CN109781884A - 一种前列欣胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种前列欣胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，该方法包括以下步骤：供试品溶液的制备、混合对照品溶液的制备、利用超高效液相色谱仪检测及利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统、用平均值计算法生成前列欣胶囊的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。该前列欣胶囊指纹图谱的建立方法具有化合物分离度高、重复性好的优点；使用该方法提供的指纹图谱对前列欣胶囊中的特征化合物进行测定，能有效地表征前列欣胶囊的质量，有利于全面监控药物的质量。

Description

一种前列欣胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

技术领域

本发明涉及指纹图谱建立方法技术领域，具体为一种前列欣胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。

背景技术

指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药、某种生物体、某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性的一种手段。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和X-射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广、使用经验丰富等特点，目前已成为中药指纹图谱技术的首选方法，但我们也应该注意到：对于某些中药复方等复杂基质，由于所含化合物种类多、成分的含量参差不齐等因素，HPLC并不能完全满足我们的分离要求，所得指纹图谱也不能完全展示其化学成分全貌。

超高效液相色谱法(UPLC)采用了粒径更小的色谱柱填料，根据液相色谱技术的原理，减少填料的粒径能提高理论塔板高度，从而能提高分离效率，因此，跟普通高效液相色谱法相比，超高效液相色谱能大幅度改善液相色谱分离度、样品通量和灵敏度，使液相色谱的分离能力得到进一步的提高和扩展，极大地提高了分析工作的效率和质量，因而在分析领域得到广泛而深入的应用。

前列欣胶囊是由我国泌尿男科泰斗刘猷枋教授依据多年临床经验研制而成，选用丹参、桃仁(炒)、没药(炒)、赤芍、红花、泽兰等14味中药材组成，具有活血化瘀、清热利湿之功效，主治瘀血凝聚、湿热下注所致的淋证，症见尿急、尿痛、排尿不畅、滴沥不尽；慢性前列腺炎、前列腺增生见上述证候者。该制剂现执行标准仅对欧前胡素进行了定量分析，但由于前列欣胶囊药味繁多，成分复杂，个别成分的定性定量分析仍难以全面反应药品的全面信息，CN201610873671虽然构建了前列欣胶囊的HPLC指纹图谱，但该方法存在分析时间长、特征峰数量少的缺点，容易导致指纹图谱的准确性和可靠性产生波动，不利于全面监控前列欣胶囊的质量。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种前列欣胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，该前列欣胶囊指纹图谱的建立方法具有化合物分离度高、重复性好的优点；使用该方法提供的指纹图谱对前列欣胶囊中的特征化合物进行测定，能有效地表征和全面监控前列欣胶囊的质量。

为建立前列欣胶囊指纹图谱，本发明提供了一种前列欣胶囊指纹图谱的建立方法，步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：取一定重量的前列欣胶囊内容物置于容器中，向容器中加入甲醇并进行超声处理，冷却，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(2)混合对照品溶液的制备：分别取一定重量没食子酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、迷迭香酸、丹酚酸A、水合氧化前胡素、花椒毒素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、珊瑚菜素和隐丹参酮，置于同一容器中，然后向该容器中加入甲醇并进行超声处理，冷却，摇匀，滤过，取滤液即得混合对照品溶液，其中对香豆酸设为参照化合物，后续相应的对香豆酸色谱峰设为参照峰；

(3)分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图；

(4)将步骤(3)获得的前列欣胶囊色谱文件从仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；用平均值计算法生成前列欣胶囊的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。

在上述前列欣胶囊指纹图谱建立方法的步骤(1)中，制备供试品溶液的具体过程为：取前列欣胶囊内容物0.5～1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇20ml，在300W/40kHz超声条件下超声处理30-40min。

在上述前列欣胶囊指纹图谱建立方法的步骤(3)中，分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，记录80min的色谱图。

