CN107907602A - 一种玄参指纹图谱的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种玄参指纹图谱的构建方法，用高效液相色谱仪测定，以参照物肉桂酸的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积，利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统制定指纹图谱。本发明在测定玄参饮片含量基础上，建立了玄参饮片的指纹图谱，并结合聚类分析、主成分分析方法对玄参的质量进行综合全面地评价，该方法具有直观而全面、合理而简易、精确而方便的特点，且兼具稳定性高、精密度好，重复性好等优点。

Description

一种玄参指纹图谱的构建方法

技术领域

本发明涉及中药玄参的质量检测和质量控制，具体涉及一种玄参指纹图谱的构建方法，属于药物分析领域。

技术背景

玄参，中药名，为玄参科草本植物，生于海拔1700米以下的竹林、溪旁、丛林及高草丛中，味甘、苦、咸，性微寒，有清热凉血，滋阴降火，解毒散结的功效。研究表明，玄参含有丰富的肉桂酸、哈巴俄苷和哈巴苷等成分。肉桂酸，又名β-苯丙烯酸、3-苯基-2-丙烯酸，可用于合成治疗冠心病的重要药物乳酸可心定和心痛平，及合成氯苯氨丁酸和肉桂苯哌嗪；还可合成氯苯氨丁酸和肉桂苯哌嗪，用作脊锥骨骼松弛剂和镇痉剂；此外还有抑制形成酪氨基酸酶的作用，对紫外线有一定的隔绝作用，能使褐斑变浅，甚至消失，具有显著的抗氧化功效对于减慢皱纹的出现有很好的疗效，是高级防晒霜中必不可少的成分之一。哈巴俄苷可促进阴虚小鼠脾淋巴细胞增殖，诱导脾淋巴细胞产生IL-2，能降低阴虚小鼠血浆中cAMP的含量，并能调整cAMP/cGMP比值至正常对照组水平，使抑制的免疫功能得以恢复。哈巴苷能抗菌，解热，增加心肌营养性血流量，提高耐缺氧能力。肉桂酸、哈巴俄苷、哈巴苷的结构式如下：

《中国药典》2015年版对玄参的质量控制包括原植物品种、药材性状、理化鉴别、含量测定等项目，文献也对玄参中化学成分进行阐述，包括含有哈巴苷和哈巴俄苷等环烯迷萜苷类和苯丙素苷类、芳香糖苷类等成分，但是仅测定某类成分的含量，难以客观、有效地评价或控制药材的质量。指纹图谱是近年来用于表征中药中多成分特征的一种分析方法，具有整体性和模糊性的特点，能较全面地反应药材所含化学成分的相对关系，体现了中药成分的复杂性和相关性，与中医药的传统理论相适应，能真正对中药内在质量进行有效表征、综合评价和全面控制。因此，建立一种能够全面地、快速地检测玄参指纹图谱的方法，对于其全面质量检测和整体质量控制具有重要意义。

发明内容

为此，本发明所要解决的是现有的中药材玄参的检测方法单一检测指标不能从整体上检测和控制其质量、多个检测指标联合检测费时、费力，难以广泛地应用于生产实践的技术问题，从而提出一种玄参指纹图谱的构建方法。

除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种玄参指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

(1)供试品的制备

取过三号筛玄参药材粉末0.5重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20体积份，密塞，称定重量，浸泡1小时，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液或内标物溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥10h的哈巴俄苷苷对照品、肉桂酸对照品及哈巴苷对照品适量，分别加30％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，分别精密吸取哈巴俄苷、哈巴苷及肉桂酸对照品储备液适量，加30％甲醇制成每1mL分别含哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷58.2、4.098、9.6μg的混合对照品溶液，即得；

(3)玄参指纹图谱的构建

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，进样，用高效液相色谱仪测定，以参照物肉桂酸的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积；其中高效液相色谱仪的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充剂；甲醇-水、甲醇-0.5％冰醋酸或甲醇-1％冰醋酸为流动相；线性梯度洗脱，流速0.8-1.2mL/min；柱温25-35℃；检测波长260-290nm；

利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，制定指纹图谱；所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。

优选的，本发明的流动相为甲醇-1％冰醋酸，线性梯度洗脱流速1.0mL/min，柱温30℃；检测波长290nm。

进一步优选的，上述方法中以1％冰酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0-20min，A：B为95％：5％→70％：30％；20-40min，A：B为70％：30％→55％：45％；40-50min，A：B为55％：45％→35％：65％；50-60min，A：B为35％：65％→0％：100％。

