CN107807187A - 一种同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法 - Google Patents

一种同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法 Download PDF

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吴统选
杨荣平
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Abstract

本发明提供了一种同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法,在哈巴苷、肉桂酸及哈巴俄苷在0.1164~1.3968μg、0.008196~0.12294μg、0.0192~0.2880μg范围内使用哈巴苷、肉桂酸及哈巴俄苷各自的线性方程计算玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的含量,方法稳定性好,精密度高,重复性好。本发明操作简便,节约了大量的人力物力成本,且实用性强,适合大范围推广。

Description

一种同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法
技术领域
本发明涉及中药玄参有效成分的测定,具体涉及一种同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法。
技术背景
玄参,为玄参科草本植物,生于海拔1700米以下的竹林、溪旁、丛林及高草丛中,味甘、苦、咸,性微寒,有清热凉血,滋阴降火,解毒散结的功效。研究表明,玄参含有丰富的肉桂酸、哈巴俄苷和哈巴苷等成分。肉桂酸,又名β-苯丙烯酸、3-苯基-2-丙烯酸,可用于合成治疗冠心病的重要药物乳酸可心定和心痛平,及合成氯苯氨丁酸和肉桂苯哌嗪;还可合成氯苯氨丁酸和肉桂苯哌嗪,用作脊锥骨骼松弛剂和镇痉剂;此外还有抑制形成酪氨基酸酶的作用,对紫外线有一定的隔绝作用,能使褐斑变浅,甚至消失,具有显著的抗氧化功效对于减慢皱纹的出现有很好的疗效,是高级防晒霜中必不可少的成分之一。哈巴俄苷可促进阴虚小鼠脾淋巴细胞增殖,诱导脾淋巴细胞产生IL-2,能降低阴虚小鼠血浆中cAMP的含量,并能调整cAMP/cGMP比值至正常对照组水平,使抑制的免疫功能得以恢复。哈巴苷能抗菌,解热,增加心肌营养性血流量,提高耐缺氧能力。肉桂酸、哈巴俄苷、哈巴苷的结构式如下:
《中国药典》2015年版(一部)玄参药材项下含量测定的指标成分只有哈巴苷和哈巴俄苷,这对于玄参质量的控制使远远不够的。经查,目前未有肉桂酸、哈巴俄苷和哈巴苷同时测定的文献报道。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法,该方法灵明度高,准确性高。
除特殊说明外,本发明所述份数均为重量份,所述百分比均为质量百分比。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法,其特征在于,采用如下步骤:将玄参药材粉末过三号筛,精密称定0.5重量份,置具塞锥形瓶中,精密加入80%甲醇20体积份,密塞,称定重量,浸泡1小时,超声处理60分钟,放冷,再称定重量,用80%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,得到供试品溶液;精密称取经五氧化二磷干燥10h的哈巴俄苷苷对照品、肉桂酸对照品及哈巴苷对照品适量,分别加30%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液,分别精密吸取哈巴俄苷、哈巴苷及肉桂酸对照品储备液适量,加30%甲醇制成每1mL分别含哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷58.2、4.098、9.6μg的混合对照品溶液,得到对照品溶液;使用ODS-AQ色谱柱,以0.1%磷酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱,流速0.8-1.2mL/min,柱温25-35℃,检测波长210nm;然后根据肉桂酸与玄参药材粉末、哈巴俄苷与玄参药材粉末以及哈巴苷与玄参药材粉末各自的线性关系计算玄参粉末中的肉桂酸、哈巴俄苷、哈巴苷的含量。
优选的,上述同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法,其特征在于:使用ODS-AQ色谱柱,以0.1%磷酸水溶液为A流动相,乙腈为B流动相,进行梯度洗脱,流速0.8mL/min,柱温35℃,检测波长210nm。
进一步优选,上述同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法,其特征在于:以0.1%磷酸水溶液为A流动相,乙腈为B流动相,按照以下程序进行梯度洗脱:B流动相的梯度为0~10min,3%;10~20min,3%→22%;20~60min,22%;60~70min,22%→3%。
更进一步,上述同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法,其特征在于:环境温度为20-25℃,空气湿度75-78%。
本发明玄参药材粉末为炮制的玄参饮片磨粉而成,炮制工艺为:玄参药材除去残留根茎和杂质,加水喷润,防置19min,蒸置72min,冷至室温,切成1-2mm的薄片,于49℃鼓风干燥箱中干燥48h,既得。
具体的说,一种玄参的炮制方法,包括炮制和检测步骤,其特征在于,采用如下步骤:
