CN105929096B - 一种治疗感冒药物的hplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种感冒药物HPLC指纹图谱的建立方法，步骤如下：(1)制备对照品溶液：分别配制甘草酸、甘草苷、绿原酸、木犀草苷对照品溶液；(2)制备供试品溶液：称取苦甘冲剂，进行提取，提取液用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；(3)采用高效液相色谱法进行测定得到指纹图谱，其中色谱条件为：梯度洗脱，所述梯度洗脱的流动相A为乙腈，B为0.05～5％甲酸水溶液，检测波长254nm；(4)评价相似度：供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。该方法具有良好的精密度、重复性、稳定性，采用HPLC指纹图谱技术可以有效地控制苦甘冲剂的质量。

Description

一种治疗感冒药物的HPLC指纹图谱的建立方法
技术领域
本发明涉及一种治疗感冒药物的质量控制方法，尤其涉及一种治疗感冒药物HPLC指纹图谱的建立方法。
背景技术
感冒药物中成药是多成分，多因素，多靶点构成的复杂的体系，其化学成分的多样性与复杂性是其疗效的物质基础，建立符合中医药特点的现代质量控制体系，解决中药质量分析和评价的难题，改进中药现有的质量控制方法是近年来关注的重点也是难点。
目前，大多中药质量检测方法还是采用光谱或者色谱手段鉴别或测定某一种或几种有效成分或指标成分，以及药典规定的常规检查项目。对于中药而言，任何单一的有效活性成分的含量高低不能代表整体的疗效。
中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。感冒药物
专利号为200910148324.9，发明名称为“一种治疗感冒的药物组合物及其制备方法”的发明专利公开了一种具有疏风清热、宣肺化痰、止咳平喘等功能的药物，用于治疗风热感冒及风温肺热引起的恶风、发热、头痛、咽痛、咳嗽、气喘，上呼吸道感染，流行性感冒，急性气管，支气管炎等症。本发明在前述发明专利的基础上深入研究了该药物指纹图谱的建立方法以便用于质量控制。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种治疗感冒药物HPLC指纹图谱的建立方法。
本发明建立的一种治疗感冒药物HPLC指纹图谱有良好的精密度、重复性和稳定性，能够用于苦甘冲剂的质量控制和鉴别真伪。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种治疗感冒药物HPLC指纹图谱的建立方法，步骤如下：
(1)制备对照品溶液：分别配制甘草酸、甘草苷、绿原酸、木犀草苷对照品溶液，优选：浓度均为0.2-0.5mg/mL。
(2)制备供试品溶液：称取苦甘冲剂，优选：3-5g(更优选：4g)进行提取，提取液用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；
(3)采用高效液相色谱法进行测定得到指纹图谱，其中色谱条件为：梯度洗脱，所述梯度洗脱的流动相A为乙腈，B为0.05～5％甲酸水溶液，检测波长254nm；
(4)评价相似度：供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，所述感冒药物的原料药组成为：麻黄1-9重量份，薄荷1-9重量份，蝉蜕1-9重量份，金银花1-20重量份，黄芩2-20重量份，苦杏仁2-18重量份，浙贝母1-9重量份，桔梗1-9重量份，甘草1-9重量份。
优选：步骤(1)中甘草酸、甘草苷、绿原酸、木犀草苷对照品溶液浓度分别为0.5、0.4、0.2、0.3mg/mL。
优选：步骤(2)中微孔滤膜孔径为0.2μm～0.8μm(更优选0.45μm)。
优选：步骤(3)中色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；梯度洗脱：0～50min，流动相B的体积分数从95％到70％，50～60min，流动相B的体积分数从70％到0。，流速为：0.2-0.4(更优选0.3)ml/min；柱温：20-40(更优选25)℃；进样：15-25(更优选20)μl。
优选：所述步骤(4)中评价相似度时，供试品指纹图谱在程序HPLC检测下的相似度均大于0.90。
上述的方法在建立药物指纹图谱、质量控制、鉴别真伪中的应用。
优选：上述原料药组成可以是如下配比：
麻黄6重量份，薄荷5重量份，蝉蜕5重量份，金银花15重量份，黄芩12重量份，苦杏仁9重量份，浙贝母6重量份，桔梗6重量份，甘草5重量份；或麻黄3重量份，薄荷9重量份，蝉蜕3重量份，金银花17重量份，黄芩9重量份，苦杏仁16重量份，浙贝母3重量份，桔梗8重量份，甘草4重量份；或麻黄9重量份，薄荷2重量份，蝉蜕7重量份，金银花11重量份，黄芩18重量份，苦杏仁7重量份，浙贝母7重量份，桔梗4重量份，甘草8重量份。
