CN105477006B - 口炎清活性成分群分析及其指纹特征图谱的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了口炎清制剂的抗炎活性成分群及分析方法，构建了该成分群的指纹特征图谱，将该图谱应用于口炎清制剂质量检测中，并进一步公开了所述质量检测方法。具体为：以抗炎药效为检测指标；均匀设计不同组分比例的差异样品；通过UFLC‑Q‑TOF‑MS/MS技术获得差异样品的指纹特征数据；并获得制剂的抗炎活性数据。运用数理统计方法综合分析差异样品的化学成分与药效间的关联性，由此确定了29个抗炎药效活性成分，并构建成分群的指纹特征图谱。相对于现有技术，本发明是基于图谱与药效的关联性来分析活性成分群，因此更能直接、客观科学和全面地监控生产过程中原料药材、半成品、成品的质量，从而确保该产品的有效性和质量均一性。

Description

口炎清活性成分群分析及其指纹特征图谱的构建方法
技术领域
本发明涉及口炎清制剂的活性成分分析及其指纹图谱构建和质量检测方法。
背景技术
中药的生物活性评价与其安全性、有效性直接相关，中药的药效物质基础是中药中与生物活性密切相关的化学成分群，因此对中药的生物活性成分的研究，阐明其药效物质基础是促进中药发展和应用的必经之路。早在2004年，美国FDA 的《植物药研制指导原则》就明确指出，研究植物药应在已知成分的基础上提高和药物作用的研究，这体现了对中药的生物活性成分监控的重要性，表明对中药生物活性成分的研究已成为中药走向现代化的关键技术。将含有化学特征信息的中药指纹图谱与药效相关联，分析化学成分变化与药效变化的关联性，能够科学地揭示生物活性成分，阐明药效物质基础，是中药质量控制的一个重大进步，在加速中药现代化的进程中发挥着至关重要的作用。
口炎清颗粒是由广州白云山和记黄埔中药有限公司独家生产的治疗口腔炎症疾病的超亿元中成药。该产品由山银花、玄参、麦冬、天冬、甘草5味药材组成，可滋阴清热、解毒消肿，临床用于治疗阴虚火旺的口腔炎症疾病，对复发性口腔溃疡、口腔黏膜炎、口腔扁平苔藓、鹅口疮等多种口腔黏膜疾病均有良好疗效。口炎清颗粒收录在《国家基本药物目录》(2012年版)，是6个治疗咽喉、口腔病的国家基本用药之一。自1989年上市销售后，口炎清颗粒临床用药效果显著，安全性高，一直深受医生和患者欢迎，带来了很大的社会效益和经济效益。
口炎清颗粒HPLC指纹图谱技术于2012年获得国家发明专利授权，公开号为101518616 B。该指纹图谱共检出23个共有峰，确证了7个已知成分，同时监测了山银花、玄参、甘草3味药材，但麦冬和天冬的相关特征成分研究尚未完善。该指纹图谱方法不足之处在于：(1)指纹图谱所提供的化学信息及化学解释均较少，共检出23个共有峰，确证了7个已知成分，仅监测了山银花、玄参、甘草 3味药材，而未检测麦冬和天冬的相关特征成分。(2)指纹图谱中的各特征峰所对应化学成分的生物活性不明确，不能有效监控口炎清颗粒有效成分含量，无法确保产品的安全性及有效性。
综上所述，现有口炎清颗粒指纹图谱构建方法尚存在较多不足，在进一步完善其化学信息的基础上，需重点关注其中的核心活性成分群，并完善质量检测手段。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的不足，用超快速高效液相色谱仪与四级杆-飞行时间质谱仪串联检测技术对口炎清制剂抗炎药效的活性成分进行分析，进一步构建了指纹特征图谱和活性成分群，并提供了相关质量检测方法。
口炎清制剂抗炎药效的活性成分的分析方法，包括以下步骤：
(1)在口炎清制剂配方比例约束下，以五味原药材的质量百分含量为五个因素，均匀设计构建若干口炎清制剂差异样品；
(2)以补骨脂素为内标校正，用超快速高效液相色谱仪与四级杆-飞行时间质谱仪串联技术，获得所述差异样品及原配方口炎清制剂已确证化学成分的相对峰面积，构建指纹特征图谱；
(3)通过人口腔黏膜角化细胞体外炎症模型，以炎因子TNF-α、IL-8、IL-6、 IL-1β的含量为抗炎药效学检测指标，获得各差异样品的抗炎药效数据；
(4)利用数理统计方法综合分析步骤(2)所述化学成分与各差异样品抗炎药效差异的关联性，确定所述口炎清制剂抗炎药效活性成分群。
所述步骤(4)中具体方法为以步骤(2)所述的相对峰面积为自变量，以差异样品的抗炎药效为因变量，利用灰色关联分析或主成分分析或偏最小二乘法综合分析两变量间关联性，确定所述口炎清制剂抗炎药效活性成分群。
步骤(2)所述差异样品进样品的制备方法为：按照《中华人民共和国药典》 2010年版口炎清颗粒标准生产工艺制备各差异样品浸膏；取适量浸膏加入50％甲醇9mL，超声30min，补充50％甲醇定容至10mL，经0.22μm微孔滤膜过滤后，用50％甲醇稀释，使终浓度为0.15g/mL，得目标样品。
步骤(2)的检测条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温40℃；以0.1％甲酸乙腈溶液-0.1％甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，0–7 分钟，0.1％甲酸乙腈溶液由2％变至10％，7–95分钟，0.1％甲酸乙腈溶液由10％-41％， 95–105分钟，0.1％甲酸乙腈溶液由41％变至100％，105–115分钟，0.1％甲酸乙腈溶液为100％；流速为0.3mL/min；进样量为5μL。
步骤(2)的检测条件为：质谱工作参数：离子喷雾电压为5500V；离子源气体1为55psi；离子源气体2为55psi；温度为550℃；气帘气为35psi；碰撞气体压力为10psi；采用ESI电喷雾离子源，正离子模式进行检测。
构建口炎清制剂抗炎药效活性成分群指纹特征图谱的方法：如权利要求1 所述方法确定口炎清制剂抗炎药效活性成分群后，对应权利要求1步骤(2)所述的指纹特征图谱，构建目标图谱。
所确定口炎清制剂抗炎药效活性成分群包括赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、γ -氨基丁酸、脯氨酸、白屈菜酸、焦谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、哈巴苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、甘草苷、异槲皮苷、木犀草苷、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-二咖啡酰奎尼酸、4,5-二咖啡酰奎尼酸、安格洛苷C、异甘草苷、哈巴俄苷、肉桂酸、甘草次酸、甘草宁B、甲基麦冬二氢高异黄酮A、鲁斯可皂苷元及麦冬皂苷D，所述的目标图谱如图3所示。
口炎清制剂质量检测方法，则包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取精氨酸、绿原酸、木犀草苷、鲁斯可皂苷元对照品适量，加50％甲醇制成每1mL含绿原酸50μg，精氨酸、木犀草苷、鲁斯可皂苷元各1μg的对照品溶液；
(2)供试品溶液制备：分别称取待测口炎清制剂样品1.3g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇10mL，精密称定，超声30min，放置至室温，加50％甲醇补足重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤后即得；
(3)以补骨脂素为内标校正，以超快速高效液相色谱仪与四级杆-飞行时间质谱仪串联技术，对上述对照品及供试品进行检测并分别构建图谱；
(4)以权利要求7所述的目标图谱为对照特征图谱，供试品图谱中应呈现29 个与对照特征图谱相对应的色谱峰，其中2、12、17、28号峰的保留时间与精氨酸、绿原酸、木犀草苷、鲁斯可皂苷元对照品色谱峰的保留时间相对应；其余色谱峰的保留时间与对照特征图谱相应色谱峰的保留时间一致。
步骤(3)的检测条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温40℃；以0.1％甲酸乙腈溶液-0.1％甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，0–7 分钟，0.1％甲酸乙腈溶液由2％变至10％，7–95分钟，0.1％甲酸乙腈溶液由10％-41％， 95–105分钟，0.1％甲酸乙腈溶液由41％变至100％，105–115分钟，0.1％甲酸乙腈溶液为100％；流速为0.3mL/min；进样量为5μL；质谱工作参数：离子喷雾电压为5500V；离子源气体1为55psi；离子源气体2为55psi；温度为 550℃；气帘气为35psi；碰撞气体压力为10psi；采用ESI电喷雾离子源，正离子模式进行检测。