在上述前列欣胶囊指纹图谱建立方法的步骤(3)中，前列欣胶囊指纹图谱测定的色谱条件为：以乙腈为流动相A，以体积百分比浓度0.1％甲酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱；流速为0.3ml/min；检测波长为300nm；柱温为25℃；理论板数按对香豆酸峰计算不低于8000；梯度洗脱的流程为：0～5min，5％流动相A，95％流动相B；5～20min，5→10％流动相A，95→90％流动相B；20～50min，10→30％流动相A，90→70％流动相B；50～65min，30→50％流动相A，70→50％流动相B；65～80min，50→72.5％流动相A，50→27.5％流动相B。

在上述前列欣胶囊指纹图谱建立方法的步骤(3)中，色谱柱规格为：AdvanceBioPeptide Mapping，2.7μm,2.1×250mm(PN:651750-902)。

一种前列欣胶囊指纹图谱，其特征峰为与没食子酸对应的2号峰，与新绿原酸对应的6号峰，与绿原酸对应的8号峰，与咖啡酸对应的10号峰，与隐绿原酸对应的11号峰，与对香豆酸对应的S号峰，与异绿原酸B对应的15号峰，与异绿原酸A对应的16号峰，与异绿原酸C对应的17号峰，与迷迭香酸对应的18号峰，与水合氧化前胡素对应的20号峰，与丹酚酸A对应的21号峰，与花椒毒素对应的24号峰，与佛手柑内酯对应的27号峰，与氧化前胡素对应的31号峰，与欧前胡素对应的33号峰，与珊瑚菜素对应的36号峰，与异欧前胡素对应的38号峰，与隐丹参酮对应的41号峰；特征峰以对香豆酸色谱峰为参照，上述19个色谱峰的相对保留时间分别为0.144、0.418、0.673、0.738、0.767、1.000、1.330、1.360、1.430、1.455、1.613、1.663、1.830、1.971、2.153、2.380、2.439、2.495、2.602。

上述前列欣胶囊指纹图谱，特征峰还包括以对香豆酸色谱峰为参照，相对保留时间为0.133的1号峰、相对保留时间为0.154的3号峰、相对保留时间为0.197的4号峰、相对保留时间为0.307的5号峰、相对保留时间为0.595的7号峰、相对保留时间为0.702的9号峰、相对保留时间为0.827的12号峰、相对保留时间为0.891的13号峰、相对保留时间为1.603的19号峰、相对保留时间为1.697的22号峰、相对保留时间为1.753的23号峰、相对保留时间为1.922的25号峰、相对保留时间为1.951的26号峰、相对保留时间为2.030的28号峰、相对保留时间为2.050的29号峰、相对保留时间为2.109的30号峰、相对保留时间为2.237的32号峰、相对保留时间为2.387的34号峰、相对保留时间为2.397的35号峰、相对保留时间为2.480的37号峰、相对保留时间为2.551的39号峰、相对保留时间为2.575的40号峰。

对比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的前列欣胶囊指纹图谱建立方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点。

2、用本发明所提供的方法所建立的前列欣胶囊指纹图谱，具有41个达到有效分离的特征峰，因此，获得的指纹图谱能有效地表征前列欣胶囊的质量，有利于全面监控药物的质量。

3、本发明通过对18个不同批次的前列欣胶囊进行检测，从图谱可以看出，相同位置的色谱峰的相对保留时间的RSD均在2％之内，表明本发明提供的发明具有良好的重现性，使用本发明提供的方法建立的指纹图谱具有可靠性。

附图说明

为更清楚地说明背景技术或本发明的技术方案，下面对现有技术或具体实施方式中结合使用的附图作简单地介绍；显而易见地，以下结合具体实施方式的附图仅是用于方便理解本发明实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图；