(1)玄参的炮制:玄参药材出去残留根茎和杂质,加水喷润,防置19min,蒸置72min,冷至室温,切成1-2mm的薄片,于49℃鼓风干燥箱中干燥48h,得玄参饮片;
(2)将步骤(1)制得的玄参饮片磨成粉,过三号筛,精密称定0.5g,置具塞锥形瓶中,精密加入80%甲醇20mL,密塞,称定重量,浸泡1小时,超声处理60分钟,放冷,再称定重量,用80%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,得到供试品溶液;精密称取经五氧化二磷干燥10h的哈巴俄苷苷对照品、肉桂酸对照品及哈巴苷对照品适量,分别加30%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液,分别精密吸取哈巴俄苷、哈巴苷及肉桂酸对照品储备液适量,加30%甲醇制成每1mL分别含哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷58.2、4.098、9.6μg的混合对照品溶液,得到对照品溶液;使用ODS-AQ色谱柱,以0.1%磷酸水溶液为A流动相,乙腈为B流动相,按照以下程序进行梯度洗脱:B流动相的梯度为0~10min,3%;10~20min,3%→22%;20~60min,22%;60~70min,22%→3%,流速0.8mL/min,柱温35℃,检测波长210nm;按下式计算玄参粉末中的肉桂酸、哈巴俄苷、哈巴苷的含量:
肉桂酸 y肉桂酸=6465700x肉桂酸-4021.3;
哈巴俄苷 y哈巴俄苷=1978700x哈巴俄苷-4662.6;
哈巴苷 y哈巴苷=393630x哈巴苷-4165;
其中y肉桂酸表示肉桂酸利用高效液相色谱仪进行检测出的峰面积,x肉桂酸表示肉桂酸的进样质量(μg);y哈巴俄苷表示哈巴俄苷利用高效液相色谱仪进行检测出的峰面积,x哈巴俄苷表示哈巴俄苷的进样质量(μg);y哈巴苷表示哈巴苷利用高效液相色谱仪进行检测出的峰面积,x哈巴苷表示哈巴苷的进样质量(μg)。
本发明有益效果:
为了解决现有的中药材玄参的检测方法单一检测指标不能从整体上检测和控制其质量、多个检测指标联合检测费时、费力,难以广泛地应用于生产实践的技术问题,本发明提供了一种同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法,在哈巴苷、肉桂酸及哈巴俄苷在0.1164~1.3968μg、0.008196~0.12294μg、0.0192~0.2880μg范围内使用哈巴苷、肉桂酸及哈巴俄苷各自的线性方程计算玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的含量,方法稳定性好,精密度高,重复性好。本发明操作简便,节约了大量的人力物力成本,且实用性强,适合大范围推广。
附图说明
图1是对照品玄参色谱图,其中1是哈巴苷,2是肉桂酸,3是哈巴俄苷;
图2是供试品玄参色谱图,其中1是哈巴苷,2是肉桂酸,3是哈巴俄苷;
图3是哈巴苷的标准曲线方程;
图4是肉桂酸的标准曲线方程;
图5是哈巴俄苷的标准曲线方程。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述,在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所有原料及试剂均为市售产品。
Agilent 1200S系列高效液相色谱仪(二元泵,在线脱气,VWD检测器,自动进样器,柱温箱,美国安捷伦公司);岛津20A系列高效液相色谱仪(二元泵,在线脱气,DAD检测器,自动进样器,柱温箱,日本岛津公司);CPA225D型电子天平(十万分之一,德国Sartorius公司);BS224S型电子天平(万分之一,德国Sartorius公司);DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司)。
哈巴苷对照品(南通飞宇生物科技有限公司,批号:FY12871128,纯度大于98%),哈巴俄苷对照品(南通飞宇生物科技有限公司,批号:FY12861116,纯度大于98%),肉桂酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号110786-200503),乙腈(Honeywell公司,色谱纯),甲醇(Honeywell公司,色谱纯),超纯水(自制),其余试剂均为分析纯。
玄参由重庆南川农业开发有限公司种植基地提供,经重庆市中药研究院李隆云研究员鉴定为玄参科植物玄参ScrophμLaria ningpoensis Hemsl.的根。
实施例1玄参药材粉末的制备
取玄参药材适量,量取相当于药材质量0.6%(v/m)的蒸馏水,浸润20h,切1-2mm的薄片,于50℃下干燥48h,制得玄参饮片,然后磨粉,过三号筛得到玄参药材粉末。
实施例2分析方法的建立
采用HPLC法测定玄参中肉桂酸、哈巴俄苷和哈巴苷含量。
供试品的制备
取实施例1制备的玄参药材粉末约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入80%甲醇20mL,密塞,称定重量,浸泡1小时,超声处理60分钟,放冷,再称定重量,用80%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
对照品溶液或内标物溶液的制备
精密称取经五氧化二磷干燥10h的哈巴俄苷苷对照品、肉桂酸对照品及哈巴苷对照品适量,分别加30%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液,备用。分别精密吸取哈巴俄苷、哈巴苷及肉桂酸对照品储备液适量,加30%甲醇制成每1mL分别含哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷58.2、4.098、9.6μg的混合对照品溶液,即得。