更进一步，本发明玄参药材粉末为炮制的玄参饮片磨粉而成，炮制工艺为：取玄参药材适量，量取相当于药材质量0.6倍的蒸馏水，浸润20h，切1-2mm的薄片，于50℃下干燥48h，既得。

具体的说，一种玄参指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

(1)玄参药材粉末的制备

取玄参药材适量，量取相当于药材质量0.6倍的蒸馏水，浸润20h，切1-2mm的薄片，于50℃下干燥48h，制得玄参饮片，然后磨粉，过三号筛得到玄参药材粉末；

(2)供试品的制备

取玄参药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20mL，密塞，称定重量，浸泡1小时，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(3)对照品溶液或内标物溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥10h的哈巴俄苷苷对照品、肉桂酸对照品及哈巴苷对照品适量，分别加30％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，分别精密吸取哈巴俄苷、哈巴苷及肉桂酸对照品储备液适量，加30％甲醇制成每1mL分别含哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷58.2、4.098、9.6μg的混合对照品溶液，即得；

(4)玄参指纹图谱的构建

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，进样，用高效液相色谱仪测定，以参照物肉桂酸的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积；其中高效液相色谱仪的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充剂；以1％冰酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0-20min，A：B为95％：5％→70％：30％；20-40min，A：B为70％：30％→55％：45％；40-50min，A：B为55％：45％→35％：65％；50-60min，A：B为35％：65％→0％：100％；流速1mL/min；柱温30℃；检测波长290nm；

利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统制定指纹图谱；所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。

本发明有益效果：

本发明以中药材玄参粉末为检测对象，构建了中药材玄参的指纹图谱，获得了较为全面的图谱信息，确认了共有峰的归属及相对保留时间，且结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面快速的检测其质量，有利于全面质量控制和整体质量控制，从而有助于提高玄参使用的安全性和有效性。本发明在测定玄参饮片含量基础上，建立了玄参饮片的指纹图谱，并结合聚类分析、主成分分析方法对玄参的质量进行综合全面地评价，该方法具有直观而全面、合理而简易、精确而方便的特点。运用本发明指纹图谱的构建方法用于中药玄参的质量检测和质量控制，结果发现市售的16批玄参饮片中只有11批饮含量符合2015年版《中国药典》规定，合格率仅达到68.75％，测定相似度在0.731～0.960之间，饮片中18个主要指纹图谱共有峰面积进行聚类分析和主成分分析，结果表明可以将11批不同相似度的饮片可有效地分为3类，a类：S4、S6、S7、S9相似度分别为0.957、0.881、0.939、0.886；b类：S1、S2、S3、S5、S8、S10相似度分别为0.924、0.911、0.882、0.859、0.960、0.801；c类：S11相似为0.731。本发明方法制成的指纹图谱，各峰面积积分值比值的RSD在3％之内间，相对保留时间差别在3％之内，具稳定性高、精密度好，重复性好等优点，适合玄参的全面质量控制和整体质量控制过程中大面积推广。

附图说明

图1是玄参饮片指纹图谱，其中峰1是哈巴苷，峰S是肉桂酸，峰7是哈巴俄苷。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所有原料及试剂均为市售产品。

仪器与试药

岛津20A系列高效液相色谱仪(二元泵，在线脱气，DAD检测器，自动进样器，柱温箱，日本岛津公司)；CPA225D型电子天平(十万分之一，德国Sartorius公司)；BS224S型电子天平(万分之一，德国Sartorius公司)；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司)。

哈巴苷对照品(南通飞宇生物科技有限公司，批号FY12871128，纯度>98％)，哈巴俄苷对照品(南通飞宇生物科技有限公司，批号FY12861116，纯度>98％)，肉桂酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110786.200503)，甲醇及冰醋酸为色谱纯，水为自制超纯水。

实施例1玄参药材粉末的制备

取玄参药材(重庆南川农业开发有限公司种植基地提供，经重庆市中药研究院鉴定为玄参科植物玄参ScrophμLaria ningpoensis Hemsl.的根)适量，量取相当于药材质量0.6％(v/m)的蒸馏水，浸润20h，切1-2mm的薄片，于50℃下干燥48h，制得玄参饮片，然后磨粉，过三号筛得到玄参药材粉末。