图1为本发明提供实施例1提供的色谱条件下混合对照品溶液图谱；

图2为本发明实施例2洗脱梯度考察图谱(一)；

图3为本发明实施例2洗脱梯度考察图谱(二)；

图4为本发明实施例2洗脱梯度考察图谱(三)；

图5为本发明实施例2洗脱梯度考察图谱(四)；

图6为本发明实施例2洗脱梯度考察图谱(五)；

图7为本发明实施例2洗脱梯度考察图谱(六)；

图8为本发明实施例2洗脱系统考察图谱(一)；

图9为本发明实施例2洗脱系统考察图谱(二)；

图10为本发明实施例2洗脱系统考察图谱(三)；

图11为本发明实施例2色谱柱考察图谱(一)；

图12为本发明实施例2色谱柱考察图谱(二)；

图13为本发明实施例2色谱柱考察图谱(三)；

图14为本发明实施例2流速考察图谱(一)；

图15为本发明实施例2流速考察图谱(二)；

图16为本发明实施例2流速考察图谱(三)；

图17为本发明实施例2不同柱温考察图谱(一)；

图18为本发明实施例2不同柱温考察图谱(二)；

图19为本发明实施例2不同柱温考察图谱(三)；

图20为本发明实施例2不同柱温考察图谱(四)；

图21为前列欣胶囊指纹图谱的检测色谱图；

图22为用平均值计算法生成的前列欣胶囊的对照指纹图谱。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，使用的仪器、色谱条件、试剂如下：

仪器设备

Agilent1290超高效超高效液相色谱仪，DAD检测器；

XS105型电子分析天平；

BSA224S-CW型电子分析天平；

力康HEAL FORCE NW(30K)VF纯水机；

KQ-300DE型数控超声波清洗器。

对照品、供试品及试剂：

对照品：没食子酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、迷迭香酸、丹酚酸A、水合氧化前胡素、花椒毒素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、珊瑚菜素和隐丹参酮，均购于成都普菲德生物科技有限公司，用核磁、质谱等手段鉴定了化合物的结构，且经高效液相检测其纯度均≥98％。

供试品：本发明用前列欣胶囊的批号分别为：1612008、1612013、1702003、1702004、1702005、1702006、1702007、1702008、1703001、1703002、1801006、1801007、1801010、1801013、1801014、1803018、1804005、1804006，均由山东宏济堂制药集团股份有限公司生产。

试剂：乙腈，色谱纯，美国默克公司，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

实施例1

使用本发明提供的一种前列欣胶囊指纹图谱的建立方法，对混合对照品溶液进行检测，色谱条件为：

以乙腈为流动相A，以体积百分比浓度0.1％甲酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱；流速为0.3ml/min；检测波长为300nm；色谱柱规格为：AdvanceBio Peptide Mapping，2.7μm,2.1×250mm(PN:651750-902)，柱温为25℃；理论板数按对香豆酸峰计算不低于8000；梯度洗脱的流程为：0～5min，5％流动相A，95％流动相B；5～20min，5→10％流动相A，95→90％流动相B；20～50min，10→30％流动相A，90→70％流动相B；50～65min，30→50％流动相A，70→50％流动相B；65～80min，50→72.5％流动相A，50→27.5％流动相B。

混合对照品溶液的制备：分别精密称取没食子酸10.02mg、新绿原酸10.05mg、绿原酸10.01mg、隐绿原酸9.82mg、咖啡酸9.95mg、对香豆酸10.02mg、异绿原酸A10.04mg、异绿原酸B 9.91mg、异绿原酸C 10.05mg、迷迭香酸9.98mg、丹酚酸A 10.00mg、水合氧化前胡素10.06mg、花椒毒素10.09mg、佛手柑内酯9.95mg、氧化前胡素9.98mg、欧前胡素10.01mg、异欧前胡素10.03mg、珊瑚菜素9.97mg和隐丹参酮9.99mg，置于同一10ml容量瓶中，然后向容量瓶中加入甲醇，超声溶解，冷却，定容，摇匀，滤过，取滤液即得混合对照品溶液；

