CN104458954A

CN104458954A - 一种菟丝子配方颗粒指纹图谱及其建立方法

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Publication number: CN104458954A
Application number: CN201410742982.1A
Authority: CN
Inventors: 谭登平; 程学仁; 谢菲; 王闽予; 杜兰哲; 朱德全; 李慧
Original assignee: Guangdong Yifang Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guangdong Yifang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2034-12-09
Also published as: CN104458954B

Abstract

本发明涉及一种菟丝子配方颗粒指纹图谱及其建立方法，属于药物分析技术领域。包括对照品、供试品溶液的制备、色谱条件的选择和指纹图谱的建立。通过对13批菟丝子配方颗粒指纹图谱的对比，确定了5个共有特征峰，以金丝桃苷峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内。规定值为：1号峰0.24、2号峰0.82、S峰1.00、3号峰1.11、4号峰1.63。本发明重复性好，准确可靠，所建立的HPLC指纹图谱方法可有效地控制菟丝子配方颗粒的质量。

Description

一种菟丝子配方颗粒指纹图谱及其建立方法

技术领域

本发明涉及一种中药材的质量控制方法，具体涉及一种菟丝子配方颗粒指纹图谱及其建立方法，属于药物分析技术领域。

背景技术

中药配方颗粒是以符合炮制规范的优质中药饮片为原料，采用现代高新技术提炼而成的单味浓缩颗粒，其性味、归经、功效与原生药基本一致。中药配方颗粒是中药剂型改革的一部分，代替传统饮片使用，要求“源于饮片，高于饮片”。在临床使用中实现了用药的“高效安全、稳定可控、方便卫生”。由于中药配方颗粒具有小剂型、疗效好、见效快，服用、携带、贮藏方便等特点，非常适应现代社会包括国际社会对天然药物的需求和现代社会紧张生活的需要。

菟丝子为旋花科植物菟丝子Cuscuta chinensis Lam．的干燥成熟种子，始载于《神农本草经》，并被列为上品，味甘、辛, 性平, 功效补益肝肾，固精缩尿，安胎，明目，止泻，是中医补肾壮阳的要药。现代药理研究表明其具有增强生殖系统作用，提高心血管系统功能，提高免疫力、抗氧化、抗衰老、抗癌、保肝明目等作用，用于肝肾不足，腰膝酸软，阳痿遗精，遗尿尿频，肾虚胎漏，胎动不安，目昏耳鸣，脾肾虚泻。菟丝子主要含有黄酮类、有机酸、甾醇类、多糖、生物碱类、微量元素和氨基酸等多种成分，其中黄酮类成分为其主要有效成分，黄酮类化合物包括金丝桃苷、紫云英苷、山奈酚、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖（2→1）β-D-芹糖苷等。由于近年来，菟丝子在制药及临床需要量增大，而其产量又低，产生了供求失衡现象，价格走高，所以菟丝子出现了严重的掺假现象，混淆品，伪品层出不穷，是各个药材市场上抽检不合格率最高的品种之一。因此，急需一种标准对菟丝子药材及菟丝子制剂的质量进行判定。

目前，我国质量控制体系对中药及其制剂的质量控制内容主要包括外观鉴别、性状检查以及有效成分的含量测定。中药配方颗粒已失去了药材原本的外观性状，其质量控制很大程度依靠有效成分的检测。而在有效成分的含量测定方面，所测成分大多是1-2个指标成分，这与中药所含化学成分复杂，发挥药效时多成分、多靶点协同作用的特性不甚吻合。此外，在各品种的性状、理化鉴别以及含量测定方面，存在普适性内容，即有效成分的专属性不强，例如仅仅鉴定绿原酸不能区分金银花、山银花或菊花，因此较难全面科学的评价中药材及其制剂的质量。特征指纹图谱作为一种综合的、可量化的鉴别模式，中药材及其制剂的真实性和质量的一致性以及稳定性均可有效地加以检测和控制。

发明内容

本发明的目的是为菟丝子配方颗粒的质量控制和真伪鉴别提供一个方法，建立菟丝子配方颗粒指纹图谱的方法，并由此方法得到菟丝子配方颗粒的指纹图谱。

为实现上述发明的目的，本发明采取的技术方案如下：

一种菟丝子配方颗粒指纹图谱的建立方法，采用高效液相色谱法，包括如下步骤：

（1）对照品溶液的制备：精确称定金丝桃苷对照品，加甲醇配制成每1ml含金丝桃苷40~55μg的溶液，作为对照品溶液；

（2）供试品溶液的制备：精确称定菟丝子配方颗粒粉末0.2~0.8g，置锥形瓶中，加体积浓度为80%~100%的甲醇溶液15~35ml，超声处理15~60min，放冷，用80%~100%的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.1~0.5μm微孔滤膜，即得供试品溶液；