本发明所述的口炎清制剂是以药典口炎清颗粒处方为基础，凡以口炎清颗粒处方为基本组分，相似药效的任何类型制剂的半成品或产品均适合本发明的所述的分析方法及质量检测方法，均属于本发明所保护的范围之内。本技术的实施应用可为其他中药复方制剂的研究提供范例。
与现有技术相比。本发明具有如下优点：(1)采用超快速高效液相色谱仪与四级杆-飞行时间质谱仪串联(UFLC-Q-TOF-MS/MS)技术研究口炎清制剂的化学成分，确证了指纹图谱中25个化学成分，比原专利技术多确证了18个化学成分； (2)筛选稳定、灵敏的药效学检测指标对口炎清差异样品进行考察，更全面、客观科学和直接地反映药品的药效作用特点；(3)本发明中利用香烟烟雾提取物刺激口腔黏膜角化细胞建立体外炎症模型进行药效学实验，该模型灵活、快速、实验周期短，是抗炎药物药效筛选实验常用模型；(4)本发明中综合运用数理统计方法如灰色关联分析、主成分分析、偏最小二乘法等方法进行谱效分析，有效避免自变量间共线性，分析结果直观、真实、可靠；(5)通过谱效结合分析明确了口炎清制剂核心抗炎活性成分群，阐明了其药效物质基础，有效结合了指纹图谱化学信息与生物学信息，有利于提高其安全性、有效性及质量均一性。(6)用于口炎清制剂的质量检测更快捷和有效。
附图说明
图1是口炎清制剂原配方及差异样品1-11号的UFLC-Q-TOF-MS/MS图谱；
图2是口炎清制剂抗炎活性成分群的UFLC-Q-TOF-MS/MS指纹特征图谱，图中标★为内标补骨脂素；
图3是口炎清制剂抗炎药效活性成分的指纹特征图谱；
图4是图3中1号到6号特征峰的局部放大图；
图5是图3中7号到10号特征峰的局部放大图；
图6是图3中21号特征峰的局部放大图；
图7是图3中23到27号特征峰的部分放大图；
图8是图2的1号到26号特征峰的局部放大图；
图9是图2的27号到39号特征峰的局部放大图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步说明。
一、口炎清颗粒抗炎药效学检测指标的筛选。
1、实验材料
1.1实验药品与试剂
口炎清浸膏(广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：20140515)，牛黄解毒片(NP，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号：13121398)，地塞米松(Dex，中国药品生物制品检定所，批号:100129-201105)，香烟(椰树牌，广东中烟工业有限公司)，MTT(sigma，M2128-1G)，TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1βElisa 试剂盒(武汉优尔生公司)，RPMI-1640培养基(Hyclone)。
1.2实验仪器
净化工作台：苏州净化安泰技术有限公司HT-840型；光学显微镜：Motic AE21；CO2培养箱：FORMA Seris 303792-6714型；超低温冰箱：海尔BCD-568W；十万分之一电子天平：Sartorius BP211D；电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司130406887型；多孔超微量核酸蛋白分析仪：Botek；冷冻离心机： Eppendorf 5430R。
2、实验方法
2.1细胞培养
HOK细胞(人口腔黏膜角化细胞)，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。培养于RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL， pH 7.2)，在37℃、5％CO2培养箱中。
消化细胞，MTT测定时用完全培养基调整细胞密度为5×104个/mL，并铺96 孔板，每孔100μL；ELISA测定时用完全培养基调整细胞密度为4×105个/mL，并铺24孔板，每孔0.5mL。细胞培养24h后，待密度至80％可给药。
2.2香烟烟雾提取物的制备及各药物的配制
(1)香烟烟雾提取物制备
每支椰树牌香烟充分燃烧可产生烟碱1mg，焦油11mg，一氧化碳13mg 等多种物质。将2支燃烧的椰树牌香烟烟雾用装有10mL的RPMI-1640培养基 (无血清)的50mL注射器连续抽吸6次，每次50mL，共300mL；摇动使其充分溶解，经0.22μm微孔膜过滤后，得到100％浓度的CSE溶液，用RPMI-1640 培养基(无血清)稀释到需要的浓度后加入细胞，使CSE终浓度为1％、2％、3％、 4％、5％、10％、15％、20％，30min内用于实验。
(2)药物的配制：各药物用RPMI-1640培养基(无血清)配制，口炎清配成终浓度为2.2、22.2、222.2、555.6、2222.2μg/mL生药量的溶液；NP配成终浓度为10、100、1000μg/mL的溶液；Dex配成终浓度1、10、100、1000μM的溶液，经0.22μm微孔膜过滤后使用。
2.3考察不同浓度的药物及CSE的细胞毒性
细胞铺板如前所述，24h贴壁后除去培养基，加入200μL不同浓度的口炎清、CSE、NP和Dex溶液，空白对照组加入等量的RPMI-1640培养基(无血清)，置于含5％CO2、37℃培养箱中培养24h后，按MTT方法进行测试。
2.4细胞急性炎症实验
根据细胞毒性检测结果，在对细胞无毒性作用的安全浓度范围内设置CSE 和各药物的浓度。实验分成空白对照组、模型组(5％CSE)、阳性对照Dex组(1、 10μM)、阳性对照NP组(10μg/mL)和口炎清低(5.6μg/mL)、中(55.6μg/mL)、高(555.6μg/mL)剂量组。
细胞铺板如前所述，24h贴壁后换成RPMI-1640培养基(无血清)，继续培养一晚上；然后分别加入不同浓度的Dex、NP和口炎清溶液，空白对照组和模型组给予等量的无血清培养基，于5％CO2、37℃培养箱培养，预保护1h；接着各组(除空白对照组外)加入终浓度为5％的CSE，空白对照组给予等量的无血清培养基，继续孵育24h；最后取细胞上清液，并釆用ELISA法检测TNF-α、IL-8、 IL-6、IL-1β含量。
2.5数据分析方法
采用SPSS 19.0软件，运用单因素方差分析(ANOVA)和T检验方法进行分析，结果均以表示，P值小于0.05或0.01被认为有统计学差异。
3、实验结果
3.1考察不同浓度的药物及CSE的细胞毒性
研究结果(表1-1)显示：CSE在1-5％浓度范围内，对细胞的存活率没有显著影响(P>0.05)，在10-20％时有显著性差异(P<0.01)，表明CSE在10-20％时对细胞产生毒性；而口炎清在2222.2μg/mL浓度时(P<0.01)，NP在1000μg/mL 浓度时(P<0.01)，以及Dex在1000μM浓度时(P<0.01)，开始对细胞产生毒性。
表1-1细胞存活率
浓度(μM) Dex1 Dex10 Dex100 Dex1000
存活率 0.997±0.007 0.992±0.018 0.935±0.015 0.344±0.007**
注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
3.2细胞急性炎症的改善
TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β是参与炎症反应的重要介质，可促进炎性反应进程，在许多炎性反应性疾病、免疫性疾病等疾病的发生和发展中起着重要作用。许多资料表明，口腔炎症疾病，包括复发性口腔溃疡(ROU)、口腔黏膜炎(OM)、口腔扁平苔癣(OLP)等的发病过程中涉及多种细胞因子分泌紊乱，如促炎因子 TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β的产生增加等。
表1-2细胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β含量
注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
(1)促炎因子TNF-α的含量