精密吸取混合对照品溶液1μl，注入超高效液相色谱仪，记录80min的色谱图，图谱见图1。

在上述19种化合物中，对香豆酸在前列欣胶囊中的含量较稳定，且在图谱中保留时间适中、分离度较好，因此选择对香豆酸作为参照物，后续相应的对香豆酸色谱峰作为参照峰。

实施例2色谱条件的选择及方法验证

色谱条件选择

(一)检测波长的选择

除检测波长条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。二极管阵列检测器的波长范围是190～400nm，通过比较不同波长下样品的色谱图，依据色谱峰的数量、色谱峰响应值、基线是否稳定等原则，最终选择300nm作为前列欣胶囊指纹图谱的检测波长。

(二)洗脱梯度考察

除洗脱梯度条件外，其余色谱条件与实施例1相同，梯度洗脱条件分别按照表1、表2、表3、表4、表5和表6进行。

表1溶剂洗脱程序(一)

表2溶剂洗脱程序(二)

表3溶剂洗脱程序(三)

表4溶剂洗脱程序(四)

表5溶剂洗脱程序(五)

表6溶剂洗脱程序(六)

供试品溶液的制备：精密称取批号为1804006批的前列欣胶囊内容物0.8037g，置于容器中，向容器中加入甲醇20ml，并在300W/40kHz超声条件下超声处理30min，冷却，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

精密吸取供试品溶液1μl，注入超高效液相色谱仪，记录80min的色谱图，图谱见图2-图7，根据试验结果，选择洗脱程序(六)为指纹图谱洗脱条件。

(三)洗脱系统的选择

除洗脱系统外，其他色谱条件与实施例1相同；按照以下洗脱系统进行洗脱：乙腈-0.1％乙酸水溶液、乙腈-0.1％甲酸水溶液和乙腈-0.1％磷酸水溶液系统。

供试品溶液的制备方法同实施例3，供试品的称样量为0.8009g，精密吸取供试品溶液1μl，注入超高效液相色谱仪，记录80min的色谱图，图谱见图8-图10。

通过比较乙腈-0.1％乙酸水溶液、乙腈-0.1％甲酸水溶液和乙腈-0.1％磷酸水溶液系统，发现乙腈-0.1％甲酸水溶液系统各成分的分离度最理想，基线基本平稳，因此选用乙腈-0.1％甲酸水溶液作为流动相洗脱系统。

(四)色谱柱考察

除色谱柱条件外，其他色谱条件与实施例1相同，选用以下色谱柱进行考察，Agilent AdvanceBio Peptide Map(2.1×250mm,2.7μm)、Agilent SB-C18(2.1×50mm,RRHD 1.8μm)和Waters Acquity UPLC BEH C18column(2.1×100mm,1.7μm)。

供试品溶液的制备方法同实施例3，供试品的称样量为0.8014g，精密吸取供试品溶液1μl，注入超高效液相色谱仪，记录80min的色谱图，图谱见图11-图13。

结果显示，AdvanceBio Peptide Map(2.1×250mm,2.7μm)对样品的分离效果较好，因此选择用该类型色谱柱为前列欣胶囊指纹图谱分析柱。

(五)流速考察

除流速条件外，其他色谱条件与实施例1相同，分别按照以下流速对供试品溶液进行色谱检查，流速为0.2ml/min、0.3ml/min和0.4ml/min。

供试品溶液的制备方法同实施例3，供试品的称样量为0.8021g，精密吸取供试品溶液1μl，注入超高效液相色谱仪，记录80min的色谱图，图谱见图14-图16。

结果显示，当流速为0.3ml/min时，各成分分离度和峰形较好，且基线相对平稳，故选择流速为0.3ml/min。

(六)柱温考察

除柱温条件外，其他色谱条件与实施例1相同，分别按照以下柱温对供试品溶液进行色谱检查，柱温为20℃、25℃、30℃和35℃。

供试品溶液的制备方法同实施例3，供试品的称样量为0.8011g，精密吸取供试品溶液1μl，注入超高效液相色谱仪，记录80min的色谱图，图谱见图17-图20。

结果显示，随着柱温的升高，后段极性较小的成分分离度越来越差，对于前端较大极性的成分，柱温为25℃时的分离度和色谱峰的对称性要好于20℃时，再考虑到实验室和仪器的控温能力，选择25℃为最佳柱温。