色谱条件:色谱柱:Boston Symmetrie ODS-AQ色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相:0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱,乙腈(B)的梯度为(0~10min,3%;10~20min,3%→22%;20~60min,22%;60~70min,22%→3%),流速0.8mL/min,柱温35℃,检测波长210nm。
实施例3线性关系的考察
参照实施例2的分析方法,精密吸取不同体积的混合对照品溶液,加30%甲醇配制成系列质量浓度对照品溶液,分别进样10μL,记录峰面积,以对照品量(μg)为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程(见表1)。
表1标准曲线
结果表明,哈巴苷、肉桂酸及哈巴俄苷在0.1164~1.3968μg、0.008196~0.12294μg、0.0192~0.2880μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。
实施例4色谱条件的考察
参照实施例2的分析方法,考察流动相、色谱柱温、流速等色谱条件对同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的影响。
流动相的考察
以Boston Symmetrie ODS-AQ色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)为色谱柱,分别用水-乙腈,0.1%磷酸水溶液-乙腈为流动相,进行考察;实验结果表明,选用流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈梯度洗脱,乙腈(B)的梯度为0~10min,3%;10~20min,3%→22%;20~60min,22%;60~70min,22%→3%时,特征峰分离度和峰形较好,所以确定流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈梯度洗脱系统。色谱柱温考察
分别在柱温为25℃、30℃、35℃考察;实验结果表明,温度为35℃时该色谱分离效果较好,且基线较平整,因而确定35℃为色谱柱温度。
流速考察
分别考察0.8mL/min,1mL/min,1.2mL/min的流速;实验结果表明,流速为0.8mL/min时,样品的基线较平分离较好,因而选择0.8mL/min为流动相流速。
实施例5供试品溶液的制备方法考察
参照实施例2,考察提取溶剂、提取时间等供试品溶液制备方法对同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的影响。
提取溶剂的考察
取实施例1制备的玄参粉末4.5g,分为9份,精密称定,置具塞锥形瓶中,分别加入水,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%甲醇20mL,密塞,称定重量,浸泡1小时,超声处理60分钟,放冷,补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。结果表明:几种溶剂提取药材的峰形,峰的个数以及相差不大,80%甲醇作为提取溶剂时总峰面积最大。
提取时间考察
取实施例1制备的玄参粉末1.5g,分为3份,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入80%甲醇20mL,密塞,称定重量,浸泡1小时,分别超声处理30min,40min,60min,放冷,补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。结果表明:提取时间60min时总峰面积最大。
实施例6稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液10μL,按照实施例2的色谱条件于不同时间注入液相色谱仪,记录峰面积,计算含量,结果见表2。
表2稳定性考察结果
哈巴苷,肉桂酸,哈巴俄苷含量RSD分别为1.051%,0.9535%,1.7707%,表明供试品溶液在36h内稳定。
实施例7精密度实验
按照实施例2的色谱条件,精密吸取同一混合对照品溶液10μL,连续进样6次,记录峰面积,结果见表3。
表3精密度考察结果
哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷的RSD分别为0.6346%,0.2898%,1.3106%,表明仪器精密度良好。
实施例8重复性试验
取实施例1制备的玄参药材粉末(过三号筛)约0.5g,共分为6份,精密称定,制备供试品溶液,精密吸取10μL,注入液相色谱仪,按照实施例2的色谱条件进行检测,计算哈巴苷,肉桂酸,哈巴俄苷的含量,结果见表4。
表4重复性考察结果
三种成分含量RSD分别为1.3078%,1.4805%,1.3747%,表明供试品制备方法具有较好的重复性。
实施例9加样回收试验
取同一批已知含量的玄参药材粉末0.5g,共6份,分别加入已知含量的对照品溶液,制备供试品溶液,按实施例2的色谱条件进行检测,结果见表5。
表5加样回收率考察结果
哈巴苷、肉桂酸及哈巴俄苷的平均回收率分别为100.345%(RSD=1.404%),101.04%(RSD=1.271%),99.61%(RSD=2.263%),结果表明,本方法准确可靠。