TNF-α是重要的促炎因子，参与机体炎症反应与免疫应答。研究结果(表1-2) 显示：模型组TNF-α含量显著升高(P<0.05)，NP、Dex和口炎清给药后均能明显降低TNF-α含量(P<0.01)；口炎清低、中、高剂量有良好的改善作用，且呈一定剂量依赖关系。
(2)促炎因子IL-8的含量
IL-8是重要的细胞趋化因子，可以促进炎性反应进程。研究结果(表1-2) 显示：模型组IL-8含量显著升高(P<0.01)；给药处理后，NP、Dex和口炎清对其升高有改善作用(P<0.01，P<0.05)；口炎清给药有良好的改善作用，且呈一定剂量依赖关系。
(3)促炎因子IL-6的含量
IL-6是机体内重要的促炎因子，与急、慢性炎症均有关联。研究结果(表1-2) 显示，模型组IL-6含量显著升高(P<0.05)；Dex给药后有一定改善作用，浓度大于10μM时有显著差异(P<0.05)；口炎清给药后有一定改善作用且呈一定剂量依赖关系，其中口炎清中、高剂量可显著降低IL-6含量(P<0.05)。
(4)促炎因子IL-1β的含量
IL-1β是重要的炎症介质，参与机体炎症反应。研究结果(表1-2)表明：模型组IL-1β含量显著升高(P<0.01)；NP、Dex和口炎清给药后均能显著降低 IL-1β含量(P<0.01)；口炎清低、中、高剂量有良好的改善作用，且呈一定剂量依赖关系。
4、小结
采用香烟烟雾提取物(CSE)刺激口腔黏膜角化细胞，诱导细胞出现急性炎症，表现为促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β的含量增加，不同剂量的口炎清给药后，对TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β含量的增加可起到明显改善作用，且呈剂量依赖关系。
谱效关系研究中，筛选合适的药效指标是非常必要的。总体而言，所筛选的指标应具备高灵敏度，能够反映药物的药效特征，并突出化学成分群的变化。促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β等体外抗炎药效指标具有较好的灵敏度和稳定性，且呈现一定量效关系，因此在进行谱效关系研究中口炎清颗粒差异样品的药效学实验时，将采用促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β等药效指标。
二、口炎清颗粒差异样品指纹图谱的检测及其药效学研究。
1、实验材料
1.1实验药品与试剂
药效实验：口炎清差异样品浸膏11批(批号：20140815)及口炎清浸膏(批号：20140515)，均由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供；牛黄解毒片(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号：13121398)；地塞米松(中国药品生物制品检定所，批号:100129-201105)；香烟(椰树牌，广东中烟工业有限公司)； MTT(Sigma，M2128-1G)；TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1βElisa试剂盒(武汉优尔生公司)；RPMI-1640培养基(Hyclone)。
指纹图谱分析实验：补骨脂素(中国药品生物制品检定所，批号：110739-200512)；乙腈(质谱纯，Fisher Scientific)；甲酸(质谱纯，Fluka)；甲醇(质谱纯，FisherScientific)；水为超纯水。
1.2实验仪器
药效实验：净化工作台：苏州净化安泰技术有限公司HT-840型；光学显微镜：MoticAE21；CO2培养箱：FORMA Seris 303792-6714型；超低温冰箱：海尔BCD-568W；十万分之一电子天平：Sartorius BP211D；电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司130406887型；多孔超微量核酸蛋白分析仪：Botek；冷冻离心机：Eppendorf 5430R。
指纹图谱分析实验：超快速高效液相色谱仪(LC-20AD-XR二元泵，CTO-20A 柱温箱，SIL-20AD-XR自动进样器，SPD-M20A DAD检测器，日本岛津公司)；四级杆-飞行时间质谱仪(AB SCIEX，Triple TOF 5600plus)；色谱柱：Dionex Bonded Silica C18(3μm，150mm×4.6mm)；十万分之一电子天平：Sartorius BP211D；数控超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司KQ-250DE型；超纯水器：Millipore Simplicity；烘箱：Memmert UFB400；系列精密移液器：Eppendorf；
2、实验方法
2.1差异样品的构建及图谱分析
(1)差异样品的构建
根据口炎清颗粒的处方组成比例，山银花：玄参：麦冬：天冬：甘草为 26:21:21:21:11，进行配方约束下五因素十一水平的均匀设计,，每一水平表示相应药材占5味药材总量的百分比，其中山银花变化为16-36％，玄参0-42％，麦冬0-42％，天冬0-42％，甘草0-22％，见表2-1。
表2-1口炎清颗粒差异样品构建方案
差异样品 山银花％ 玄参％ 天冬％ 麦冬％ 甘草％
S1 36 0 16.8 25.2 22
S2 34 4.2 37.8 4.2 19.8
S3 32 8.4 8.4 33.6 17.6
S4 30 12.6 29.4 12.6 15.4
S5 28 16.8 0 42 13.2
S6 26 21 21 21 11
S7 24 25.2 42 0 8.8
S8 22 29.4 12.6 29.4 6.6
S9 20 33.6 33.6 8.4 4.4
S10 18 37.8 4.2 37.8 2.2
S11 16 42 25.2 16.8 0
(2)差异样品的制备
基于差异样品构建方案表，委托广州白云山和记黄埔中药有限公司按照现有的口炎清颗粒标准生产工艺制备差异样品，各组浸膏的每味药材重量见表2-2。
表2-2口炎清颗粒差异样品浸膏的5味药材重量
分别称取口炎清差异样品1-11号和口炎清浸膏适量，加入50％甲醇9mL超声30min，补充50％甲醇定容至10mL，经0.22μm微孔滤膜过滤后，用50％甲醇稀释，使终浓度为0.15g/mL(每个样品中加入了52.24μg/mL补骨脂素作为内标)，即得。
(3)差异样品UFLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱分析及聚类分析
检测条件：运用UFLC-DAD-Q-TOF-MS/MS(超快速高效液相色谱仪与四级杆- 飞行时间质谱仪串联)进行检测。色谱柱：Dionex Bonded Silica C18(3μm， 150mm×4.6mm)，柱温40℃；流动相：A为0.1％甲酸乙腈溶液，B为0.1％甲酸水溶液，按0–7min(2-10％A)，7–95min(10-41％A)，95–105min(41-100％A)， 105–115min(100％A)的梯度洗脱；进样量5μL；流速0.3mL/min。
质谱工作参数：离子喷雾电压为5500V；离子源气体1为55psi；离子源气体2为55psi；温度为550℃；气帘气为35psi；碰撞气体压力为10psi。采用ESI电喷雾离子源，正离子模式进行检测。
将制备得的差异样品1-11号和口炎清浸膏进行UFLC-Q-TOF-MS/MS分析，分析方法如上，通过SPSS 19.0对差异样品1-11号的指纹图谱中已鉴定或确证的 38个成分的相对峰面积(经内标校准)进行聚类分析。
2.2差异样品药效学实验
(1)细胞培养
HOK细胞(人口腔黏膜角化细胞)，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。培养于RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL， pH 7.2)，在37℃、5％CO2培养箱中。
消化细胞，MTT测定时用完全培养基调整细胞密度为5×104个/mL，并铺96 孔板，每孔100μL；ELISA测定时用完全培养基调整细胞密度为4×105个/mL，并铺24孔板，每孔0.5mL。细胞培养24h后，待密度至80％可给药。
(2)香烟烟雾提取物的制备及各药物的配制