实施例2分析方法的建立

供试品的制备

取实施例1制备的玄参药材粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20mL，密塞，称定重量，浸泡1小时，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液或内标物溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥10h的哈巴俄苷苷对照品、肉桂酸对照品及哈巴苷对照品适量，分别加30％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，备用。分别精密吸取哈巴俄苷、哈巴苷及肉桂酸对照品储备液适量，加30％甲醇制成每1mL分别含哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷58.2、4.098、9.6μg的混合对照品溶液，即得。

色谱柱：Inertsustain C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：1％冰酸水溶液(A)-甲醇(B)；流速1mL/min；柱温30℃；检测波长290nm；洗脱程序见下表1。

表1玄参指纹图谱色谱洗脱条件

。参照实施例2的分析方法运行以下实施例。

实施例3指纹图谱的建立

按照中药注射剂指纹图谱研究的技术要求，将实施例1制备的玄参粉末的检测结果所给出的相关参数，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A(国家药典委员会)制定指纹图谱。色谱图见图1，共有18个共有峰，指定峰7个。根据供试品结果，共有18个主要共有指纹峰，肉桂酸为参照物，计算相对保留时间，结果见下表2。

表2饮片指纹图谱中共有指纹峰的标定

指纹图谱中，各共有峰所占比例见下表3。

表3各共有峰占总峰比例

共有峰面积占总峰面积68.24％，其中峰13、15的面积10％总峰面积而小于20％总峰面积，其余均小于10％总峰面积；峰17、18未达到基线分离；非共有峰面积均占总峰面积的31.76％。

实施例4色谱条件的考察

参照实施例2和实施例3，考察流动相、检测波长、色谱柱温、流速等色谱条件对构建玄参指纹图谱的影响。

流动相的考察

以InertSustain(4.6×250mm，5μm)为色谱柱，分别用甲醇-水，甲醇-0.5％冰醋酸，甲醇-1％冰醋酸为流动相，进行考察；实验结果表明，选用流动相为甲醇-1％冰醋酸梯度洗脱时，特征峰分离度和峰形较好，所以确定流动相为甲醇-1％冰醋酸梯度洗脱系统。

检测波长的考察

检测波长的考察：分别在260nm、270nm、280nm、290nm、300nm下检测；实验结果表明，在290nm波长下，特征峰整体很高，所以确定检测波长为290nm。

色谱柱温考察

分别在柱温为25℃、30℃、35℃考察；实验结果表明，温度为30℃时该色谱分离效果较好，且基线较平整，因而确定30℃为色谱柱温度。

流速考察

分别考察0.8mL/min，1mL/min，1.2mL/min的流速；实验结果表明，流速为1mL/min时，样品的基线较平分离较好，因而选择1mL/min为流动相流速。

实施例5供试品溶液的制备方法考察

参照实施例2和实施例3，考察提取溶剂、提取时间等供试品溶液制备方法对构建玄参指纹图谱的影响。

提取溶剂的考察

取实施例1制备的玄参粉末0.5g，9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入水，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％甲醇20mL，密塞，称定重量，浸泡1小时，超声处理60分钟，放冷，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果表明:几种溶剂提取药材的峰形，峰的个数以及相差不大，80％甲醇作为提取溶剂时总峰面积最大。

提取时间考察

取实施例1制备的玄参粉末0.5g，3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇20mL，密塞，称定重量，浸泡1小时，分别超声处理30min，40min，60min，放冷，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果表明：提取时间60min时总峰面积最大可以尽可能的得到药材信息。

实施例6

玄参饮片中主要含哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷等成分。其中哈巴苷峰面积较小，哈巴俄苷又易分解不稳定，故选择分离度较好峰面积又大的肉桂酸作为指纹图谱研究的参照物。

实施例7精密度试验

取实施例1制备的玄参粉末，参照实施例2的检测方法，连续进样6次，测定指纹图谱，结果指定的共有峰相对峰面积比值的RSD在3％之内间，相对保留时间的RSD在3％之内，具体结果见表4、表5。

表4相对峰面积

表5相对保留时间

精密度试验结果显示：仪器的精密度良好。

实施例8稳定性实验

取实施例1制备的玄参粉末，参照实施例2的检测方法，分别在2、4、6、8、10、12、24h检测指纹图谱，结果各峰面积积分值比值的RSD在3％之内间，相对保留时间差别在3％之内，具体结果见表6、表7。

表6相对保留时间

表7相对峰面积

稳定性试验结果表明：供试品在24h内稳定。

实施例9重复性实验

取实施例1制备的玄参粉末，参照实施例2的检测方法，平行操作制备6份，分别检测指纹图谱，结果各峰面积积分值比值的RSD在3％之内间，相对保留时间差别在3％之内，具体结果见表8、表9。