供试品溶液制备的优化

(一)提取方法的选择

取批号为1801006批的前列欣胶囊内容物，研细，精密称取2份，分别为0.8014g和0.7998g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，考察超声提取(300W，40KHz)30min和回流提取30min，放冷，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

分别精密称取上述两份供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，记录80min的色谱图，以色谱峰个数和主峰峰面积除以取样量为评价指标，试验结果表明，超声与回流两种方式提取效果相当，考虑到超声提取操作简单易行，故选择超声提取法。

(二)提取溶剂的选择

取批号为1801006批的前列欣胶囊内容物，研细，精密称取5份，分别为0.8012g、0.8010g、0.7996g、0.8107g和0.8007g，分别置于具塞锥形瓶中，五个锥形瓶中分别精密加入水、体积百分比浓度为50％甲醇、100％甲醇、体积百分比浓度为50％乙醇、100％乙醇各20ml，超声提取(250W，40KHz)30min，放冷，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

分别精密称取上述五份供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，记录80min的色谱图，以色谱峰峰型、色谱峰个数和主峰峰面积除以取样量为评价指标进行分析，试验结果表明，100％甲醇提取时的效果最佳，且所得色谱图的基线最平稳，因此选择100％甲醇为提取溶剂。

(三)提取时间的选择

取批号为1801006批的前列欣胶囊内容物，研细，精密称取4份，分别为0.8001g、0.8008g、0.8101g和0.7999g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，考察超声提取(300W，40KHz)30min和超声提取(300W，40KHz)40min，放冷，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

分别精密称取上述五份供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，记录80min的色谱图，以色谱峰个数和主峰峰面积除以取样量为评价指标进行分析，试验结果表明，随着超声时间的增长，各成分提取率逐渐增大，但超声30min和超声40min各成分的提取率基本相同，考虑到能源节约问题，选择提取时间为30min。

(四)溶剂用量的选择

取批号为1801006批的前列欣胶囊内容物，研细，精密称取3份，分别为0.8017g、0.8124g和0.8011g，分别置于具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇10ml、20ml、30ml、40ml，超声提取(300W，40KHz)30min，放冷，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

分别精密称取上述五份供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，记录80min的色谱图，以色谱峰个数和主峰峰面积除以取样量为评价指标进行分析，试验结果表明，溶剂用量在10～40ml之间，各色谱峰均提取较充分，而溶剂用量为10ml时，样品黏度大，难于处理，选择溶剂用量为20ml。

综合上述试验结果，确定前列欣胶囊指纹图谱供试品溶液的制备方法为：取本品粉末约0.8g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20ml，超声(300W，40kHz)处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

方法学验证

(一)精密度实验

对本发明提供的前列欣胶囊指纹图谱建立方法进行精密度实验，过程如下：

(1)供试品溶液的制备：取批号为1804006批的前列欣胶囊内容物，研磨，精密称取0.8017g，置于具塞锥形瓶中，向锥形瓶中加入甲醇20ml，并在300W/40kHz超声条件下超声处理30min，冷却，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

(2)精密吸取供试品溶液1μl，注入超高效液相色谱仪，依照实施例1的色谱条件进行梯度洗脱，重复进样6次，分别记录80min的色谱图。

计算主要色谱峰(占总峰面积1％以上)的相对保留时间(见表7)、相对峰面积(见表8)，由表7和表8可以看出，仪器精密度良好。

表7精密度考察结果(相对保留时间)

表8精密度考察结果(相对峰面积)

(二)溶液稳定性试验

对本发明提供的前列欣胶囊指纹图谱建立方法溶液稳定性实验，过程如下：

(1)供试品溶液的制备：取批号为1804006批的前列欣胶囊内容物，研磨，精密称取0.8102g，置于具塞锥形瓶中，向锥形瓶中加入甲醇20ml，并在300W/40kHz超声条件下超声处理30min，冷却，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