香烟烟雾提取物制备：将2支燃烧的椰树牌香烟烟雾用装有10mL的 RPMI-1640培养基(无血清)的50mL注射器连续抽吸6次，每次50mL，共300mL；摇动使其充分溶解，经0.22μm微孔膜过滤，得到100％浓度的CSE溶液，用 RPMI-1640培养基(无血清)稀释到需要的浓度后加入细胞，使CSE终浓度为5％， 30min内用于实验。
药物的配制：各药物用RPMI-1640培养基(无血清)配制，口炎清1-11号差异样品终浓度为55.6μg/mL；地塞米松(Dex)终浓度为1μM；牛黄解毒片(NP) 终浓度为10μg/mL，经0.22μm微孔膜过滤后使用。
(3)考察口炎清差异样品的细胞毒性
细胞铺板如前所述，24h贴壁后除去培养基，加入200μL口炎清差异样品溶液，空白对照组加入等量的RPMI-1640培养基(无血清)，置于含5％CO2、 37℃培养箱中培养24h后，按MTT方法进行测试。
(4)差异样品药效学实验
实验分成15组：空白对照组，模型组(5％CSE)，阳性对照Dex组(1μM)，阳性对照NP组(10μg/mL)，和口炎清差异样品1-11组(55.6μg/mL)。
细胞铺板如前所述，24h贴壁后换成RPMI-1640培养基(无血清)，继续培养一晚上；然后分别加入Dex、NP、口炎清差异样品，空白对照组和模型组给予等量的无血清培养基，于5％CO2、37℃培养箱培养，预保护1h；接着各组(除空白对照组外)加入终浓度为5％的CSE，空白对照组给予等量的无血清培养基，继续孵育24h；最后取细胞上清液,并釆用ELISA法检测TNF-α、IL-8、IL-6、 IL-1β含量。
(5)数据分析方法
采用SPSS 19.0软件，运用单因素方差分析(ANOVA)和T检验方法进行分析，结果均以表示，P值小于0.05或0.01被认为有统计学差异。
3、实验结果
3.1差异样品UFLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱检测与其聚类分析
(1)UFLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱检测
利用UFLC-Q-TOF-MS/MS分析方法，检测口炎清浸膏(原配方)和1-11号差异样品得图谱如图1所示。对口炎清浸膏中的化学成分进行分析，根据所得到的质谱裂解信息、对照品的保留时间和质谱信息，并参考相关文献，鉴定和确证了 38个相对峰面积大于1.5％(相对峰面积＝所得峰面积/内标峰面积)且可归属到5 味药材的化学成分，见表2-3。实验选取差异样品中该38个化学成分进行下一步计算，并构建其指纹特征图谱如图2、图8及图9所示。
表2-3口炎清浸膏38个峰所代表的成分
注:*表示由对照品确证
(2)聚类分析
将11批差异样品38个化学成分的相对峰面积(表2-4)录入SPSS19.0中进行聚类分析：利用Between-groups linkage和Pearson correlation方法，当 Rescaled DistanceCluster Combine为5时，11批样品可分成八类：3、5为一类，2、4为一类，9、10为一类，其它各自一类。
表2-4口炎清差异样品的指纹特征(38个成分的相对峰面积)
3.2差异样品药效学研究
(1)考察口炎清差异样品的细胞毒性
研究结果(表2-5)：55.6μg/mL的口炎清1-11号差异样品对细胞的存活率均没有显著影响(P>0.05)，即对细胞均无毒性。
表2-5细胞存活率
注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
(2)细胞急性炎症的改善
促炎因子TNF-α的含量：实验结果(表2-6)：模型组TNF-α含量显著升高 (P<0.01)，给药处理后，NP、Dex、差异样品1、4、5、6和11，均对TNF-α升高有显著抑制作用(P<0.01，P<0.05)。
表2-6差异样品对促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β的改善
注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
促炎因子IL-8的含量：实验结果(表2-6)：模型组IL-8含量显著升高 (P<0.01)，给药处理后，NP、Dex、差异样品5和6，均对IL8升高有显著抑制作用(P<0.01，P<0.05)。
促炎因子IL-6的含量：实验结果(表2-6)：模型组IL-6含量显著升高 (P<0.01)，给药处理后，Dex、差异样品1、2、4、5、6、8、9、10和11，均对 IL6升高有显著抑制作用(P<0.01，P<0.05)。
促炎因子IL-1β的含量：实验结果(表2-6)：模型组IL-1β含量显著升高 (P<0.01)，给药处理后，NP、Dex、差异样品3、4、5、6、8、9、10和11，均对IL1-β升高有显著抑制作用(P<0.01)。
4、小结
口炎清颗粒差异样品间化学成分差异明显，且通过考察TNF-α、IL-8、IL-6 和IL-1β4个药效学指标获得的差异样品间生物活性差异明显。
三、口炎清颗粒基于谱效结合的抗炎活性成分群研究
1、方法
采用灰色关联分析、主成分分析、偏最小二乘法对口炎清颗粒的抗炎活性成分群进行研究。进行谱效结合分析之前，对负向药效指标参数进行正向化处理(取倒数)；根据需要再对正向化的药效指标和化学成分的相对峰面积进行无量纲化处理(均值化)。见表3-1、3-2、3-3。
表3-1口炎清差异样品药效结果正向化处理
表3-2口炎清差异样品药效结果正向化后的均值化处理
组别 TNF-α IL-8 IL-6 IL-1β
S1 1.29682 0.94969 1.05114 0.79813
S2 0.90869 1.03635 0.98752 0.83638
S3 0.94092 1.05404 0.86915 0.95393
S4 1.22231 0.80621 0.98752 1.02604
S5 0.99374 1.09966 0.94463 0.94654
S6 1.32920 1.16114 0.98752 1.19694
S7 0.77020 1.08902 0.89294 0.86602
S8 0.84372 0.80483 1.16358 1.15180
S9 0.84371 0.95441 0.97280 1.06171
S10 0.78735 1.06125 0.95851 1.05256
S11 1.06334 0.98338 1.18471 1.10994
表3-3口炎清差异样品指纹特征均值化处理
2、结果
2.2药效物质基础研究
(1)谱效结合分析
通过前面的研究，解析了复方中药口炎清颗粒的组方配伍规律，在此基础上，进一步分析口炎清颗粒中化学成分(指纹特征数据见表3-3)与药效之间的关联性，明确其药效物质基础。
IL-1β含量：
a灰色关联分析
从表3-4可知，各自变量所对应的化学成分与IL-1β药效指标间灰色关联度排序如下：P31>P8>P30>P22>P20>P9>P23>P21>P14>P13>P15>P27>P16>P19> P10>P11>P29>P36>P18>P6>P12>P3>P37>P2>P28>P1>P35>P4>P34>P38>P17>P32>P2 4>P7>P33>P26>P25>P5。
各成分的关联度均大于0.6，表明各成分均对药效有一定贡献。其中， P31>……>P9关联度大于0.8，对药效贡献最突出，主要是山银花、天冬/麦冬的成分及氨基酸。P23>……>P1关联度大于0.7，对药效贡献也比较大，主要是山银花、玄参、麦冬的成分及一些氨基酸；P35>……>P5关联度小于0.7，对药效贡献相对较小，主要天冬、麦冬、甘草的成分及一些氨基酸。
由于灰色关联分析是以绝对值进行分析，无法体现化学成分与药效间的正负相关关系，且自变量间有较严重的共线性，因此，为了全面且真实地反映各个化学成分的药效贡献，结合以下两种方法进行综合分析是非常有必要的。
表3-4各化学成分变量与IL-1β药效指标的灰关联分析结果
自变量 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10
关联度 0.703 0.710 0.716 0.690 0.625 0.718 0.661 0.830 0.805 0.771
自变量 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20
关联度 0.763 0.716 0.797 0.797 0.797 0.786 0.664 0.737 0.772 0.809
自变量 P21 P22 P23 P24 P25 P26 P27 P28 P29 P30