表8相对保留时间

表9相对峰面积

重现性实验结果表明：样品重现性较好。

实施例10样品含量的测定

精密吸取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，结果表明16批市售玄参饮片中只有11批合格，测定结果见表10，将11批合格饮片用于指纹图谱的建立。

采用HPLC法测定玄参中肉桂酸、哈巴俄苷和哈巴苷含量。供试品的制备和对照品溶液的制备同实施例2。色谱条件：色谱柱：Boston Symmetrie ODS-AQ色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：0.1％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱，乙腈(B)的梯度为(0～10min，3％；10～20min，3％→22％；20～60min，22％；60～70min，22％→3％)，流速0.8mL/min，柱温35℃，检测波长210nm。

线性方程

肉桂酸 y_肉桂酸＝6465700x_肉桂酸-4021.3；

哈巴俄苷 y_哈巴俄苷＝1978700x_哈巴俄苷-4662.6；

哈巴苷 y_哈巴苷＝393630x_哈巴苷-4165；

其中 y_肉桂酸表示肉桂酸利用高效液相色谱仪进行检测出的峰面积，x_肉桂酸表示肉桂酸的进样质量(μg)；y_哈巴俄苷表示哈巴俄苷利用高效液相色谱仪进行检测出的峰面积，x_哈巴俄苷表示哈巴俄苷的进样质量(μg)；y_哈巴苷表示哈巴苷利用高效液相色谱仪进行检测出的峰面积，x_哈巴苷表示哈巴苷的进样质量(μg)。

表10玄参饮片中哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷含量

实施例11指纹图谱及技术参数

指纹图谱

按照所建立的方法，对11批合格玄参饮片进行指纹图谱测定，生成的玄参饮片指纹图谱，玄参饮片指纹图谱相应数据见表11、表12。

表11玄参饮片与对照指纹图谱比较相似度结果

表12照指纹图谱主要共有峰技术参数

共有指纹峰相对保留时间

根据11批供试品图谱中各共有指纹峰相对保留时间，计算平RSD，列出各批供试品的检测数据，数据见表13。

表13玄参饮片指纹图谱共有峰相对保留时间

共有指纹峰面积的比值

根据11批供试品图谱中各共有指纹峰面积的比值，计算平均比值，列出各批供试品的检测数据，数据见表14。

表14共有指纹峰面积的比值

非共有峰面积

计算11批供试品图谱中非共有峰总面积及占总峰面积的百分比，列出各批供试品的检测数据表15。

表15非共有峰面积比例

综上实验研究结果表明，玄参饮片差异性比较大。

实施例12聚类分析及主成分分析

将11批不同批重庆市售饮片中的18个主要指纹图谱共有峰面积，采用欧式距离平方、组间平均连接法用SPSS软件进行聚类分析。由聚类分析结果知可饮片可聚类为3类：I(S1、S10、S2、S8、S3、S5)，II(S4、S6、S9、S7)，III(S11)。其中S1、S10、S2与S8聚为一类后又与S3、S5聚为一类，表明饮片S1、S10、S2、S8、S3、S5之间具有一定的统一性。其中，在I类中S1、S10、S2聚为一类，S3、S5聚为一类，S8单独聚为一类，表明同一类别中饮片又存在一定的差异性。同样，S4、S6与S9聚为一类后又与S7聚为一类形成II，它们之间既存在一定的统一性也存在着一定的差异性。S11被单独的分为一类(产地为浙江，其他饮片均来自川渝地区)，哈巴苷与哈巴俄苷总含量为0.549％高于S1、S2、S7、S8、S10，但与对照指纹图谱比较相似度为仅为0.731，表明通过指标成分控制药材质量具有局限性，不同产地的饮片之间存在着较大的地域性差异，聚类分析对玄参进行化学模式识别具有一定的科学道理。

再将11批不同重庆市售饮片中的18个主要指纹图谱共有峰面积用SPSS软件进行主成分分析，取特征值较为明显的两个组成分(方差贡献率为63.621％)进行分析，结果可知主成分分析可以将11批次饮片相对的集中于3部分，S4、S6、S7、S9集中于a部分，S1、S2、S3、S5、S8、S10集中于b部分，S11远离其它批次饮片集中于c部分，与聚类分析结果具有一致性。a、b、c之间相对偏离较大表明他们之间饮片差异较大，其中a部分内部存在的4个点相对较为离散，表明对应4个批次的饮片间存在着一定的差异性，b部分又可以相对的分为两部分S10与S1极为接近，对应的饮片具有显著地相似性，另一部分中S2、S3、S5、S8也具有一定的相似性，表明S10与S1之间，S2、S3与S5、S8饮片之间较为接近，但是每一点之间有相对离散也表明饮片之间存在一定的差异性。通过实验表明主成分分析在一定程度上反映了玄参饮片之间存在的统一性及差异性与聚类分析有较好的吻合性。