（3）测定：将步骤（1）所得的对照品溶液和步骤（2）所得的供试品溶液分别进行高效液相色谱分析，得到HPLC指纹图谱；

（4）指纹图谱建立：通过比较不同菟丝子配方颗粒的HPLC特征图谱，确定菟丝子配方颗粒的共有特征峰。

所述的一种菟丝子配方颗粒指纹图谱的建立方法，供试品溶液的制备中所述的超声处理为功率100~300W，频率20~30KHz。

所述的一种菟丝子配方颗粒指纹图谱的建立方法，高效液相色谱法采用的仪器为Waters 2695高效液相色谱系统，Empower Pro色谱工作站，Waters 2489紫外检测器。

所述的一种菟丝子配方颗粒指纹图谱的建立方法，步骤（3）所述的色谱条件是色谱柱：Hypersil：250mm×4.6mm，5μm柱；流动相：A乙腈-B水，梯度洗脱：0~8min，A为10%~13%；8~38min，A 为13%；38~48min，A 为13%~17%；48~60min，A 为17%~20%；60~65min，A 为20%~10%；检测波长：300~360nm；流速0.5~1.5ml/min；柱温：15~35℃；进样量20~30μl。

一种菟丝子配方颗粒指纹图谱的建立：取13批菟丝子配方颗粒（广东一方制药有限公司，批号：0701045、0711137、0809123、0807116、0811114、0812561、0903125、0907077、0911086、1003128、1003342、1006124、1011116）的供试品溶液，进样，记录65min的色谱图，以金丝桃苷对照品为参照峰，结果13批配方颗粒有5个共有峰，分别在7.6，26.2，32.4，35.6，51.8min出峰，见图2，共有峰的相对峰面积、相对保留时间均具有较好的重复性，见表一、表二；5个共有峰的平均相对保留时间依次为：0.238、0.815、1.000、1.106、1.627，RSD均小于2.0%，这5个共有峰出峰时间较为稳定，可作为菟丝子配方颗粒的特征峰。

特征图谱的色谱峰的指认：

精密吸取供试品溶液及金丝桃苷对照品溶液各25 μl，注入高效液相色谱仪，在32.33min处的色谱峰为金丝桃苷的色谱峰，金丝桃苷的峰分布正态，达到基线分离，且峰面积占总峰面积的25～56%，故选择金丝桃苷的峰作为参考峰，标记为峰S，其他特征峰标记为峰1～4，见图1。

重复性试验

取同一批样品（1003342）共6份，按上述方法分别制备成供试品溶液，进样测定，以金丝桃苷色谱峰为参照峰（S），计算1～5号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，其中各特征峰的相对保留时间的RSD均小于0.6%，特征峰的相对峰面积RSD均小于3.0%，表明方法重复性良好。

精密度试验

取重复性试验中同一供试品溶液，连续进样6次，以金丝桃苷色谱峰为参照峰（S），计算1～5号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，其中各特征峰的相对保留时间的RSD均小于0.6%，特征峰的相对峰面积RSD均小于1.0%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验

取重复性试验中同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24h进样测定，以金丝桃苷色谱峰为参照峰（S），计算1～5号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，其中所相对应的色谱峰相对保留时间均小于2.0%，特征峰的相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定。

表1 13批菟丝子配方颗粒相对保留时间

表2 13批菟丝子配方颗粒峰面积比值

本发明考察了甲醇，80%甲醇，乙醇，80%乙醇作为提取溶媒，用乙醇及80%乙醇所得的色谱峰较少，甲醇及80%甲醇所得的色谱峰较多，且峰数目及峰型相差不大，但是80%甲醇提取的供试品所得的各色谱峰峰面积较大，故80%甲醇将菟丝子配方颗粒的化学成分提取较为完全，故最终选用80%的甲醇作为提取溶媒。

本发明比较了用80%甲醇回流与超声提取90分钟、60分钟、30分钟，结果回流与超声提取的效果基本相同，在超声30分钟就能将菟丝子药材及配方颗粒的主要成分提取完全，故确定提取方式及时间为用80%的甲醇超声提取30分钟。

本发明确定了菟丝子配方颗粒的5个共有峰，13批菟丝子配方颗粒的特征图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明13批配方颗粒的生产工艺稳定，同时原药材的质量也较稳定，本发明所建立的HPLC指纹图谱方法可有效地控制菟丝子配方颗粒的质量。