关联度 0.798 0.811 0.799 0.663 0.635 0.646 0.788 0.707 0.756 0.816
自变量 P31 P32 P33 P34 P35 P36 P37 P38 ---- ----
关联度 0.840 0.664 0.648 0.678 0.690 0.740 0.714 0.666 ---- ----
b主成分分析
研究多个自变量与因变量之间的关联程度时，因化学成分自变量间存在共线性现象，导致回归分析模型适用度差，且参数估计不稳定。为此，将具有一定相关性的化学成分自变量重新组合成几个相互独立的主成分，然后用主成分作为新的自变量，对药效因变量进行回归分析，将原自变量的参数值进行还原后，通过原自变量参数值的大小反映其对药效因变量的贡献程度。
采用SPSS19.0进行主成分提取，结果总方差解释部分表明保留5个主成分为宜，可反映原始变量的94.36％；计算出主成分特征向量矩阵(表3-4)并得到主成分表达式：
F1＝0.1345P1+0.1400P2+……-0.0940P38
F2＝0.2173P1+0.1129P2+……-0.1549P38
F3＝0.2265P1+0.2561P2+……+0.2303P38
F4＝0.1619P1+0.2501P2+……+0.2322P38
F5＝-0.0756P1+0.1121P2+……-0.2451P38
将计算得到的11个样本的5个主成分得分作为新自变量保存为Z1、Z2、Z3、 Z4、Z5(表3-5)，进而采用新自变量对IL-1β药效指标进行回归分析(逐步回归法)，得到下面回归方程：
Y＝0.066+0.003XZ4-0.001XZ1(P<0.05)
将主成分表达式代入上述方程后可得：Y＝0.066+3.51×10-4P1+6.10×10-4P2+……+7.91×10-4P38(自变量各系数见表3-6)。
各自变量的系数大小可一定程度上反映其对IL-1β药效指标的相对重要性。如表3-6所示，P2、P12、P23、P27、P28、P36、P37、P38的自变量系数为正且绝对值相对较大，对药效贡献突出，主要是麦冬、玄参的成分和氨基酸；P29、 P30、P31的系数为负且绝对值相对较大，提示这些成分可能并不是量越大药效越好，它们归属于山银花；另外，其他自变量系数绝对值相对较小，说明对药效的影响也相对较小，其中P1、P6、P9、P10、P11、P13、P14、P15、P16、P18、 P20、P21、P22的自变量系数为正，有一定药效贡献，主要是山银花的成分和一些氨基酸。
主成分分析结果与灰色关联分析结果基本一致，均表明玄参、麦冬、山银花和一些氨基酸对IL-1β药效指标有药效贡献。
表3-4主成分特征向量矩阵
注：提取的5个主成分用F1、F2、F3、F4、F5表示
表3-5差异样品主成分得分
样品 Z1 Z2 Z3 Z4 Z5
S1 6.9798 -2.2236 1.2987 0.3956 -1.8471
S2 4.4581 0.8662 0.2154 -1.5922 -0.8409
S3 1.8165 -2.3846 1.5091 -0.2744 1.0784
S4 2.6879 0.4334 0.1366 -1.3997 1.1556
S5 0.2215 -1.3656 2.2137 0.9699 0.7705
S6 1.7577 -1.4308 -5.0962 2.6983 0.0452
S7 1.6613 3.2017 -2.1640 -2.3625 0.6244
S8 -1.4396 1.9862 1.3399 2.0530 1.6269
S9 -6.9855 -1.0608 -0.9722 -2.0689 -0.5904
S10 -8.1185 -2.7137 0.2591 -0.1717 -0.4646
S11 -3.0392 4.6915 1.2600 1.7525 -1.5579
表3-6各化学成分变量与IL-1β药效指标的主成分分析结果
c偏最小二乘法
以UFLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱中各化学成分的相对峰面积为自变量， IL-1β药效指标的药效数据为因变量进行分析。根据偏最小二乘法，得到化学成分自变量关于药效因变量的回归系数(表3-7)，该系数反映自变量对其对药效因变量的贡献大小。以此回归系数建立方程：Y＝-0.0017P1+0.0436P2+……+ -0.0358P38。
如表3-7所示，P10、P12、P14、P19、P21、P23、P27、P28、P37的自变量系数为正且绝对值相对较大，对药效贡献突出，主要是山银花、麦冬、玄参的成分和氨基酸；P3、P5、P9、P26、P29、P30的系数为负且绝对值相对较大，提示这些成分可能并不是量越大药效越好，主要是山银花、天冬的成分和一些氨基酸；另外，其他自变量系数绝对值相对较小，说明对药效的影响也相对较小，其中 P2、P8、P11、P15、P17、P18、P22、P24、P25、P32、P33、P36的自变量系数为正，有一定药效贡献，主要是山银花、麦冬、天冬、甘草的成分和一些氨基酸。
偏最小二乘法的结果与主成分分析、灰色关联分析结果基本一致，均表明山银花、玄参、麦冬和一些氨基酸对IL-1β药效指标有药效贡献。
表3-7各化学成分变量与IL-1β药效指标的偏最小二乘法结果
d结果
结合三种数理统计方法的计算结果，可知P12、P23、P27、P28、P37对IL-1β药效指标具有显著的药效贡献，归属于玄参和麦冬；P2、P10、P11、P14、P15、P18、P21、P22、P36也有一定的药效贡献，主要是山银花、麦冬的成分和一些氨基酸；另外还显示山银花药材中P29、P30所对应的成分并不是量越大药效越好。
TNF-α含量：
a灰色关联分析
从表3-8可知，各自变量所对应的化学成分与TNF-α药效指标间灰色关联度排序如下：P8>P22>P21>P14>P31>P30>P20>P19>P15>P9>P13>P29>P18>P10> P16>P11>P3>P27>P34>P4>P6>P17>P2>P32>P7>P1>P23>P36>P38>P24>P33>P12>P35 >P37>P28>P25>P26>P5。
各成分的关联度均大于0.6，表明各成分均对药效有一定贡献。P8>……>P18 关联度大于0.8，对药效贡献最突出，主要是山银花、天冬/麦冬的成分及氨基酸，大部分归属于山银花。P10>……>P33关联度大于0.7，对药效贡献比较大，主要是山银花、玄参、甘草、麦冬的成分及一些氨基酸；P12>……>P5关联度小于0.7，对药效贡献相对较小，主要是玄参、天冬、麦冬的成分及氨基酸。
由于灰色关联分析是以绝对值进行分析，无法体现化学成分与药效间的正负相关关系，且自变量间有较严重的共线性，因此，为了全面且真实地反映各个化学成分的药效贡献，结合以下两种方法进行综合分析是非常有必要的。
表3-8各化学成分变量与TNF-α药效指标的灰关联分析结果
b主成分分析
由于TNF-α药效指标无法对主成分F1、F2、F3、F4、F5建立合适的多元回归方程，故以pearson相关性分析进行分析。由相关系数可知(表3-9)，P8、P13、 P14、P15、P19、P21的自变量系数为正且绝对值相对较大，对药效贡献突出，归属于山银花、天冬/麦冬，大部分归属于山银花；P26、P28的系数为负且绝对值相对较大，提示这些成分可能并不是量越大药效越好，归属于玄参和天冬；另外，其他自变量系数绝对值相对较小，说明对药效的影响也相对较小，其中 P4、P7、P10、P11、P16、P17、P18、P20、P22、P24、P32、P34的自变量系数为正，有一定药效贡献，主要是山银花、甘草的成分和一些氨基酸。
主成分分析结果与灰色关联分析结果基本一致，均表明山银花、甘草、天冬 /麦冬和一些氨基酸对TNF-α药效指标有药效贡献。
表3-9各化学成分变量与TNF-α药效指标的相关性分析结果
自变量 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10
相关系数 0.3027 0.3420 0.3004 0.5218 -0.1250 0.3767 0.5507 0.6540 0.3951 0.5720
自变量 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20
相关系数 0.4994 -0.2534 0.6800 0.6830 0.6490 0.4336 0.5261 0.5799 0.6620 0.5904