上述原料药组成的最佳配比为：
麻黄2.5重量份，薄荷2.08重量份，蝉蜕2.08重量份，金银花6.25重量份，黄芩5重量份，苦杏仁3.75重量份，浙贝母2.5重量份，桔梗2.5重量份，甘草2.08重量份。
上述本发明药物可以制成临床可接受的任何剂型，如丸剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂、注射剂等。
本发明药物的制备方法为：原料药，薄荷用水蒸气蒸馏法提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器保存；药渣与其余麻黄等八味，加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.23～1.25(90～95℃)的清膏。取清膏1份，加蔗糖0.16份、糊精0.16份，混匀，制成颗粒，干燥，喷入挥发油，混匀，即得。
本发明药物的制备方法还可以为：
薄荷用水蒸气蒸馏法提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器保存；药渣与其余麻黄等八味，加水煎煮1-3次，每次0.5-1.5小时，首次加6-10重量倍水，第二或三次加5-8重量倍水，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度90～95℃时为1.18～1.20的清膏；取清膏，加蔗糖1-3重量份，糊精1-3重量份，蔗糖与糊精比例为1∶1，混匀、制粒、干燥、整粒，喷入挥发油，混匀，按常规方法制成临床可接受的任何剂型，如丸剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂；或加入蔗糖、糊精时再加入阿司帕坦0.03-0.07重量份，混匀，制粒、干燥、整粒，混匀，制成颗粒。
制备工艺优选为：薄荷用水蒸气蒸馏法提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器保存；药渣与其余麻黄等八味，加水煎煮二次，每次1小时，第1次8倍量的水，第2次6倍量的水，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.18～1.20(90℃)的清膏；清膏加入蔗糖1.7～2.3重量份、糊精1.7～2.3重量份，混匀、制粒、干燥、整粒，喷入挥发油，混匀，制成颗粒；或加入蔗糖1.7～2.3重量份、糊精1.7～2.3重量份，蔗糖与糊精比例为1∶1，阿司帕坦0.06重量份，混匀，制粒、干燥、整粒，混匀，制成颗粒，即得。
本发明药物的制备方法还可以为：
薄荷用水蒸气蒸馏法提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器保存；药渣与其余麻黄等八味，加水煎煮1-3次，每次0.5-1.5小时，首次加6-10重量倍水，第二或三次加5-8重量倍水，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度90～95℃时为1.18～1.20的清膏；所得挥发油用适量β-环糊精包结，加适量清膏调色，喷雾干燥；取清膏，加蔗糖1-3重量份，糊精1-3重量份，蔗糖与糊精比例为1∶1，混匀、制粒、干燥、整粒，将挥发油包结物加入于干颗粒中，混匀，按常规方法制成临床可接受的任何剂型，如丸剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂；或加入蔗糖、糊精时再加入阿司帕坦0.03-0.07重量份，混匀，制粒、干燥、整粒，混匀，制成颗粒。
上述制备工艺优选为：
以上九味，薄荷用水蒸气蒸馏法提取挥发油，水溶液另器保存；药渣与其余麻黄等八味，加水煎煮二次，每次1小时，第1次8倍量的水，第2次6倍量的水，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.18～1.20(90℃)的清膏；所得挥发油用适量β-环糊精包结，加适量清膏调色，喷雾干燥；清膏加入蔗糖1.7～2.3重量份、糊精1.7～2.3重量份，混匀、制粒、干燥、整粒，将挥发油包结物加入于干颗粒中，混匀，制成颗粒；或加入蔗糖1.7～2.3重量份、糊精1.7～2.3重量份、阿司帕坦0.06重量份，混匀，制粒、干燥、整粒，将挥发油包结物加入于干颗粒中，混匀，制成颗粒，即得。
本发明所使用的术语“评价相似度”是指对现有的感冒药物供试品的指纹图谱按照国家药典委员会出版的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行相似度的评价。