(2)将供试品溶液分别在0h、3h、8h、11h、16和24h进样，记录指纹色谱图谱，共测定6个时间点，计算主要色谱峰(占总峰面积1％以上)的相对保留时间和相对峰面积，结果见表9和表10，结果表明供试品溶液在室温条件下24小时内稳定性良好。

表9稳定性考察结果(相对保留时间)

表10稳定性考察结果(相对峰面积)

(三)重复性试验

对本发明提供的前列欣胶囊指纹图谱建立方法进行重复性试验，过程如下：

(1)供试品溶液的制备：取批号为1804006批的前列欣胶囊内容物，置于容器中，向容器中加入甲醇20ml，并在300W/40kHz超声条件下超声处理30min，冷却，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；同法制备供试品溶液6份，胶囊内容物的称样量分别为：0.8125g、0.8067g、0.8132g、0.8078g、0.8096g、0.8117g。

(2)分别精密吸取供试品溶液和参照峰溶液，注入超高效液相色谱仪，依照提供的色谱条件进行梯度洗脱，记录色谱图。

计算主要色谱峰(占总峰面积1％以上)的相对保留时间(见表11)、相对峰面积(见表12)：

表11前列欣胶囊指纹图谱建立方法重复性考察结果(相对保留时间)

表12前列欣胶囊指纹图谱建立方法重复性考察结果(相对峰面积)

由表11和表12可以看出，相对保留时间的RSD及相对峰面积的RSD均小于2％，表明该方法重复性良好。

实施例3指纹图谱的建立

1、前列欣胶囊指纹图谱的检测

取批号分别为：1612008、1612013、1702003、1702004、1702006、1702007、1702008、1703001、1703002、1801006、1801007、1801010、1801013、1801014、1802005、1803018、1804005、1804006的前列欣胶囊，按照以下步骤进行检测：

(1)供试品溶液的制备：取上述18批次的前列欣胶囊内容物，置于容器中，向容器中加入甲醇20ml，并在300W/40kHz超声条件下超声处理30min，冷却，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；1612008、1612013、1702003、1702004、1702006、1702007、1702008、1703001、1703002、1801006、1801007、1801010、1801013、1801014、1802005、1803018、1804005、1804006称样量分别为：0.7456g、0.7168g、0.7511g、0.7469g、0.7357g、0.7266g、0.7533g、0.7501g、0.7492g、0.7397g、0.7459g、0.7681g、0.7398g、0.7359g、0.7576g、0.7487g、0.7463g、0.7398g。

(2)精密吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，依照提供的色谱条件进行梯度洗脱，记录色谱图；图谱见图21。

计算主要色谱峰(占总峰面积1％以上)的相对保留时间(见表13、表14、表15)、相对峰面积(见表16、表17、表18)：

表13 18批前列欣胶囊指纹图谱测定结果1(相对保留时间)

表14 18批前列欣胶囊指纹图谱测定结果2(相对保留时间)

表15 18批前列欣胶囊指纹图谱测定结果3(相对保留时间)

表16 18批前列欣胶囊指纹图谱测定结果1(相对峰面积)

表17 18批前列欣胶囊指纹图谱测定结果2(相对峰面积)

表18 18批前列欣胶囊指纹图谱测定结果3(相对峰面积)

上述供试品进行色谱检测，不同批次的前列欣胶囊指纹图谱见图1。

2、共有峰的确定及对照指纹图谱的获得

将18批前列欣胶囊指纹图谱的AIA格式从仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，见附图1。选择18批前列欣胶囊指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有峰。用平均值计算法生成前列欣胶囊的对照指纹图谱，见附图22，计算各共有峰的相似度，结果见表19，