自变量 P21 P22 P23 P24 P25 P26 P27 P28 P29 P30
相关系数 0.7030 0.6200 -0.2633 0.6200 0.1090 -0.5130 -0.2536 -0.4335 0.1201 -0.1148
自变量 P31 P32 P33 P34 P35 P36 P37 P38 ---- ----
相关系数 -0.1294 0.5461 0.3398 0.5306 -0.0382 -0.0554 -0.2679 -0.0024 ---- ----
c偏最小二乘法
以UFLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱中各化学成分的相对峰面积为自变量， TNF-α药效指标药效数据为因变量进行分析。根据偏最小二乘法，得到化学成分自变量关于药效因变量的回归系数(表3-10)，该系数反映自变量对药效因变量的贡献大小。以此回归系数建立方程：Y＝0.0103P1+0.0151P2+……+0.0678P38。
如表3-10所示，P8、P13、P14、P15、P19、P21的自变量系数为正且绝对值相对较大，对药效贡献突出，主要是山银花、麦冬/天冬的成分；P26、P30、P31的系数为负且绝对值相对较大，提示这些成分可能并不是量越大药效越好，归属于山银花和天冬；另外，其他自变量系数绝对值相对较小，说明对药效的影响也相对较小，其中P4、P6、P7、P10、P11、P17、P18、P20、P22、P24、P32、 P34、P36、P38的自变量系数为正，有一定药效贡献，主要是山银花、甘草、麦冬的成分和一些氨基酸。
偏最小二乘法的结果与主成分分析、灰色关联分析结果基本一致，均表明山银花、甘草、天冬/麦冬和一些氨基酸对TNF-α药效指标有药效贡献。
表3-10各化学成分变量与TNF-α药效指标的偏最小二乘法分析结果
自变量 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10
系数 0.0103 0.0151 -0.0261 0.0297 -0.0916 0.0279 0.0418 0.1045 0.0100 0.0665
自变量 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20
系数 0.0300 -0.0392 0.0868 0.0890 0.0790 0.0026 0.0215 0.0377 0.0733 0.0539
自变量 P21 P22 P23 P24 P25 P26 P27 P28 P29 P30
系数 0.0843 0.0554 0.0212 0.0588 -0.0155 -0.1408 0.0032 0.0100 -0.0843 -0.1237
自变量 P31 P32 P33 P34 P35 P36 P37 P38 ---- ----
系数 -0.1110 0.0334 -0.0306 0.0301 -0.0112 0.0598 0.0032 0.0678 ---- ----
d结果
结合三种数理统计方法的计算结果，可知P8、P13、P14、P15、P19、P21 对TNF-α药效指标具有显著的药效贡献，归属于山银花和天冬/麦冬，其中大部分为山银花的成分；P4、P7、P10、P11、P17、P18、P20、P22、P24、P32、P34 也有一定的药效贡献，主要是山银花、甘草的成分和一些氨基酸；另外还显示天冬药材中P26所对应的成分并不是量越大药效越好。
IL-8含量：
a灰色关联分析
从表3-11可知，各自变量所对应的化学成分与IL-8药效指标间灰色关联度排序如下：P31>P30>P9>P8>P22>P20>P14>P15>P13>P21>P19>P29>P16>P18> P36>P27>P10>P11>P23>P4>P12>P3>P17>P38>P34>P32>P33>P2>P7>P6>P37>P1>P35 >P28>P24>P25>P26>P5。
各成分的关联度接近或大于0.6，表明各成分均对药效有一定贡献。其中，P31>……>P21关联度大于0.8，对药效贡献最突出，主要是山银花、天冬/麦冬的成分及氨基酸，大部分归属于山银花。P19>……>P12关联度大于0.7，对药效贡献也比较大，主要是山银花、玄参、麦冬的成分及一些氨基酸；P3>……>P5 关联度小于0.7，对药效贡献相对较小，主要是玄参、天冬、麦冬、甘草的成分及一些氨基酸。
由于灰色关联分析是以绝对值进行分析，无法体现化学成分与药效间的正负相关关系，且自变量间有较严重的共线性，因此，为了全面且真实地反映各个化学成分的药效贡献，结合以下两种方法进行综合分析是非常有必要的。
表3-11各化学成分变量与IL-8药效指标的灰关联分析结果
自变量 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10
关联度 0.649 0.669 0.692 0.713 0.596 0.663 0.664 0.835 0.845 0.733
自变量 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20
关联度 0.732 0.705 0.813 0.817 0.813 0.773 0.691 0.755 0.795 0.822
自变量 P21 P22 P23 P24 P25 P26 P27 P28 P29 P30
关联度 0.802 0.823 0.726 0.634 0.613 0.604 0.734 0.638 0.781 0.848
自变量 P31 P32 P33 P34 P35 P36 P37 P38 ---- ----
关联度 0.872 0.677 0.675 0.680 0.646 0.743 0.657 0.683 ---- ----
b主成分分析：由于IL-8药效指标无法对主成分F1、F2、F3、F4、F5建立合适的多元回归方程，故以pearson相关性分析进行分析。由相关系数可知(表 3-12)，各系数的绝对值均相对较小，提示各化学成分单独对IL-8药效指标的贡献均较小，它们之间可能存在复杂的协同起效作用。其中P9、P13、P14、P15、 P19、P18、P20、P22、P34的自变量系数为正且绝对值相对较大，对药效贡献比较突出，主要是山银花、甘草的成分和氨基酸，大部分为山银花的成分；P26、 P31、P37的系数为负且绝对值相对较大，提示这些成分可能并不是量越大药效越好，归属于天冬、山银花和麦冬。
主成分分析结果与灰色关联分析结果基本一致，均表明山银花和一些氨基酸对IL-8药效指标有药效贡献。
表3-12各化学成分变量与IL-8药效指标的相关性分析结果
c偏最小二乘法：以UFLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱中各化学成分的相对峰面积为自变量，IL-8药效指标药效数据为因变量进行分析。根据偏最小二乘法，得到化学成分自变量关于药效因变量的回归系数(表3-13)，该系数反映自变量对其对药效因变量的贡献大小。以此回归系数建立方程： Y＝-0.0022P1+0.0086P2+……+0.1858P38。
如表3-13所示，P5、P9、P13、P15、P16、P18、P20、P38的自变量系数为正且绝对值相对较大，对药效贡献突出，主要是山银花、麦冬成分和氨基酸；P8、 P26、P37的系数为负且绝对值相对较大，提示这些成分可能并不是量越大药效越好，归属于天冬和麦冬；另外，其他自变量系数绝对值相对较小，说明对药效的影响也相对较小，其中P2、P6、P12、P14、P19、P22、P30、P35的自变量系数为正，有一定药效贡献，主要是山银花、玄参、天冬的成分和一些氨基酸。
偏最小二乘法的结果与主成分分析、灰色关联分析结果基本一致，均表明山银花和一些氨基酸对IL-8药效指标有药效贡献。
表3-13各化学成分变量与IL-8药效指标的偏最小二乘法分析结果
自变量 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10
系数 -0.0022 0.0086 -0.1346 -0.1649 0.4855 0.0694 -0.1578 -0.4151 0.2430 -0.1803
自变量 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20