本发明感冒药物HPLC指纹图谱的建立方法所得到的感冒药物的标准指纹图谱。
本发明的有益效果：
本发明确立了原料药为麻黄，薄荷，蝉蜕，金银花，黄芩，苦杏仁，浙贝母，桔梗，甘草感冒药物指纹图谱的建立方法，通过该方法可获得该组成药物的标准指纹图谱，比较指纹图谱中共有峰的有无，能有效地监控该药物的质量，完善了原料药为麻黄，薄荷，蝉蜕，金银花，黄芩，苦杏仁，浙贝母，桔梗，甘草药物的质量评价体系，为该药物质量的全面、有效控制提供了理论和实践基础。
发明人通过大量的试验得到本发明指纹图谱的建立方法，该方法具有良好的精密度、重复性、稳定性，可较全面地检测原料药为麻黄，薄荷，蝉蜕，金银花，黄芩，苦杏仁，浙贝母，桔梗，甘草药物中多种主要有效成分，从而构建科学合理的HPLC指纹图谱，进而更全面准确地监控该药物的质量，完整、准确地评价该药物的安全性、有效性、稳定性和质量均一性。
2.本发明首次公开程序HPLC检测用于一种治疗感冒药物指纹图谱的建立；“HPLC程序检测”是指利用二极管阵列检测器(DAD)特有的程序HPLC功能，根据各组分的出峰顺序，在不同时间段分别采用各组分的最佳吸收波长进行检测的方法。
3.供试品制作简便，色谱条件容易实现。
附图说明
图1为实施例1中10批感冒药物指纹图谱；
图2为实施例1中对照品高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1仪器与试药
1.1仪器
Waters 2695高效液相色谱仪，Waters2998检测器，Waters Empower化学工作站；中药色谱指纹图相似度评价系统(2004A版)；BUG25-12超声波清洗机(220W，50KHZ，上海必能信超声有限公司)；AEG-45SM电子天平(十万分之一，瑞士梅特勒公司)，BP121S(万分之一，北京赛多利斯科学仪器有限公司)。
1.2试药
所有试剂除流动相为色谱纯外，其余均为分析纯；甘草酸对照品(北京恒远启天化工技术研究院，批号MUST-13083101)；甘草苷对照品(北京恒远启天化工技术研究院，批号MUST-130020901)；绿原酸对照品(北京恒远启天化工技术研究院，批号MUST-13031401)；木犀草苷对照品(北京恒远启天化工技术研究院，批号MUST-13060908)；感冒药物(青岛国风药业，共10批次，批号分别为150401、150402、150504，150505，150507，150508，150509，150510，150511，分别记为S1～S10)。
所述感冒药物的组成与制备方法如下：麻黄6g，薄荷5g，蝉蜕5g，金银花15g，黄芩12g，苦杏仁9g，桔梗6g，浙贝母6g，甘草5，制备方法：以上九味，薄荷用水蒸气蒸馏法提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器保存；药渣与其余麻黄等八味，加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.23～1.25(90～95℃)的清膏。取清膏1份，加蔗糖0.16份、糊精0.16份，混匀，制成颗粒，干燥，喷入上述挥发油，混匀，即得。
2高效液相色谱
2.1供试品的HPLC分析方法研究
2.1.1流动相的选择
本实验尝试了多种流动相系统，分别为：甲醇-水；乙腈-水；甲醇-乙腈-0.1％冰醋酸溶液；乙腈-0.1％甲酸溶液；乙腈-0.2％磷酸-0.3二乙胺、甲醇-乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾等分别进行梯度洗脱。结果表明：乙腈-0.1％甲酸水系统有助于各色谱峰的分离，此流动相下所分离的色谱峰最多，分离度最好。梯度洗脱时间程序如表1。
表1梯度洗脱时间程序
2.1.2检测波长的选择
感冒药物中含有黄酮、生物碱等多类成分，比较复杂，不同的检测波长下得到的图谱差别较大。经二极管阵列检测器190-400nm扫描，综合考虑感冒药物提取物中各成分的吸收光谱以及光谱吸收背景的干扰，结果表明254nm下色谱峰的表观丰度较高，并能充分反映样品组分全貌，故选择254nm为检测波长。
2.1.3检测时间的选择
在此梯度洗脱的条件下，考察了100min，但是60min后漂移严重，故确定洗脱时间为60min。
2.1.4进样量的选择
本实验分别考察了5、10、20μl共3种进样体积，结果表明，20μl进样量峰面积合适，进样20μl可以满足分离的要求。
最终确定的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料(Waterssymmetry C18，150×2.1mm，3.5μm)，流动相：乙腈(A)-0.1％酸水溶液(B)，梯度洗脱60min，0～50min(B：95→70)，50～60min(B：70→0)，流速为：0.3ml/min；柱温25℃；检测波长254nm；进样：20μl，理论板数按甘草酸峰计算应不低于2000。
