CN110031570B

CN110031570B - 抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法

Info

Publication number: CN110031570B
Application number: CN201910429146.0A
Authority: CN
Inventors: 金俊杰; 蔡宝昌; 李国维; 朱妍格; 李轩涛
Original assignee: Jiangsu Haisheng Pharmaceutical Co ltd; Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co ltd
Current assignee: Jiangsu Haisheng Pharmaceutical Co ltd; Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co ltd
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2021-01-19
Anticipated expiration: 2039-05-22
Also published as: CN110031570A

Abstract

本发明公开了抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法，该方法包括：步骤1、抗感冒颗粒供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备；步骤3、分别精密吸取供试品与对照品溶液注入液相色谱图仪，记录色谱图；步骤4、将抗感冒颗粒的指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次抗感冒颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰，用平均值计算法生成抗感冒颗粒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。本发明所研究的抗感冒颗粒指纹图谱，能全面、客观地评价甘草汁炙女贞子的质量。本发明提供的检测方法具有稳定性好、准确度高、重复性好、精密度高等优点。

Description

抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法

技术领域

本发明属于中成药检测技术领域，具体地说，涉及一种抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法及其指纹图谱。

背景技术

抗感冒颗粒是由金银花、连翘、黄芩、荆芥、防风、板蓝根、青蒿、桔梗、甘草9味药材组成的复方制剂，具有清热解毒、清肺解表的功效，用于风热感冒，发热恶风，鼻塞头痛，咽喉肿痛。

据资料显示，中国成年人人均每年患感冒2—6次，儿童则达6—8次。感冒在学术上分为普通感冒和流行性感冒两种，属于上呼吸道感染疾病，发病原因为病毒感染。普通感冒对人们的影响较小，但传播速度较快，经常出现同时或先后有多人感染发病。

抗感冒颗粒是针对感冒这一常见上呼吸道感染疾病进行的对症治疗药剂。

现有技术中，还没有针对抗感冒颗粒的质量评价方法。因此，目前还没有科学有效的方法对抗感冒颗粒进行质量控制。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，开发一种关于抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法，通过本发明的方法可以客观，正确，有效的控制抗感冒颗粒的质量，对确保其安全性与有效性，并完善相关制药工艺的优化具有重要的指导意义。

技术方案：为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：

一种抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法，它包括以下步骤：

步骤1、抗感冒颗粒供试品溶液的制备：

取适量抗感冒颗粒，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇，回流提取，放冷过滤，滤液蒸干定容，离心后取上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得待测供试品溶液；

步骤2、抗感冒颗粒对照品溶液的制备：

分别取绿原酸、黄芩苷、升麻素苷、甘草素和木犀草苷对照品适量，精密称定，分别置于容量瓶中，加甲醇分别配成对照品储备液；然后分别精密吸取绿原酸、黄芩苷、升麻素苷、甘草素和木犀草苷的对照品溶液适量，加甲醇定容至20ml，制成绿原酸、黄芩苷、升麻素苷、甘草素和木犀草苷的混合对照品溶液；

步骤3、分别精密吸取按步骤1方法得到的抗感冒颗粒供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的抗感冒颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次抗感冒颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成抗感冒颗粒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

作为优选方案，以上所述的一种抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法，步骤1、抗感冒颗粒供试品溶液的制备方法为：

取适量抗感冒颗粒，粉碎，精密称定粉末0.5g，加入甲醇30ml，回流提取2h，放冷过滤，滤液蒸干定容至2ml容量瓶，放入离心管以6000r/min转速，离心5分钟，取上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得待测供试品溶液。

作为优选方案，以上所述的一种抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法，步骤2、混合对照品溶液的制备方法为：

分别取绿原酸、黄芩苷、升麻素苷、甘草素和木犀草苷对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为1000μg/ml、1050μg/ml、1290μg/ml、208μg/ml、250μg/ml的绿原酸、黄芩苷、升麻素苷、甘草素和木犀草苷的对照品储备液；分别精密取绿原酸、黄芩苷、升麻素苷、甘草素和木犀草苷的对照品溶液适量，加甲醇定容至20ml，制成每1ml含绿原酸100μg、黄芩苷105μg、升麻素苷129μg、甘草素20.8μg、木犀草苷25.0μg的混合对照品溶液。

作为优选方案，以上所述的一种抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法，

步骤3、高效液相色谱仪检测的色谱条件为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积浓度0.1％甲酸水作为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，流速为0.5～1.5ml·min-1，柱温25～40℃，检测波长200～360nm。

步骤3高效液相色谱仪检测的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积浓度0.1％甲酸水作为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，流速为1ml·min-1，柱温30℃，检测波长254nm。

