂冻干粉特征图谱，见图25。由图25可知，甲醇-0.5％醋酸溶液流动相体系，色谱峰分离效果差，峰形差，不能满足分析要求，无法得到本申请的具有4个共有特征峰的特征图谱。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (12)
1.一种猫爪草及其制剂特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)猫爪草供试品溶液的制备；猫爪草供试品溶液的提取溶剂选自水或者甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数不大于10％；
(2)取猫爪草供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含醋酸的水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0→18分钟→30分钟→43分钟→54分钟→62分钟，流动相中乙腈的体积百分比为0％→0％→1％→3％→16％→18％。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)包括：
1)取猫爪草供试品，加溶剂提取，得到提取液；
2)将提取液固液分离，取液体，即为供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)还满足如下A-C中的任意一项或者多项：
A、步骤1)中，加入10-200倍量溶剂；
B、步骤1)中，提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为10min-5h；
C、步骤2)中，所述固液分离独立地选自离心或者过滤。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为258-262nm，流速为0.75-0.85ml/min，柱温38-42℃，进样量为2-20μl。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述含醋酸的水溶液中所含醋酸的体积百分数为0.3-0.7％。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序还可替换为：0→18分钟→30分钟→43分钟→54分钟→62分钟→64分钟→66分钟，流动相中乙腈的体积百分比为0％→0％→1％→3％→16％→18％→0％→0％。
7.根据权利要求1-6中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用尿苷和/或腺苷制备对照品溶液的步骤，以及按照权利要求1-6中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤；和/或，所述的构建方法还包括采用猫爪草对照药材制备对照药材溶液的步骤，以及按照权利要求1-6中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照药材溶液得到对照药材参照图谱的步骤。
8.根据权利要求1-6中任一所述的构建方法，其特征在于，所述猫爪草及其制剂的特征图谱选自如下(1)-(4)中的任意一项：
(1)所述特征图谱的特征峰至少包括尿苷峰和腺苷峰；
(2)所述特征图谱的特征峰包括4个特征峰，1号峰为尿苷峰，3号峰为腺苷峰，2号峰和4号峰为共有峰；
(3)所述特征图谱的特征峰包括4个特征峰，以1号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；峰1-峰4规定值分别为：1.00、2.15、2.34、5.21；
(4)所述猫爪草及其制剂的特征图谱是由权利要求1-6中任一所述的构建方法得到。
9.根据权利要求1-6中任一所述的构建方法，其特征在于，还包括猫爪草及其制剂中尿苷的含量测定方法，包括如下步骤：
猫爪草供试品溶液的制备；
尿苷对照品溶液的制备；
测试步骤：取猫爪草供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含醋酸的水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0→18分钟→30分钟→43分钟→54分钟→62分钟，流动相中乙腈的体积百分比为0％→0％→1％→3％→16％→18％。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，猫爪草及其制剂中尿苷的含量测定方法中，所述猫爪草供试品溶液是按照权利要求1-6中任一所述的猫爪草及其制剂特征图谱的构建方法中的步骤(1)的方法进行制备；所述测试步骤是按照权利要求1-5中任一所述的猫爪草及其制剂特征图谱的构建方法中的步骤(2)的方法进行测试。
11.权利要求1-10中任一项所述的猫爪草及其制剂特征图谱的构建方法在猫爪草产品的质量检测中的应用。
12.一种猫爪草及其制剂的质量检测方法，其特征在于，包括将待测猫爪草产品的特征图谱与猫爪草及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测猫爪草产品的特征图谱为使用待测猫爪草产品按照权利要求1-6中任一所述的构建方法得到，所述猫爪草及其制剂的对照特征图谱选自如下(1)-(4)中的任意一项：
(1)其具有4个共有特征峰，所述特征图谱的特征峰包括4个特征峰，以1号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；1号峰-4号峰的规定值分别为：1.00、2.15、2.34、5.21；
(2)其具有4个共有特征峰，所述特征图谱的特征峰包括4个特征峰，以1号峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；1号峰-4号峰的规定值分别为：1.00、2.15、2.34、5.21；而且其中有1-2个特征峰分别与1-2个对照品参照峰相对应；对照品参照图谱为权利要求7所述的对照品参照图谱；
(3)使用单批次或者多批次猫爪草药材、猫爪草饮片或者猫爪草制剂按照权利要求1-6中任一所述的构建方法得到的特征图谱；
(4)使用多批次猫爪草药材、猫爪草饮片或者猫爪草制剂按照权利要求1-6中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
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