Claims (6)

1.一种同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法,其特征在于,采用如下步骤:将玄参药材粉末过三号筛,精密称定0.5 重量份,置具塞锥形瓶中,精密加入80%甲醇20 体积份,密塞,称定重量,浸泡1小时,超声处理60分钟,放冷,再称定重量,用80%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,得到供试品溶液;精密称取经五氧化二磷干燥10 h的哈巴俄苷苷对照品、肉桂酸对照品及哈巴苷对照品适量,分别加30%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液,分别精密吸取哈巴俄苷、哈巴苷及肉桂酸对照品储备液适量,加30%甲醇制成每1mL分别含哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷58.2、4.098、9.6 μg的混合对照品溶液,得到对照品溶液;使用ODS-AQ色谱柱,以0.1%磷酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱,流速0.8-1.2 mL/min,柱温25-35℃,检测波长210 nm;然后根据肉桂酸与玄参药材粉末、哈巴俄苷与玄参药材粉末以及哈巴苷与玄参药材粉末各自的线性关系计算玄参粉末中的肉桂酸、哈巴俄苷、哈巴苷的含量。
2.如权利要求1所述的同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法,其特征在于:使用ODS-AQ色谱柱,以0.1%磷酸水溶液为A流动相,乙腈为B流动相,进行梯度洗脱,流速0.8mL/min,柱温35℃,检测波长210 nm。
3.如权利要求1所述的同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法,其特征在于:以0.1%磷酸水溶液为A流动相,乙腈为B流动相,按照以下程序进行梯度洗脱: B流动相的梯度为0~10 min,3%; 10~20 min,3% →22%;20~60 min,22%;60~ 70 min,22%→3%。
4.如权利要求1所述的同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法,其特征在于:检测的环境温度为20-25℃,空气湿度75-78%。
5.如权利要求1-4任一项所述同时测定玄参中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸的方法,其特征在于:玄参药材粉末为炮制的玄参饮片磨粉而成,炮制工艺为玄参药材除去残留根茎和杂质,加水喷润,防置19min,蒸置72min,冷至室温,切成1-2mm的薄片,于49℃鼓风干燥箱中干燥48h,既得。
6.一种玄参的炮制方法,包括炮制和检测步骤,其特征在于,采用如下步骤:
(1) 玄参的炮制:玄参药材出去残留根茎和杂质,加水喷润,防置19min,蒸置72min,冷至室温,切成1-2mm的薄片,于49℃鼓风干燥箱中干燥48h,得玄参饮片;
(2)将步骤(1)制得的玄参饮片磨成粉,过三号筛,精密称定0.5 g,置具塞锥形瓶中,精密加入80%甲醇20 mL,密塞,称定重量,浸泡1小时,超声处理60分钟,放冷,再称定重量,用80%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,得到供试品溶液;精密称取经五氧化二磷干燥10 h的哈巴俄苷苷对照品、肉桂酸对照品及哈巴苷对照品适量,分别加30%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液,分别精密吸取哈巴俄苷、哈巴苷及肉桂酸对照品储备液适量,加30%甲醇制成每1mL分别含哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷58.2、4.098、9.6 μg的混合对照品溶液,得到对照品溶液;使用ODS-AQ色谱柱,以0.1%磷酸水溶液为A流动相,乙腈为B流动相,按照以下程序进行梯度洗脱: B流动相的梯度为0~10 min,3%; 10~20min,3% →22%;20~60 min,22%;60~ 70 min,22%→3%,流速0.8 mL/min,柱温35℃,检测波长210 nm;按下式计算玄参粉末中的肉桂酸、哈巴俄苷、哈巴苷的含量:
肉桂酸 y肉桂酸=6465700x肉桂酸-4021.3;
哈巴俄苷 y哈巴俄苷=1978700x哈巴俄苷-4662.6;
哈巴苷 y哈巴苷=393630x哈巴苷-4165;
其中y肉桂酸表示肉桂酸利用高效液相色谱仪进行检测出的峰面积,x肉桂酸表示肉桂酸的进样质量; y哈巴俄苷表示哈巴俄苷利用高效液相色谱仪进行检测出的峰面积,x哈巴俄苷表示哈巴俄苷的进样质量;y哈巴苷表示哈巴苷利用高效液相色谱仪进行检测出的峰面积,x哈巴苷表示哈巴苷的进样质量。
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