2.2对照品溶液的制备
精密称取甘草酸、甘草苷、绿原酸、木犀草苷适量，置于50ml量瓶中，用流动相溶液溶并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含甘草酸、甘草苷、绿原酸、木犀草苷对照品分别为0.5、0.4、0.2、0.3mg/mL)。
2.3供试品溶液的制备
精密称取感冒药物4g，加入甲醇100mL，超声30min后放置于冰箱中，静置2h，过滤，取续滤液即得，经微孔滤膜(0.45μm)滤过，作为供试品溶液。
2.4空白溶液的制备
精密称取加入等比苦甘辅料，加入甲醇100mL，超声30min后放置于冰箱中，静置2h，过滤，取续滤液即得，经微孔滤膜(0.45μm)滤过，作为空白溶液。
2.5测定方法
取10批次的感冒药物，每批按照2.3的方法制备成供试品溶液，备用。取20ul，按照2.1项下最终确定的色谱条件测定，记录色谱图。
2.6方法学考察
2.6.1精密度试验
取感冒药物(150401批)内容物6份，每份约1g，精密称定，按拟定的指纹图谱测定方法，计算得出每图谱与共有模式之间共有峰的相似度≥0.996，提示精密度良好，符合中药指纹图谱要求。
2.6.2稳定性试验
取感冒药物(150401批)内容物6份，每份约1g，精密称定，依法分别在0，3，6，9，24h进样，按拟定的指纹图谱测定方法检测指纹图谱，计算得出每个图谱与共有模式之间共有峰的相似度≥0.984，提示该供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.6.3重复性试验
取感冒药物(150401批)内容物6份，每份约1，精密称定按拟定的指纹图谱测定方法检测指纹图谱，计算得出每个图谱与共有模式之间共有峰的相似度≥0.995，提示该方法具有良好的重复性。
3感冒药物指纹图谱的建立与分析
3.1指纹图谱的建立及共有峰的标定
10批供试品的测定结果，分析确定了感冒药物指纹图谱的13个共有指纹峰，不同批次相同共有峰的紫外光谱一致，10批感冒药物的HPLC指纹重叠图谱见图1，对照品(见图2)。
3.2特征指纹峰分析
采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)，得出感冒药物指纹图谱的共有模式，以10批样品均值生成的共有模式为对照，计算各批样品图谱中各共有峰相对保留时间的RSD值及每个图谱与共有模式之间共有峰的相似度，结果见表2、表3，RSD值均小于3％，相似度值均在0.9～1之间，该指纹图谱标准符合中药指纹图谱研究要求。
表2 10批样品相似度计算结果
表3感冒药物样品各共有峰相对保留时间RSD值
应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件，通过对10批感冒药物HPLC色谱图的考察发现，感冒药物HPLC图谱的相似度均大于0.9，体现了10批感冒药物内在质量的相对稳定。符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》2000版的规定，因此，所建立的感冒药物HPLC对照指纹图谱合格。
以现代分析技术为依托的指纹图谱分析是现阶段可行的中药质量控制模式。但是目前还只是出于初级阶段，研究中还存在不少问题。中成药指纹图谱具有一定的模糊特点，需要建立一套完整的相似判断标准。指纹图谱的建立不仅可以提高中成药标准化程度，控制中成药的质量，而且可以与国际的先进水平接轨，以适应中成药走向世界，实现中药现代化的需要。
实施例2
一种感冒药物HPLC指纹图谱的建立方法，步骤同实施例1。
感冒药物原料药为：麻黄6g，薄荷5g，蝉蜕5g，金银花15g，黄芩12g，苦杏仁9g，浙贝母6g，桔梗6g，甘草5g；制备方法：薄荷用水蒸气蒸馏法提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器保存；药渣与其余麻黄等八味，加水煎煮1-3次，每次0.5-1.5小时，首次加6-10重量倍水，第二或三次加5-8重量倍水，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度90～95℃时为1.18～1.20的清膏；取清膏，加蔗糖1-3重量份，糊精1-3重量份，蔗糖与糊精比例为1∶1，混匀、制粒、干燥、整粒，喷入挥发油，混匀，按常规方法制成临床可接受的任何剂型，如丸剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂；或加入蔗糖、糊精时再加入阿司帕坦0.03-0.07重量份，混匀，制粒、干燥、整粒，混匀，制成颗粒。
实施例3