本发明与现有技术相比的突出优点：

1.由于配方颗粒失去了药材的外观与性状，增加了质量鉴别的难度，本发明建立的指纹图谱方法，借助于高效液相色谱仪可全面、准确的反应配方颗粒的内在品质、真伪优劣，是未来中药材及中药配方颗粒检测的趋势。

2.本发明建立的指纹图谱借助于高新仪器进行检测，检测结果更客观、全面，减少了人为观察外观、性状带来的误差。

3.本发明方法经方法学实验验证，重复性好、精确度及准确度高，可有效的控制菟丝子配方颗粒的质量，也为其他配方颗粒的质量控制方法提供了参考的依据。

附图说明

图1菟丝子配方颗粒HPLC特征图谱的色谱峰指认；

图2 13批菟丝子配方颗粒特征图谱。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

检测菟丝子颗粒的指纹图谱

仪器

Waters 2695高效液相色谱系统（Waters 2489紫外检测器，Empower Pro色谱工作站）；XP26百万分之一天平（METTLER TOLEDO）、BS110 S万分之一天平（赛多利斯）、CQ-25-6超声波清洗器（上海音波声电科技公司）。

试药

甲醇为色谱纯，水为纯净水，金丝桃苷（111521-200303）购自中国药品生物制品检定所；13批菟丝子配方颗粒（广东一方制药有限公司，批号：0701045、0711137、0809123、0807116、0811114、0812561、0903125、0907077、0911086、1003128、1003342、1006124、1011116）。

色谱条件

色谱柱：Hypersil（250mm×4.6mm，5μm）柱；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱：0~8min，10%~13%A；8~38min，13%A；38~48min，13%~17%A；48~60min，17%~20%A；60~65min，20%~10%A；检测波长：360nm；流速1.0ml/min；柱温：25℃；进样量25μl。

对照品溶液的制备

精密称定金丝桃苷对照品，加甲醇制成每1ml含47.5μg的溶液，即得对照品溶液。

供试品溶液的制备

精密称定菟丝子配方颗粒粉末0.5g，置锥形瓶中，加80%甲醇25ml，超声处理（功率200W，频率25kHz）30分钟，放冷，加80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

重复性试验

精密度试验

稳定性试验

特征图谱的色谱峰的指认

精密吸取供试品溶液及金丝桃苷对照品溶液各25 μl，注入高效液相色谱仪，在32.33min处的色谱峰为金丝桃苷的色谱峰，金丝桃苷的峰分布正态，达到基线分离，且峰面积占总峰面积的25～56%，故选择金丝桃苷的峰作为参考峰，标记为峰S，其他特征峰标记为峰1～4。见图1。

菟丝子配方颗粒特征图谱的建立

取13批菟丝子配方颗粒的供试品溶液，进样，记录65min的色谱图，以金丝桃苷对照品为参照峰，结果13批配方颗粒有5个共有峰，分别在7.6，26.2，32.4，35.6，51.8min出峰，见图2，共有峰的峰面积、相对峰面积值、相对保留时间均具有较好的重复性。5个共有峰的平均相对保留时间依次为：0.238、0.815、1.000、1.106、1.627，RSD均小于2.0%。这5个共有峰出峰时间较为稳定，可作为菟丝子配方颗粒的特征峰。

Claims

1.一种菟丝子配方颗粒指纹图谱，其特征在于：菟丝子配方颗粒的特征图谱有5个特征峰，以金丝桃苷峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内，规定值为：1号峰0.24、2号峰0.82、S峰1.00、3号峰1.11、4号峰1.63。

2.一种菟丝子配方颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于：采用高效液相色谱法，包括如下步骤：

（2）供试品溶液的制备：精确称定菟丝子配方颗粒粉末0.2~0.8g，置锥形瓶中，加体积浓度为80%~100%的甲醇溶液15~35ml，超声处理15~60min，放冷，用80%~100%的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.1~0.5μm微孔滤膜，滤过，即得供试品溶液；

3.根据权利要求2所述的一种菟丝子配方颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于：供试品溶液的制备中所述的超声处理为功率100~300W，频率20~30KHz。

4.根据权利要求2所述的一种菟丝子配方颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于：高效液相色谱法采用的仪器为Waters 2695高效液相色谱系统，Empower Pro色谱工作站，Waters 2489紫外检测器。

5.根据权利要求2所述的一种菟丝子配方颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤（3）所述的色谱条件是色谱柱：Hypersil：250mm×4.6mm，5μm柱；流动相：A乙腈-B水，梯度洗脱：0~8min，A为10%~13%；8~38min，A 为13%；38~48min，A 为13%~17%；48~60min，A 为17%~20%；60~65min，A 为20%~10%；检测波长：300~360nm；流速0.5~1.5ml/min；柱温：15~35℃；进样量20~30μl。