CN1907340B - 一种测定肾石通制剂中槲皮素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定“肾石通”(《中华人民共和国卫生部标准》中药成方制剂第02册所载品种“肾石通冲剂”)制剂中金钱草、萹蓄含量的方法及其测定的标准,属于中药制剂领域。本发明测定方法及其测定的标准是通过采用高效液相色谱法测定“肾石通”制剂中槲皮素含量实现;其中检测标准为每次所制剂含金钱草、萹蓄以槲皮素(C15O10H7)计不得少于0.2mg。本发明测定方法使“肾石通”制剂质量更稳定、可控。
Description
技术领域 制药技术
背景技术 “肾石通冲剂”为临床治疗肾结石、输尿管结石、膀胱结石、尿道结石的常用中成药,但其制剂质量标准中无含量测定,制剂质量可控性差,采用高效液相法可以更好的控制制剂质量,以确保临床用药的安全性、有效性、可控性。
发明内容 “肾石通”处方来源于《中华人民共和国卫生部标准》中药成方制剂第02册WS3-B-0304-90所载品种“肾石通冲剂”,其制剂常用的剂型有冲剂(颗粒、泡腾颗粒)、硬(软)胶囊剂、(微)丸剂、片剂(还包括咀嚼片、口含片、泡腾片、分散片)等,处方中金钱草、萹蓄含主要成分为槲皮素,因此须对制剂中槲皮素的含量进行测定。以“肾石通丸”为样品,建立高效液相色谱法(中国药典2000年一部附录VI D)测定“肾石通”制剂中槲皮素含量。
“肾石通冲剂”处方:
金钱草100g 王不留行(炒)100g 萹蓄60g
延胡索(醋制)30g 鸡内金(烫)40g 丹参40g
木香20g 瞿麦50g 牛膝30g
海金砂40g
槲皮素 照高效液相色谱法(中国药典2000年一部附录VI D)测定。
金钱草为方中主药,含有槲皮素化合物,另方中萹蓄亦有槲皮素化合物,因此需对制剂中槲皮素含量进行测定,以控制制剂质量。
槲皮素对照品(供含量测定用):由中国药品生物制品检定所提供,批号:081-9304。
1.游离槲皮素含量测定
色谱条件:日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪,Diamonsil C18(250×4.6mm)。
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填料,以甲醇-0.2%磷酸溶液(55∶45)为流动相,检测波长370nm,理论板数以槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备:精密称取槲皮素对照品5mg,置100ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml中含槲皮素0.02mg)。
供试品溶液的制备:取本品适量,研细,取细粉约3g,精密称定,置100ml锥形瓶中,加甲醇溶液40ml,置85℃水浴上回流1小时,冷却至室温,转入50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,精密吸2ml于10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,过微孔滤膜(0.45um),取滤液作为供试品溶液。
阴性样品溶液制备:取缺金钱草、萹蓄样品,研细,同法制成阴性样品溶液。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
在以上色谱条件下,取对照品溶液和供试品溶液进样,记录色谱图,结果见表1。
由表1可得,三批制剂中游离槲皮素含量甚少。
2.结合槲皮素含量测定
(1)色谱条件:日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪,Diamonsil C18(250×4.6mm)。
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填料,以甲醇-0.2%磷酸溶液(55∶45)为流动相,检测波长370nm,理论板数以槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备:精密称取槲皮素对照品5mg,置100ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml中含槲皮素0.05mg)。
供试品溶液的制备:取本品适量,研细,取细粉约3g,精密称定,置100ml锥形瓶中,加甲醇溶液30ml和盐酸1ml,置85℃水浴上回流1小时,冷却至室温,转入50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,精密吸2ml于10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,过微孔滤膜(0.45um),取滤液作为供试品溶液。
阴性样品溶液制备:取缺金钱草、萹蓄样品,研细,同法制成阴性样品溶液。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
在以上条件下,取对照品溶液、供试品溶液、甲醇溶剂、辅料和阴性样品溶液进样,记录色谱图,从色谱图可得,槲皮素和样品中的其它组分可以完全分离,且甲醇溶剂无干扰,阴性样品溶液干扰较少(<5%)。
(2)色谱系统适用性试验
柱效:按槲皮素峰计算,色谱系统的理论板数为5000。
分离度:测得槲皮素与其前相邻色谱峰的分离度为1.86,槲皮素与相邻的色谱峰可以完全分离(图15-12)。
拖尾因子:测得槲皮素的拖尾因子为1.02,峰形对称。
(3)供试品溶液制备
①提取溶剂选择:
供试品溶液制备:取样品(030401),研细,取细粉约3g(5份),精密称定,置100ml锥形瓶中,加分别精密加入甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、水溶液30ml和盐酸各1ml,置85℃水浴上回流1小时,冷却至室温,转入50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,精密吸2ml于10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,过微孔滤膜(0.45um),取滤液作为供试品溶液。
对照品溶液制备:取槲皮素对照品适量,精密称定,加甲醇溶解制成每1ml约含0.02mg的溶液。
在选定的色谱条件下,分别取对照品溶液和供试品溶液各10μl进样,记录色谱图,计算含量,结果见表2。
由表2可得,甲醇提取含量最高,故以甲醇为提取溶剂。
②回流(水解)时间考察:
供试品溶液制备:取样品(030401),研细,取细粉约3g(5份),精密称定,置100ml锥形瓶中,加甲醇30ml和盐酸1ml,置85℃水浴上,分别回流0.5、1.0、1.5、2.0、3.0小时,冷却至室温,转入50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,精密吸2ml于10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,过微孔滤膜(0.45um),取滤液作为供试品溶液。在选定的色谱条件下,取供试品溶液各10μl进样,记录色谱图,计算含量,结果见表3。
由表3可得,回流(水解)提取1小时后,含量不再变化,故回流(水解)提取时间确定为1小时。
③加酸量考察:
供试品溶液制备:取样品(030401),研细,取细粉约3g(4份),精密称定,置100ml锥形瓶中,加甲醇30ml,分别加盐酸1.0、2.0、3.0、4.0ml,置85℃水浴上,分别回流1.0小时,冷却至室温,转入50ml量瓶中用甲醇稀释至刻度,摇匀,精密吸2ml于10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,过微孔滤膜(0.45um),取滤液作为供试品溶液。在选定的色谱条件下,取供试品溶液各10μl进样,记录色谱图,计算含量,结果见表4。
由表4可得,加酸量1~4.0ml,槲皮素无明显差别,故加酸量确定为1ml。
(4)检测波长
将阿魏酸对照品溶液于200~400nm范围内进行光谱扫描,在371nm处有最大吸收峰,参照《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第13册“肝苏颗粒”(第87页)槲 皮素含量测定检测波长370nm,故选370nm作为检测波长。
(5)精密度
对照品溶液制备:精密称取槲皮素对照品适量,加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.02mg的溶液。
供试品溶液制备:取本品适量,研细,取细粉约3g,精密称定,置100ml锥形瓶中,加甲醇溶液30ml和盐酸1ml,置85℃水浴上回流1小时,冷却至室温,转入50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,精密吸2ml于10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,过微孔滤膜(0.45um),取滤液作为供试品溶液。
分别取对照品溶液和供试品溶液各10μl,连续进样5次,记录色谱图,测定峰面积,计算平均峰面积值和RSD,结果见表5。
结果表明精密度良好。
(6)稳定性
①日内稳定性:
对照品溶液制备:同精密度项下
供试品溶液制备:同精密度项下
在选定色谱条件下,分别于0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时取对照品溶液和供试品溶液各10μl进样,记录色谱图,测定峰面积值,计算平均峰面积和RSD,结果见表6。
②日间稳定性:
在选定色谱条件下,分别于0天、1天、2天、3天、15天,取对照品溶液和供试品溶液各10μl进样,记录色谱图,测定峰面积值,计算平均峰面积和RSD,结果见表7。
结果表6、7可得,对照品溶液1天内稳定,供试品溶液在5天内稳定。
(7)重复性
对照品溶液制备:同精密度项下。
供试品溶液制备:同精密度项下,共5份。
取对照品溶液和供试品溶液各10μl进样,测定峰面积值,用外标法计算含量,结果见表8。
重复性RSD为1.37%,表明重复性良好。
(8)线性和范围
对照品溶液制备:精密称取槲皮素对照品适量,加甲醇溶解并分别稀释制成每1ml含0.00194mg、0.0194mg、0.194mg的对照品溶液。
分别取对照品溶液0.00194mg/ml进样3μl,对照品溶液0.0194mg/ml进样1μl、3μl、6μl、9μl,对照品溶液0.0194mg/ml进3μl、6μl,记录色谱图,测定峰面积,以峰面积(Y)对进样量(X,μg)回归,结果见表9。
回归方程:Y=-59199.57+13917179.62X r=0.9996
以上结果表明,进样量在0.00582~1.1640ug范围内,峰面积与进样量呈良好线性关系。
(9)加样回收试验
对照品溶液制备:精密称取槲皮素对照品适量,加甲醇溶解并分别稀释制成每1ml含0.02mg的对照品溶液。
供试品溶液制备:精称取已知含量样品(030401),分别准确加入对照品溶液(1号、2号、3号样品加槲皮素对照品0.2mg/ml×2ml,4号、5号、6号样品加槲皮素对照品0.2mg/ml×2.5ml,7号、8号、9号样品加槲皮素对照品0.2mg/ml×3ml)适量,置100ml锥形瓶中,加甲醇溶液30ml和盐酸1ml,置85℃水浴上回流1小时,冷却至室温,转入50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,精密吸2ml于10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,过微孔滤膜(0.45um),取滤液作为供试品溶液。