系数 -0.0719 0.0392 0.1612 0.0327 0.1582 0.1360 -0.0839 0.1058 0.0047 0.2196
自变量 P21 P22 P23 P24 P25 P26 P27 P28 P29 P30
系数 -0.1505 0.0374 -0.3079 -0.1856 -0.2212 -0.3558 -0.0126 -0.1024 -0.0436 0.0565
自变量 P31 P32 P33 P34 P35 P36 P37 P38 ---- ----
系数 -0.1767 -0.1605 -0.1423 -0.0353 0.0656 -0.0312 -0.6238 0.1858 ---- ----
d结果：结合三种数理统计方法的计算结果，可知P9、P13、P15、P18、P20 对IL-8药效指标具有比较显著的药效贡献，主要是山银花的成分和一些氨基酸，其中大部分为山银花的成分；P14、P19、P22也有一定的药效贡献，主要是山银花的成分；另外还显示P26、P37所对应的成分并不是量越大药效越好，归属于天冬和麦冬。
IL-6含量：
a灰色关联分析
从表3-14可知，各自变量所对应的化学成分与IL-6药效指标间灰色关联度排序如下：P31>P8>P30>P9>P20>P22>P13>P14>P15>P21>P10>P16>P11>P29> P19>P23>P27>P12>P18>P1>P3>P2>P6>P36>P28>P4>P37>P38>P34>P33>P7>P35>P32 >P17>P24>P26>P25>P5。
各成分的关联度均大于0.6，表明各成分均对药效有一定贡献。其中， P31>……>P21关联度大于0.8，对药效贡献最突出，主要是山银花、天冬/麦冬的成分及氨基酸，大部分归属于山银花。P10>……>P4关联度大于0.7，对药效贡献也比较大，主要是山银花、玄参、麦冬的成分及一些氨基酸；P37>……>P5 关联度小于0.7，对药效贡献相对较小，主要甘草、天冬、麦冬的成分及一些氨基酸。
由于灰色关联分析是以绝对值进行分析，无法体现化学成分与药效间的正负相关关系，且自变量间有较严重的共线性，因此，为了全面且真实地反映各个化学成分的药效贡献，结合以下两种方法进行综合分析是非常有必要的。
表3-14各化学成分变量与IL-6药效指标的灰关联分析结果
自变量 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10
关联度 0.734 0.733 0.733 0.701 0.626 0.729 0.667 0.860 0.830 0.785
自变量 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20
关联度 0.782 0.751 0.804 0.802 0.802 0.782 0.659 0.735 0.774 0.817
自变量 P21 P22 P23 P24 P25 P26 P27 P28 P29 P30
关联度 0.800 0.813 0.773 0.655 0.638 0.642 0.768 0.706 0.779 0.845
自变量 P31 P32 P33 P34 P35 P36 P37 P38 ---- ----
关联度 0.874 0.660 0.670 0.672 0.663 0.720 0.683 0.680 ---- ----
b主成分分析
采用主成分Z1、Z2、Z3、Z4、Z5作为新自变量对IL-6药效指标进行回归分析(逐步回归法)，得到下面回归方程：Y＝0.401+0.013XZ4+0.008XZ2(P<0.05)。将主成分表达式代入上述方程后可得：Y＝0.401+3.84×10-3P1+4.15×10-3P2+ ……+1.78×10-3P38(自变量各系数见表3-15)。各自变量的系数大小可一定程度上反映其对IL-6药效指标的相对重要性。如表3-15所示，P1、P2、P6、P10、 P12、P23、P27、P37的自变量系数为正且绝对值相对较大，对药效贡献突出，主要是麦冬、玄参的成分和一些氨基酸；山银花中P31的系数为负且绝对值相对较大，提示该成分可能并不是量越大药效越好；另外，其他自变量系数绝对值相对较小，说明对药效的影响也相对较小，其中P5、P8、P11、P13、P14、P15、 P16、P18、P20、P21、P28、P36、P38的自变量系数为正，有一定药效贡献，主要是山银花、麦冬、天冬、玄参的成分和一些氨基酸。
主成分分析结果与灰色关联分析结果基本一致，均表明山银花、玄参、麦冬、天冬和一些氨基酸对IL-6药效指标有药效贡献。
表3-15各化学成分变量与IL-6药效指标的主成分分析结果
c偏最小二乘法
以UFLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱中各化学成分的相对峰面积为自变量，IL-6 药效指标药效数据为因变量进行分析。根据偏最小二乘法，得到化学成分自变量关于药效因变量的回归系数(表3-16)，该系数反映自变量对其对药效因变量的贡献大小。以此回归系数建立方程：Y＝0.1340P1+0.0570P2+……+0.0023P38。
如表3-16所示，P1、P3、P6、P8、P9、P10、P23、P25、P26、P28、P37的自变量系数为正且绝对值相对较大，对药效贡献突出，主要是麦冬、天冬、玄参的成分和一些氨基酸；P29、P30、P31系数为负且绝对值相对较大，提示这些成分可能并不是量越大药效越好，归属于山银花；另外，其他自变量系数绝对值相对较小，对药效影响也较小，其中P2、P4、P7、P11、P12、P13、P16、P21、P24、 P35、P36、P38的自变量系数为正，有一定药效贡献，归属于五味药材。
偏最小二乘法的结果与主成分分析、灰色关联分析结果基本一致，均表明山银花、麦冬、天冬、玄参和一些氨基酸对IL-6药效指标有药效贡献。
表3-16各化学成分变量与IL-6药效指标的偏最小二乘法分析结果
自变量 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10
系数 0.1340 0.0570 0.1540 0.0591 -0.1166 0.0982 0.0930 0.2870 0.1125 0.1380
自变量 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20
系数 0.0977 0.0662 0.0052 -0.0091 -0.0329 0.0097 -0.0355 -0.0584 -0.0174 -0.0531
自变量 P21 P22 P23 P24 P25 P26 P27 P28 P29 P30
系数 0.0510 -0.0113 0.0985 0.0103 0.1509 0.1336 -0.0223 0.0989 -0.1358 -0.1841
自变量 P31 P32 P33 P34 P35 P36 P37 P38 ---- ----
系数 -0.1510 -0.0728 -0.1243 -0.0380 0.0161 0.0811 0.3778 0.0023 ---- ----
d结果
结合三种数理统计方法的计算结果，可知P1、P6、P10、P23、P37对IL-6 药效指标具有显著的药效贡献，主要是玄参、麦冬的成分和一些氨基酸；P2、P8、 P11、P12、P13、P16、P21、P28、P36、P38也有一定的药效贡献，主要是山银花、天冬、麦冬、玄参的成分和一些氨基酸；另外还显示山银花药材中P31所对应的成分并不是量越大药效越好。
综上所述，结合灰色关联分析、主成分分析、偏最小二乘法等方法进行综合分析，共找出了口炎清颗粒的29个抗炎活性成分，其中包括17个核心活性成分(表3-17)：分别为山银花的有机酸类(P13、P14、P15、P16、P20、P21、P22)和黄酮类(P18、P19)，玄参的环烯醚萜(P12、P27)、苯丙素甘(P23)和有机酸类(P28)，麦冬的高异黄酮(P36)和甾体皂苷类(P37、P38)，天冬/麦冬的有机酸类(P8)，甘草的黄酮类(P17、P24、P34)和皂苷类(P32)以及共有的一些氨基酸(P1、P2、P4、 P6、P7、P9、P10、P11)。其中，山银花的有机酸类成分对TNF-α、IL-8、IL-6 和IL-1β均有药效贡献，黄酮类成分主要对TNF-α、IL-1β和IL-8有药效贡献；玄参的环烯醚萜、苯丙素甘和有机酸类成分主要对IL-1β和IL-6有药效贡献；麦冬的高异黄酮和甾体皂苷类成分主要对IL-1β和IL-6有药效贡献；天冬/麦冬的有机酸类成分主要对TNF-α和IL-6有药效贡献；甘草的黄酮类和皂苷类成分主要对TNF-α有药效贡献；另外一些共有的氨基酸对不同的药效指标有药效贡献，如P10和P11对TNF-α、IL-1β和IL-6有药效贡献；P2对IL-1β和IL-6 有药效贡献；P1和P6对IL-6有药效贡献；P9对IL-8有药效贡献；P4和P7对 TNF-α有药效贡献，以上29个抗炎活性成分组成口炎清颗粒抗炎药效物质基础。在明确口炎清颗粒核心抗炎活性成分群的基础上，用于控制药品生产中的安全性、有效性和质量均一性，所述活性成分群的图谱图形如图3、图4、图5、图6及图7所示。
