CN101013117A - 构建菟丝子药材hplc标准指纹图谱和鉴别药材质量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及构建菟丝子药材HPLC标准指纹图谱和鉴别药材质量的方法，用于菟丝子药材质量的鉴别，它公开了供试品中粉在20ml80％甲醇溶液中超声提取60min后，过滤得供试品溶液；高效液相色谱条件：色谱柱迪马C18柱(200×4.6mm，5μm)，柱温30℃；流动相乙腈－1％乙酸溶液，梯度洗脱，流速1ml/min；检测波长350nm。取10批内蒙古产菟丝子药材进行测定，找出共有特征峰，经软件似合建立标准指纹图谱，共有6个主要共有特征峰，为T1至T6号峰，保留时间分别为31.8min，44.3min，46.2min，46.7min，50.1min，68.4min；再用待测药材测定的指纹图谱与标准指纹图谱比较，其相似度大于0.900的药材应用于产品生产。

Description

构建菟丝子药材HPLC标准指纹图谱和鉴别药材质量的方法

技术领域

本发明涉及菟丝子药材HPLC标准指纹图谱的构建方法，以及用此标准指纹图谱鉴别药材质量的方法。

背景技术

菟丝子药材在我国许多省份均有种植，由于品种、产地、采收期不同而造成的质量参差不齐，因而其制成品，质量药效及稳定性也难以保证。现行国家药典标准中菟丝子的质量控制关键部分为显微鉴别。这些对于此药材的真伪鉴别和质量评价显然是远远不够的。目前，对菟丝子中化学成分研究较多，据报道其中含有黄酮、甾醇等类型的成分。但是菟丝子的起效成分现在还不是很清楚——到底是几个成分协同起效，还是其中一个成分起效，还没有成熟的结论。因此要控制菟丝子药材的质量，就不能只针对其中二、三个化学成分，必须对它的物质群整体予以控制，通过科学的方法从由单个化学成分组成的物质群这个整体来全面的控制药材质量。

中药指纹图谱是指某种中药材(提取物、中成药)中所共有的、具有特征性的成分共同组成的光谱或色谱的图谱。它借用了法医学指纹鉴定的概念，运用现代分析技术得到中药材(提取物、中成药)的一系列特征信号，由这些特征信号组成的图谱具有个体的惟一性，代表了被测物的特征。中药指纹图谱技术从二维的“面”来鉴别中药材(提取物、中成药)的异同，强调的是图谱间整体的相似性。指纹图谱技术可以用在鉴别中药的真伪、生产质量监控、药材到成品某些成分的变化、同种产品之间的质量差异等多个方面，它提供了较常规质量标准更深层次的质量评价模式，增强了中药质量的可控性，是得到国外很多国家认可的植物药质量评价模式。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱技术对于有效控制中药材(提取物、中成药)的质量，具有重要的意义。

当前，有学者研究了用HPLC检测菟丝子中三个黄酮类成分的方法，但是用反相高效液相色谱一次性检测出菟丝子多个成分并建立指纹图谱的方法未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建菟丝子药材HPLC标准指纹图谱和鉴别药材质量的方法，可用作全面评价药材质量，保证药材质量在一定范围内稳定、一致、可控。

本发明的技术解决方案是：

第一步，构建标准指纹图谱，方法如下。

(a)、供试品溶液制备：菟丝子药材磨成中粉，称取1.0g于具塞锥形瓶中，加入20ml 80％甲醇溶液，超声提取60min，放冷，滤过，取续滤液用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。

(b)、色谱条件：Agilent 1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，检测波长350nm；迪马C18柱(200×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流速1ml/min；流动相为乙腈、1％乙酸溶液，梯度洗脱，洗脱比例为：

T(min)      CH3CN(％)      1％CH3COOH(％)

0           5              95

20          5              95

80          45             55

90          5              95

(c)、测定法：分别吸取供试品溶液20ul注入液相色谱仪测定，记录90min的色谱图。

通过对10批内蒙古产菟丝子药材进行测定，找出其主要共有特征峰，经软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》拟合建立HPLC标准指纹图谱。共选出6个主要共有特征峰，为T1至T6号峰，保留时间分别为：31.8min，44.3min，46.2min，46.7min，50.1min，68.4min。其中T6号峰虽然不稳定(见实施例中的方法学考察)，但在24h内仍然被明显的检出，是菟丝子的特征峰，所以把此峰也列入指纹图谱中。所述6个峰保留时间的相对标准偏差RSD％均小于1％。10批药材的指纹图谱与标准指纹图谱间的整体相似度经软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》计算均大于0.900。

第二步，以上述相同的方法测定待测菟丝子药材样品的指纹图谱。

第三步，将待测菟丝子药材的指纹图谱与标准指纹图谱比较，采用软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004B》计算整体相似度，筛选相似度大于0.900的菟丝子药材应用于产品生产。

另外，需要说明的是：由于指纹图谱技术还未成为国家标准，所以本发明中试验和生产用菟丝子药材均要达到药典中的相应国家标准要求。

本发明运用反相高效液相色谱一次性检测出菟丝子多个成分，找出10批药材共有的色谱峰作为特征峰，建立了标准指纹图谱，也就是将色谱图中反映出来的成分色谱峰的顺序、比例和相互制约关系作为药材的特征。在相同色谱条件下其它批次药材指纹图谱与已建立的标准指纹图谱比较，通过计算整体相似度评价药材质量。

本发明具有以下优点：

1.标准指纹图谱中的6个主要特征峰为菟丝子药材的主要成分，有效表征了菟丝子药材的质量，从而实现对菟丝子最大可能的化学成分检测，有利于对菟丝子药材质量的全方面监控。