一种感冒药物HPLC指纹图谱的建立方法，步骤同实施例1。
感冒药物原料药为：麻黄3g，薄荷9g，蝉蜕3g，金银花17g，黄芩9g，苦杏仁16g，浙贝母3g，桔梗8g，甘草4g；制备方法：薄荷用水蒸气蒸馏法提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器保存；药渣与其余麻黄等八味，加水煎煮1-3次，每次0.5-1.5小时，首次加6-10重量倍水，第二或三次加5-8重量倍水，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度90～95℃时为1.18～1.20的清膏；所得挥发油用适量β-环糊精包结，加适量清膏调色，喷雾干燥；取清膏，加蔗糖1-3g，糊精1-3g，蔗糖与糊精比例为1∶1，混匀、制粒、干燥、整粒，将挥发油包结物加入于干颗粒中，混匀，按常规方法制成临床可接受的任何剂型，如丸剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂；或加入蔗糖、糊精时再加入阿司帕坦0.03-0.07g，混匀，制粒、干燥、整粒，混匀，制成颗粒。
实施例4
一种感冒药物HPLC指纹图谱的建立方法，步骤同实施例1。
感冒药物原料药为：麻黄9g，薄荷2g，蝉蜕7g，金银花11g，黄芩18g，苦杏仁7g，浙贝母7g，桔梗4g，甘草8g。制备方法同实施例1。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种感冒药物HPLC指纹图谱的建立方法，其特征是：步骤如下：
（1）制备对照品溶液：分别配制甘草酸、甘草苷、绿原酸、木犀草苷对照品溶液；
（2）制备供试品溶液：称取苦甘冲剂，进行提取，提取液用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；
（3）采用高效液相色谱法进行测定得到指纹图谱，其中色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱条件为：梯度洗脱，所述梯度洗脱的流动相A为乙腈，B为0.05～5％甲酸水溶液，检测波长254nm；梯度洗脱包括：0～50min，流动相B的体积分数从95%到70%，50～60min，流动相B的体积分数从70%到0；
（4）供试品指纹图谱进行相似度评价；所述感冒药物的原料药组成为：麻黄1-9重量份，薄荷1-9重量份，蝉蜕1-9重量份，金银花1-20重量份，黄芩2-20重量份，苦杏仁2-18重量份，浙贝母1-9重量份，桔梗1-9重量份，甘草1-9重量份；
所述供试品溶液的制备包括：精密称取感冒药物4g，加入甲醇100mL，超声30min后放置于冰箱中，静置2h，过滤，取续滤液即得，经0.45µm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
2.如权利要求1所述的建立方法，其特征是：所述步骤（1）中对照品溶液的浓度均为0.2-0.5mg/mL。
3.如权利要求1所述的建立方法，其特征是：所述步骤（1）中甘草酸、甘草苷、绿原酸、木犀草苷对照品溶液浓度分别为0.5、0.4、0.2、0.3mg/mL。
4.如权利要求1所述的建立方法，其特征是：所述步骤（3）中流速为：0.2-0.4ml/min；柱温：20-40℃，进样量：15-25μl。
5.如权利要求1所述的建立方法，其特征是：所述步骤（4）中评价相似度时，供试品指纹图谱在程序HPLC检测下的相似度均大于0.90。
6.如权利要求1所述的建立方法，其特征是：所述感冒药物的原料药组成为：麻黄6重量份，薄荷5重量份，蝉蜕5重量份，金银花15重量份，黄芩12重量份，苦杏仁9重量份，浙贝母6重量份，桔梗6重量份，甘草5重量份。
7.如权利要求1所述的建立方法，其特征是：所述感冒药物的原料药组成为：麻黄3重量份，薄荷9重量份，蝉蜕3重量份，金银花17重量份，黄芩9重量份，苦杏仁16重量份，浙贝母3重量份，桔梗8重量份，甘草4重量份。
8.如权利要求1所述的建立方法，其特征是：所述感冒药物的原料药组成为：麻黄9重量份，薄荷2重量份，蝉蜕7重量份，金银花11重量份，黄芩18重量份，苦杏仁7重量份，浙贝母7重量份，桔梗4重量份，甘草8重量份。
9.如权利要求1所述的建立方法，其特征是：所述感冒药物的原料药组成为：麻黄2.5重量份，薄荷2.08重量份，蝉蜕2.08重量份，金银花6.25重量份，黄芩5重量份，苦杏仁3.75重量份，浙贝母2.5重量份，桔梗2.5重量份，甘草2.08重量份。
10.如权利要求1-9任一所述的建立方法或权利要求1-9任一所述的建立方法所得到的指纹图谱在苦甘冲剂质量控制或鉴别真伪中的应用。
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