在选定色谱条件下,分别取对照品溶液和供试品溶液各10μl进样,测定峰面积值,按外标法计算含量,并计算加样回收率,测定结果见表10。
加样平均回收率为97.25%,RSD为1.44%。
(10)样品测定
仪器:日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填料,以甲醇-0.2%磷酸溶液(55∶45)为流动相,检测波长370nm,理论板数以槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备:精密称取槲皮素对照品适量,加甲醇溶解并分别稀释制成每1ml含0.02mg的对照品溶液。
供试品溶液的制备:取本品适量,研细,取细粉约3g,精密称定,置100ml锥形瓶中,加甲醇溶液30ml和盐酸1ml,置85℃水浴上回流1小时,冷却至室温,转入50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,精密吸2ml于10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,过微孔滤膜(0.45um),取滤液作为供试品溶液。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
按以上方法测10批样品中槲皮素含量见表11。
表11 样品含量测定
由表11可得,10批样品“肾石通微丸”含量均高于0.36mg/g,故规定本品每袋含金钱草、萹蓄以槲皮素(C15O10H7)计,不得少于0.36mg。
具体实施方式
1、“肾石通冲剂”中槲皮素含量测定
槲皮素 照高效液相色谱法(中国药典2000年一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填料,以甲醇-0.2%磷酸溶液(55∶45)为流动相,检测波长370nm,理论板数以槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量,精密称定,加甲醇溶解制成每1ml约含0.02mg的溶液。
供试品溶液的制备:取本品适量,研细,取细粉约3g,精密称定,置100ml锥形瓶中,加甲醇溶液30ml和盐酸1ml,置85℃水浴上回流1小时,冷却至室温,转入50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,过微孔滤膜(0.45um),取滤液作为供试品溶液。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品每袋含金钱草、萹蓄以槲皮素(C15O10H7)计,不得少于0.36mg。
2、“肾石通微丸”中槲皮素含量测定
槲皮素 照高效液相色谱法(中国药典2000年一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填料,以甲醇-0.2%磷酸溶液(55∶45)为流动相,检测波长370nm,理论板数以槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量,精密称定,加甲醇溶解制成每1ml约含0.02mg的溶液。
供试品溶液的制备:取本品适量,研细,取细粉约3g,精密称定,置100ml锥形瓶中,加甲醇溶液30ml和盐酸1ml,置85℃水浴上回流1小时,冷却至室温,转入50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,精密吸2ml于10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,过微孔滤膜(0.45um),取滤液作为供试品溶液。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
本品每袋含金钱草、萹蓄以槲皮素(C15O10H7)计,不得少于0.36mg。
Claims (1)
1.一种测定肾石通制剂中槲皮素含量的方法,其特征在于:采用高效液相色谱法测定,其中:
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填料,以甲醇-0.2%磷酸溶液(55∶45)为流动相,检测波长370nm,理论板数以槲皮素峰计算应不低于2500;
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量,精密称定,加甲醇溶解制成每1ml含0.02mg的溶液;
供试品溶液的制备:取肾石通制剂,研细,取细粉约3g,精密称定,置100ml锥形瓶中,加甲醇溶液30ml和盐酸1ml,置85℃水浴上回流1小时,冷却至室温,转入50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,过0.45μm微孔滤膜,取滤液作为供试品溶液;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
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张集盘等.RP-HOLC法测定金钱草中槲皮素和山奈素两种黄酮成分的含量.江苏药学与临床研究13 1.2005,13(1),31-33. * |
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