作为优选方案，以上所述的一种抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法，梯度洗脱优选如下：

时间/min	流动相A体积百分比	流动相B体积百分比
			0	95	5
30	70	30
			60	70	30
120	30	70

作为优选方案，以上所述的一种抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法，色谱柱为色谱柱为Purospher STAR LP RP-18endcapped，规格为4.6*250mm，5μm。

作为优选方案，以上所述的一种抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法，得到的抗感冒颗粒指纹图谱中有5个共有峰，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1，保留时间为26.724min；共有峰2，保留时间为48.085min；共有峰3，保留时间为66.666min；共有峰4，保留时间为79.943min；共有峰5，保留时间为85.32min。

其中，1号峰为绿原酸，2号峰为升麻素苷，3号峰为木犀草苷，4号峰为甘草素，5号峰为黄芩苷。

实验方法与指纹图谱检测条件的优化实验：

(1)不同流动相的选择：

本发明通过大量实验筛选了纯水-乙腈、纯水-甲醇、0.1％甲酸水-乙腈、0.1％甲酸水-甲醇、0.1％磷酸水-乙腈、0.1％磷酸水-甲醇等流动相系统进行检测，检测结果显示选择含0.1％体积甲酸水和甲醇作为流动相，系统基线平稳、峰形、各峰分离度情况最好。故选择以含0.1％体积甲酸水作为流动相A，以甲醇为流动相B为最佳流动相；在确定流动相基础上，为了达到更好的分离度，本发明筛选了梯度洗脱方式，实验结果表明，不同的梯度洗脱方式，对各化合物的分离度影响大，本发明通过调整不同时间段的分离度和色谱峰数目，优选得到最佳的梯度洗脱方式为：流动相B的比例变化为：0～30min，5％～30％甲醇；30～60min，30％～30％甲醇；60～120min，30％～70％甲醇。

(2)不同检测波长的选择：

本发明通过大量实验筛选了不同波长230nm、254nm、284nm、334nm下色谱检测结果，检测结果显示在254nm下各特征峰强度较好，故选择254nm作为检测波长，如图1所示。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所建立的抗感冒颗粒指纹图谱，能有效地表征抗感冒颗粒的质量，有利于全面监控抗感冒颗粒药物的质量。

(2)本发明所建立的指纹图谱，可注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定抗感冒颗粒质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

(3)本发明方法具有稳定性好、精密度高、准确度高、重现性好等的优点。可以全面、客观准确的评价和控制抗感冒颗粒的质量。

附图说明

图1为抗感冒颗粒供试品在254nm下的色谱图。

图2为对照品溶液在254nm下的色谱图。

图3为10批抗感冒颗粒供试品溶液匹配的指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

以下实施例所用仪器

日本岛津公司Shimadzu LC-20AB高效液相色谱系统，包括在线脱气机，自动进样器Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和柱温箱CTO-20A；ME204E电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司，精确到十万分之一)；BSM220.4分析天平(上海卓精公司，精确到万分之一)；GVS型超声波清洗器(深圳市够威科技有限公司)；TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

以下实例所用试药如下：绿原酸分析标准品(批号110753-201314，纯度96.6％)、黄芩苷分析标准品(批号110715-201016，纯度94.0％)、木犀草苷分析标准品(批号111720-201609，纯度94.9％)均购自中国食品药品检定研究所、甘草素分析标准品(批号245587，纯度98.0％)购自南京春秋生物工程有限公司、升麻素苷分析标准品(批号161226，纯度98.0％)购自南京森倍伽生物科技有限公司。甲醇为色谱纯，水为超纯水，甲酸为分析纯。抗感冒颗粒(江苏海昇药业有限公司,国药准字Z32021012，批号180611、180511、180411、180311、180111、171211、171111、171011、170911、170811)其它试剂(分析纯)。

实施例1

一种抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：

取10批抗感冒颗粒(江苏海昇药业有限公司，批号180611、180511、180411、180311、180111、171211、171111、171011、170911、170811)分别取适量打粉，精密称定粉末0.5g，加入甲醇30ml，回流提取2h，放冷过滤，滤液蒸干定容至2ml容量瓶，放入离心管以6000r/min转速，离心5分钟，取上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得抗感冒颗粒供试品溶液。

(2)对照品溶液的制备：

分别取绿原酸、黄芩苷、升麻素苷、甘草素和木犀草苷对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为1000μg/ml、1050μg/ml、1290μg/ml、208μg/ml、250μg/ml的对照品储备液；分别精密绿原酸、黄芩苷、升麻素苷、甘草素和木犀草苷对照品溶液适量，加甲醇定容至20ml，制成每1ml含绿原酸100μg、黄芩苷105μg、升麻素苷129μg、甘草素20.8μg、木犀草苷25.0μg的混合对照品溶液。