2.与现有方法相比，本发明为全面、准确评价菟丝子药材的质量提供了新的对照标准。它即避免了只测定一、二个化学成分而判定菟丝子整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。

3.通过本发明增强对药材真伪的辨识力，并从所含化学成分整体具有共性特征的角度更全面地评价药材质量，保证药材质量在一定范围内稳定、一致、可控。

4.本发明简便、快捷、稳定、精密度高、稳定性好、易于掌握。

附图说明

图1是本发明的HPLC标准指纹图谱。

具体实施方式

一、构建菟丝子HPLC标准指纹图谱

1、仪器与试药

1.1、仪器

Agilent 1100液相色谱仪，DAD检测器；上海必能SB5200超声波清洗器。

1.2、试药

甲醇，分析纯；乙酸，分析纯；乙腈，色谱纯，迪马公司出品；超纯水，娃哈哈纯净水；10批内蒙古产菟丝子药材。

上述菟丝子药材经检测达到药典中的相应国家标准要求。

2、色谱条件

检测波长350nm；迪马C18柱(200×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流速1ml/min；流动相为乙腈、1％乙酸溶液，梯度洗脱，洗脱比例为：

T(min)      CH3CN(％)      1％CH3COOH(％)

0           5              95

20          5              95

80          45             55

90          5              95

3、标准指纹图谱建立

3.1、供试品溶液制备：菟丝子药材磨成中粉，称取1.0g于具塞锥形瓶中，加入20ml 80％甲醇溶液，超声提取60min，放冷，滤过，取续滤液用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。

3.2、测定法：分别吸取供试品溶液20ul注入液相色谱仪测定，记录90min的色谱图。

3.3、构建标准指纹图：按照所述方法，通过对10批内蒙古产菟丝子药材进行测定，找出其主要共有特征峰，经软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》拟合建立HPLC标准指纹图谱。共选出6个主要共有特征峰，为T1至T6号峰，保留时间分别为：31.8min，44.3min，46.2min，46.7min，50.1min，68.4min。其中T6号峰虽然不稳定(见方法学考察)，但在24h内仍然被明显的检出，是菟丝子的特征峰，所以把此峰也列入指纹图谱中。所述6个峰保留时间的相对标准偏差RSD％均小于1％。10批药材的指纹图谱与标准指纹图谱间的整体相似度经软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》计算均大于0.900。

3.4、方法学考察

3.4.1、精密度考察

以同一供试液，连续进样6次，考察仪器的精密度。以特征峰保留时间和峰面积计算，  结果6个主要共有特征峰保留时间的RSD％＜0.3％，峰面积除了T6号峰在供试液中变化较大外，其它峰的RSD％＜3％。结果表明此方法精密度良好。

3.4.2、稳定性考察

以同一供试液，在0，1.5h，3h，4.5h，6h，24h进样，考察样品的稳定性。考察指标同精密度。结果6个主要共有特征峰保留时间的RSD％＜0.3％，峰面积除了T6号峰在供试液中变化较大外，其它峰的RSD％＜3％。结果表明供试液在24h内稳定。

3.4.3、重复性考察

在同一批菟丝子药材中，按照制备方法，分别重复提取5份，然后进行HPLC分析，以主要成分峰面积计算。结果6个主要共有特征峰峰面积除了T6号峰在供试液中变化较大外，其它峰的的RSD％＜3％。结果表明此方法重复性良好。

二、按照所述检测方法和条件对2批待测市售菟丝子药材(除已采用的10批以外)进行测定，采集90min色谱图。此待测市售菟丝子药材经测定，结果符合药典中菟丝子药材标准。

三、将采集到的待测菟丝子药材的指纹图谱与标准指纹图谱比较，采用软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004B》计算整体相似度，结果相似度分别为0.962，0.812。两批药材中与标准指纹图谱的相似度大于0.900的那一批，可以在生产中使用。

Claims (1)

1、构建菟丝子药材HPLC标准指纹图谱和鉴别药材质量的方法，其特征是：

第一步，构建标准指纹图谱，方法如下；

(a)、供试品溶液制备：菟丝子药材磨成中粉，称取1.0g于具塞锥形瓶中，加入20ml80％甲醇溶液，超声提取60min，放冷，滤过，取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得；

(b)、色谱条件：Agilent 1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，检测波长350nm；迪马200×4.6mm，5μm的C18柱；柱温30℃；流速1ml/min；流动相为乙腈、1％乙酸溶液，梯度洗脱，洗脱比例为：

T-min    CH3CN％    1％CH3COOH％

0        5          95

20       5          95

80       45         55

90       5          95

(c)、测定法：分别吸取供试品溶液20ul注入液相色谱仪测定，记录90min的色谱图；

通过对10批内蒙古产菟丝子药材进行测定，找出其主要共有特征峰，经软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》拟合建立HPLC标准指纹图谱，共选出6个主要共有特征峰，为T1至T6号峰，保留时间分别为：31.8min，44.3min，46.2min，46.7min，50.1min，68.4min，所述6个峰保留时间的相对标准偏差RSD％均小于1％，10批药材的指纹图谱与标准指纹图谱间的整体相似度经软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》计算均大于0.900；

第二步，以上述相同的方法测定待测菟丝子药材样品的指纹图谱；

第三步，将待测菟丝子药材的指纹图谱与标准指纹图谱比较，采用软件——《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004B》计算整体相似度，筛选相似度大于0.900的菟丝子药材应用于产品生产。