上述研究结果表明，市售的16批玄参饮片中只有11批饮含量符合《中国药典》2015年版规定，合格率仅达到68.75％。本发明建立了玄参饮片的指纹图谱，测定相似度在0.731～0.960之间，饮片中18个主要指纹图谱共有峰面积进行聚类分析和主成分分析，结果表明可以将11批不同相似度的饮片可有效地分为3类，a类：S4、S6、S7、S9相似度分别为0.957、0.881、0.939、0.886；b类：S1、S2、S3、S5、S8、S10相似度分别为0.924、0.911、0.882、0.859、0.960、0.801；c类：S11相似为0.731。由于每一类中饮片及每一类内包含的饮片由于药材来源或炮制工艺的不同又存在较大的差异性，表明目前药材市场上玄参药材参差不齐，存在一定的质量问题。

Claims (6)

1.一种玄参指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

（1）供试品的制备

取过三号筛玄参药材粉末0.5 重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20 体积份，密塞，称定重量，浸泡1小时，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

（2）对照品溶液或内标物溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥10 h的哈巴俄苷苷对照品、肉桂酸对照品及哈巴苷对照品适量，分别加30％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，分别精密吸取哈巴俄苷、哈巴苷及肉桂酸对照品储备液适量，加30％甲醇制成每1mL分别含哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷58.2、4.098、9.6 μg的混合对照品溶液，即得；

（3）玄参指纹图谱的构建

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，进样，用高效液相色谱仪测定，以参照物肉桂酸的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积；其中高效液相色谱仪的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充剂；甲醇-水、甲醇-0.5%冰醋酸或甲醇-1%冰醋酸为流动相；线性梯度洗脱，流速0.8-1.2 mL/min；柱温25-35 ℃；检测波长260-290 nm；

利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统制定指纹图谱；所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。

2.如权利要求1所述玄参指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述流动相为甲醇-1%冰醋酸，线性梯度洗脱流速1.0 mL/min，柱温30 ℃；检测波长290 nm。

3.如权利要求1所述玄参指纹图谱的构建方法，其特征在于：以1％冰酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；按照如下程序进行梯度洗脱：0-20 min，A：B为95%：5%→70%：30%；20-40 min，A：B为70%：30%→55%：45%；40-50 min，A：B为55%：45%→35%：65%；50-60 min，A：B为35%：65%→0%：100%。

4.如权利要求1所述玄参指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述玄参药材粉末为炮制的玄参饮片磨粉而成，炮制工艺为取玄参药材适量，量取相当于药材质量0.6倍的蒸馏水，浸润20 h，切1-2mm的薄片，于50℃下干燥48h，既得。

5.一种玄参指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

（1）玄参药材粉末的制备

取玄参药材适量，量取相当于药材质量0.6倍的蒸馏水，浸润20 h，切1-2mm的薄片，于50℃下干燥48h，制得玄参饮片，然后磨粉，过三号筛得到玄参药材粉末；

（2）供试品的制备

取玄参药材粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20 mL，密塞，称定重量，浸泡1小时，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

（3）对照品溶液或内标物溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥10 h的哈巴俄苷苷对照品、肉桂酸对照品及哈巴苷对照品适量，分别加30％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，分别精密吸取哈巴俄苷、哈巴苷及肉桂酸对照品储备液适量，加30％甲醇制成每1mL分别含哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷58.2、4.098、9.6 μg的混合对照品溶液，即得；

（4）玄参指纹图谱的构建

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，进样，用高效液相色谱仪测定，以参照物肉桂酸的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积；其中高效液相色谱仪的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充剂；以1％冰酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0-20 min，A：B为95%：5%→70%：30%；20-40 min，A：B为70%：30%→55%：45%；40-50 min，A：B为55%：45%→35%：65%；50-60 min，A：B为35%：65%→0%：100%；流速1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长290 nm；

利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统制定指纹图谱；所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法在玄参药材的质量检测和质量控制中的应用。