(3)分别精密吸取步骤1的10批抗感冒颗粒供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

(4)将步骤3中获得的10批抗感冒颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择10批次抗感冒颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成抗感冒颗粒的对照指纹图谱，如图3所示，相似度评价结果见表2。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图(图2所示，绿原酸保留时间为26.724min、升麻素苷保留时间为48.085min、木犀草苷保留时间为66.666min、甘草素保留时间为79.943min、黄芩苷保留时间为85.32min)的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

色谱条件及系统适用性

色谱柱：Purospher STAR LP RP-18 endcapped，4.6*250mm，5μm。

流动相：A相：0.1体积％甲酸水；B相：甲醇；检测波长：254nm，流速：1.0ml·min^-1，柱温：30℃；梯度洗脱程序如下表1：

表1梯度洗脱程序

表2 10批抗感冒颗粒供试品溶液相似度评价结果

得到的抗感冒颗粒指纹图谱中有5个共有峰，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1，保留时间为26.724min；共有峰2，保留时间为48.085min；共有峰3，保留时间为66.666min；共有峰4，保留时间为79.943min；共有峰5，保留时间为85.32min。

实施例2指纹图谱检测的方法学研究：

1、方法学考察

1.1精密度考察

取批号为180611的抗感冒颗粒样品，按照上述实施例1的供试品制备方法，制备得到供试品溶液，连续进样6次，每次进样量10μL，按上述实施例1色谱条件检测，测定其HPLC色谱图，对色谱图中5个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于2.34％，共有峰峰面积RSD均小于1.98％，说明仪器精密度较好。

1.2稳定性考察

取批号为180611的抗感冒颗粒样品，按照上述实施例1的供试品制备方法制备供试品溶液，按上述实施例1中的色谱条件分别于0，4，8，12，16和24h进样，记录色谱图，对色谱图中5个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于2.11％，共有峰峰面积RSD均小于1.80％，说明供试品溶液在24h内稳定性较好。

1.3重复性考察

取批号为180611的抗感冒颗粒样品6份，按照上述实施例1供试品制备方法制备供试品溶液，分别测定，记录色谱图，对色谱图中5个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于0.40％，共有峰峰面积RSD均小于2.76％，说明该方法重复性良好。

由以上实验结果表明，本发明建立的抗感冒颗粒指纹图谱检测方法，精密度、稳定性和重复性好，能有效地表征抗感冒颗粒的质量，有利于全面监控其质量。

Claims

1.一种抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法，其特征在于，它包括以下步骤：

步骤1、抗感冒颗粒供试品溶液的制备：

取适量抗感冒颗粒，粉碎，精密称定粉末0.5g，加入甲醇30ml，回流提取2h，放冷过滤，滤液蒸干定容至2ml容量瓶，放入离心管以6000r/min转速，离心5分钟，取上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得待测供试品溶液；

步骤2、混合对照品溶液的制备：

分别取绿原酸、黄芩苷、升麻素苷、甘草素和木犀草苷对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为1000μg/ml、1050μg/ml、1290μg/ml、208μg/ml、250μg/ml的绿原酸、黄芩苷、升麻素苷、甘草素和木犀草苷的对照品储备液；分别精密取绿原酸、黄芩苷、升麻素苷、甘草素和木犀草苷的对照品溶液适量，加甲醇定容至20ml，制成每1ml含绿原酸100μg、黄芩苷105μg、升麻素苷129μg、甘草素20.8μg、木犀草苷25.0μg的混合对照品溶液；

步骤4，将步骤3中获得的抗感冒颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次抗感冒颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成抗感冒颗粒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分;

步骤3高效液相色谱仪检测的色谱条件为：色谱柱为Purospher STAR LP RP-18endcapped，规格为4.6*250mm，5μm；以体积浓度0.1%甲酸水作为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，流速为1ml·min^-1，柱温30℃，检测波长254nm；梯度洗脱如下：

时间/min 流动相A体积百分比流动相B体积百分比 0 95 5 30 70 30 60 70 30 120 30 70

。

2.根据权利要求1所述的一种抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法，其特征在于，得到的抗感冒颗粒指纹图谱中有5个共有峰，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1，保留时间为26.724min；共有峰2，保留时间为48.085min；共有峰3，保留时间为66.666min；共有峰4，保留时间为79.943min；共有峰5，保留时间为85.32min。

3.根据权利要求2所述的一种抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法，其特征在于，其中，1号峰为绿原酸，2号峰为升麻素苷，3号峰为木犀草苷，4号峰为甘草素，5号峰为黄芩苷。