本发明中明确了口炎清颗粒的核心抗炎活性成分群，科学地阐明其药效物质基础，建立为其他中药复方制剂研究提供了研究思路与范例。
表3-17口炎清颗粒抗炎活性成分
注：*代表核心活性成分。
三、口炎清颗粒样品的质量检测方法。
抽取J3M009、J3M007、A4C001的三批口炎清颗粒样品进行检测，方法步骤如下：
(1)对照品溶液的制备：取精氨酸、绿原酸、木犀草苷、鲁斯可皂苷元对照品适量，加50％甲醇制成每1mL含绿原酸50μg，精氨酸、木犀草苷、鲁斯可皂苷元各1μg的对照品溶液；
(2)供试品溶液制备：分别称取待测口炎清制剂样品1.3g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇10mL，精密称定，超声30min，放置至室温，加50％甲醇补足重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤后即得；
(3)运用超快速高效液相色谱仪与四级杆-飞行时间质谱仪串联对上述对照品及供试品进行检测。检测条件：色谱柱：Dionex Bonded Silica C18(3μm， 150mm×4.6mm)，柱温40℃；流动相：A为0.1％甲酸乙腈溶液，B为0.1％甲酸水溶液，按0–7min(2-10％A)，7–95min(10-41％A)，95–105min(41-100％A)， 105–115min(100％A)的梯度洗脱；进样量5μL；流速0.3mL/min；质谱工作参数：离子喷雾电压为5500V；离子源气体1为55psi；离子源气体2为55psi；温度为550℃；气帘气为35psi；碰撞气体压力为10psi。采用ESI电喷雾离子源，正离子模式进行检测，样品检测结果构建图谱。
以图3所示的指纹特征图谱为对照特征图谱，在供试品色谱图中，精氨酸、绿原酸、木犀草苷、鲁斯可皂苷元色谱峰与各自对照品色谱峰的保留时间相对应，其余色谱峰的保留时间与对照特征图谱相应色谱峰的保留时间一致，为合格品。
四、口炎清制剂29个抗炎活性成分的结构式如下所示。

Claims (6)

1.口炎清制剂抗炎药效活性成分群的分析方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)在口炎清制剂配方比例约束下，以五味原药材的质量百分含量为五个因素，均匀设计构建若干口炎清制剂差异样品；
(2)以补骨脂素为内标校正，用超快速高效液相色谱仪与四级杆-飞行时间质谱仪串联技术，获得所述差异样品及原配方口炎清制剂已确证化学成分的相对峰面积，构建指纹特征图谱；所述串联技术的检测条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温40℃；以0.1％甲酸乙腈溶液-0.1％甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，0–7分钟，0.1％甲酸乙腈溶液由2％变至10％，7–95分钟，0.1％甲酸乙腈溶液由10％-41％，95–105分钟，0.1％甲酸乙腈溶液由41％变至100％，105–115分钟，0.1％甲酸乙腈溶液为100％；流速为0.3mL/min；进样量为5μL；质谱工作参数：离子喷雾电压为5500V；离子源气体1为55psi；离子源气体2为55psi；温度为550℃；气帘气为35psi；碰撞气体压力为10psi；采用ESI电喷雾离子源，正离子模式进行检测；
(3)通过人口腔黏膜角化细胞体外炎症模型，以促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β的含量为抗炎药效学检测指标，检测各差异样品上述促炎因子的含量；
(4)以步骤(2)所述的相对峰面积为自变量，以差异样品的抗炎药效为因变量，利用灰色关联分析或主成分分析或偏最小二乘法综合分析两变量间关联性，确定所述口炎清制剂抗炎药效活性成分群。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：步骤(2)所述差异样品进样品的制备方法为：按照《中华人民共和国药典》2010年版口炎清颗粒标准生产工艺制备各差异样品浸膏；取适量浸膏加入50％甲醇9mL，超声30min，补充50％甲醇定容至10mL，经0.22μm微孔滤膜过滤后，用50％甲醇稀释，使终浓度为0.15g/mL，得目标样品。
3.一种构建口炎清制剂抗炎药效活性成分群指纹特征图谱的方法，其特征在于：如权利要求1所述方法确定口炎清制剂抗炎药效活性成分群，对应权利要求1步骤(2)所述的指纹特征图谱，构建目标图谱。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所确定口炎清制剂抗炎药效活性成分群包括赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸、脯氨酸、白屈菜酸、焦谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、哈巴苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、甘草苷、异槲皮苷、木犀草苷、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-二咖啡酰奎尼酸、4,5-二咖啡酰奎尼酸、安格洛苷C、异甘草苷、哈巴俄苷、肉桂酸、甘草次酸、甘草宁B、甲基麦冬二氢高异黄酮A、鲁斯可皂苷元及麦冬皂苷D。
5.口炎清制剂质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取精氨酸、绿原酸、木犀草苷、鲁斯可皂苷元对照品适量，加50％甲醇制成每1mL含绿原酸50μg，精氨酸、木犀草苷、鲁斯可皂苷元各1μg的对照品溶液；
(2)供试品溶液制备：分别称取待测口炎清制剂样品1.3g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇10mL，精密称定，超声30min，放置至室温，加50％甲醇补足重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤后即得；
(3)以补骨脂素为内标校正，以超快速高效液相色谱仪与四级杆-飞行时间质谱仪串联技术，对上述对照品及供试品进行检测并分别构建图谱；
(4)以权利要求4所述的目标图谱为对照特征图谱，供试品图谱中应呈现29个与对照特征图谱相对应的色谱峰，其中2、12、17、28号峰的保留时间与精氨酸、绿原酸、木犀草苷、鲁斯可皂苷元对照品色谱峰的保留时间相对应；其余色谱峰的保留时间与对照特征图谱相应色谱峰的保留时间一致；
其中，步骤(3)的检测条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温40℃；以0.1％甲酸乙腈溶液-0.1％甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，0–7分钟，0.1％甲酸乙腈溶液由2％变至10％，7–95分钟，0.1％甲酸乙腈溶液由10％-41％，95–105分钟，0.1％甲酸乙腈溶液由41％变至100％，105–115分钟，0.1％甲酸乙腈溶液为100％；流速为0.3mL/min；进样量为5μL；质谱工作参数：离子喷雾电压为5500V；离子源气体1为55psi；离子源气体2为55psi；温度为550℃；气帘气为35psi；碰撞气体压力为10psi；采用ESI电喷雾离子源，正离子模式进行检测。
6.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述的口炎清制剂包括以口炎清颗粒处方为基本组分，相似药效的制剂的半成品或成品。
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