表19 18批前列欣胶囊指纹图谱相似度结果

上述试验结果表明，以对照指纹图谱为参照计算相似度，18批前列欣胶囊指纹图谱相似度均在0.95以上，因此暂定前列欣胶囊指纹图谱标准为：供试品图谱应与对照指纹图谱一致，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种前列欣胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：取一定重量的前列欣胶囊内容物置于容器中，向容器中加入甲醇并进行超声处理，冷却，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(2)混合对照品溶液的制备：分别取没食子酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、迷迭香酸、丹酚酸A、水合氧化前胡素、花椒毒素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、珊瑚菜素和隐丹参酮，置于同一容器中，然后向该容器中加入甲醇并进行超声处理，冷却，摇匀，滤过，取滤液即得混合对照品溶液，其中对香豆酸设为参照化合物，后续相应的对香豆酸色谱峰设为参照峰；

(3)分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图；

(4)将步骤(3)获得的前列欣胶囊色谱文件从仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；用平均值计算法生成前列欣胶囊的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。

2.如权利要求1所述的前列欣胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于，在步骤(1)中，制备供试品溶液的具体过程为：取前列欣胶囊内容物0.5～1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇20ml，在300W/40kHz超声条件下超声处理30-40min。

3.如权利要求1所述的前列欣胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于，在步骤(3)中，分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，记录80min的色谱图。

4.如权利要求1所述的前列欣胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于，在步骤(3)中，前列欣胶囊指纹图谱测定的色谱条件为：以乙腈为流动相A，以体积百分比浓度0.1％甲酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱；流速为0.3ml/min；检测波长为300nm；柱温为25℃；理论板数按对香豆酸峰计算不低于8000；梯度洗脱的流程为：0～5min，5％流动相A，95％流动相B；5～20min，5→10％流动相A，95→90％流动相B；20～50min，10→30％流动相A，90→70％流动相B；50～65min，30→50％流动相A，70→50％流动相B；65～80min，50→72.5％流动相A，50→27.5％流动相B。

5.如权利要求1所述的前列欣胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于，在步骤(3)中，色谱柱规格为：AdvanceBio Peptide Mapping，2.7μm,2.1×250mm(PN:651750-902)。

6.根据权利要求1所述的前列欣胶囊指纹图谱的建立方法获得的前列欣胶囊指纹图谱，其特征在于，其特征峰为与没食子酸对应的2号峰，与新绿原酸对应的6号峰，与绿原酸对应的8号峰，与咖啡酸对应的10号峰，与隐绿原酸对应的11号峰，与对香豆酸对应的S号峰，与异绿原酸B对应的15号峰，与异绿原酸A对应的16号峰，与异绿原酸C对应的17号峰，与迷迭香酸对应的18号峰，与水合氧化前胡素对应的20号峰，与丹酚酸A对应的21号峰，与花椒毒素对应的24号峰，与佛手柑内酯对应的27号峰，与氧化前胡素对应的31号峰，与欧前胡素对应的33号峰，与珊瑚菜素对应的36号峰，与异欧前胡素对应的38号峰，与隐丹参酮对应的41号峰；特征峰以对香豆酸色谱峰为参照，上述19个色谱峰的相对保留时间分别为0.144、0.418、0.673、0.738、0.767、1.000、1.330、1.360、1.430、1.455、1.613、1.663、1.830、1.971、2.153、2.380、2.439、2.495、2.602。

7.根据权利要求6所述的前列欣胶囊指纹图谱，其特征在于，特征峰还包括以对香豆酸色谱峰为参照，相对保留时间为0.133的1号峰、相对保留时间为0.154的3号峰、相对保留时间为0.197的4号峰、相对保留时间为0.307的5号峰、相对保留时间为0.595的7号峰、相对保留时间为0.702的9号峰、相对保留时间为0.827的12号峰、相对保留时间为0.891的13号峰、相对保留时间为1.603的19号峰、相对保留时间为1.697的22号峰、相对保留时间为1.753的23号峰、相对保留时间为1.922的25号峰、相对保留时间为1.951的26号峰、相对保留时间为2.030的28号峰、相对保留时间为2.050的29号峰、相对保留时间为2.109的30号峰、相对保留时间为2.237的32号峰、相对保留时间为2.387的34号峰、相对保留时间为2.397的35号峰、相对保留时间为2.480的37号峰、相对保留时间为2.551的39号峰、相对保留时间为2.575的40号峰。