CN112710759A - 脉络宁颗粒的质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析化学技术领域，提供了脉络宁颗粒的质量检测方法，包括高效液相色谱法测定脉络宁颗粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量：以流动相对哈巴苷和哈巴俄苷进行梯度洗脱，且哈巴苷的测定波长为200~207 nm，哈巴俄苷的测定波长为280 nm。本发明以玄参中主要功效成分为质量指标物质，很好地反映了脉络宁颗粒中有效成分的含量，即很好地反应了成品质量。方法的准确性和精度高，稳定，通过多次试验，重复性好，结果精确可靠。

Description

脉络宁颗粒的质量检测方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及脉络宁颗粒的质量检测方法。
本发明中，百分比均指质量百分数，25%~100%甲醇指甲醇水溶液中甲醇的质量浓度。
背景技术
脉络宁颗粒由牛膝、玄参、石斛、金银花、山银花五味药组成。方中牛膝活血化瘀通络，凉血消肿止痛，为君药；玄参清热养阴，解毒散结，为臣药；金银花清热解毒、凉血消肿，石斛养阴清热，合为佐药。具清热养阴、活血祛瘀的功效；用于Ⅰ、Ⅱ期动脉硬化性闭塞症及血栓闭塞性脉管炎引起的肢体皮肤发凉、酸胀、麻木、烧灼感、间歇性跛行、静息痛等；急性及亚急性期下肢深静脉血栓形成引起的局部肿胀、疼痛、皮肤温度升高、皮色异常等及恢复期轻中度脑梗塞引起的半身不遂、口舌歪斜、偏身麻木、语言不利等。现有脉络宁颗粒质量检测方法对牛膝、齐墩果酸、金银花、绿原酸、滨蒿内酯、玄参进行了定性鉴别，含量测定采用肉桂酸的含量进行测定。该方法存在以下缺点：
（1）牛膝的鉴别采用以牛膝对照药材及齐墩果酸对照品为对照的薄层色谱鉴别，但供试品的显色效果较弱，无明显斑点。原因是在供试品溶液的制备中，其对供试品中齐墩果酸的提取效率低，因此造成检视效果不理想。
（2）玄参的鉴别采用以玄参对照药材为对照的薄层色谱鉴别，此方法存在以下问题：1. 对照药材和供试品的提取方式不一致，会造成提取出的成分有差异；2.检测结果重现性差，重复实验中图谱所显示的斑点强弱不一，点的个数不一，检视效果不理想。3. 采用紫外灯（254nm）下检视，色谱中斑点显示不够清晰。因而现有技术对玄参的检测结果重现性差，检视效果不理想。
（3）石斛为金钗石斛Dendrobium nobile Lindl.、鼓槌石斛Dendrobiumchrysotoxum Lindl．或流苏石斛Dendrobium fimbriatum Hook．var．的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎。为药典中基源收载最为复杂的中药之一，不同基源化学成分差异较大，而其中联苄类和菲类是石斛中存在种类最多的化合物，如毛兰素和石斛酚等。现有技术以滨蒿内酯对照品为对照的薄层色谱鉴别，该成分不具专属性。滨蒿内酯主要来源于菊科植物滨蒿或茵陈蒿的干燥地上部分。研究表明，滨蒿内酯在不同石斛中分布差异巨大，37个石斛属物种中，只有球花石斛、密花石斛和短棒石斛中含有滨蒿内酯（刘研妍等, 中国中药杂志, 2013, 38(21): 3691-3695）。因此，石斛中滨蒿内酯成分不具专属性，现有技术的准确性低。
（4）现有技术采用肉桂酸进行含量测定，未能很好反映其质量。一方面，肉桂酸可以工业合成（http://www.ichemistry.cn/chemistry/621-82-9.htm），可以通过人工添加的方式引入脉络宁颗粒中，即存在肉桂酸不能代表含有玄参，因此，不能以其作为质量指标物质。另一方面，脉络宁颗粒中玄参主要含环烯醚萜苷类、苯丙素苷类，尚含甾醇及其苷类、有机酸类黄酮类以及萜类等，是起药效的主要成分；其中，环烯醚萜苷类中的哈巴苷和哈巴俄苷为主要功效成分。2015年《中华人民共和国药典》第一部第117页公开了药材玄参含量测定的指标性成分有哈巴苷(C15H24O10)、哈巴俄苷(C24H30O11)。因此，玄参中的肉桂酸不是其主要功效成分，不能以其作为质量指标物质。
综上，现有的质量检测方法精度不高，产品质量控制专属性的可控性存在缺陷，难以准确测定脉络宁颗粒的主要成份。
发明内容
本发明旨在至少克服上述现有技术的缺点与不足其中之一，提供一种快速、准确、有效、稳定的脉络宁颗粒的质量检测方法。本发明目的基于以下技术方案实现：
本发明提供了一种脉络宁颗粒的质量检测方法，包括高效液相色谱法测定脉络宁颗粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量：以流动相对哈巴苷和哈巴俄苷进行梯度洗脱，且哈巴苷的测定波长为200~207 nm，哈巴俄苷的测定波长为280 nm。
优选地，所述高效液相色谱法按以下规定进行梯度洗脱：0~13分钟，3% A→10%A；13~25分钟，10% A→30% A；25~30分钟，30% A→50% A；30~38分钟，50% A→80% A；38~40分钟，80% A。
优选地，所述测定波长的规定如下：0~20分钟，200~207 nm为测定波长；20~40分钟，280 nm为测定波长。
优选地，所述流动相以乙腈为流动相A，酸溶液为流动相B；所述酸溶液为磷酸溶液、甲酸溶液或乙酸溶液，浓度为0.01%~0.08%。
优选地，所述高效液相色谱法中，包括：
对照品溶液的制备：精密称取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品，加25%~100%甲醇制成含哈巴苷、哈巴俄苷的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备：精密称取脉络宁颗粒，加入25%~100%甲醇，超声或加热回流处理20~90分钟，滤过，取续滤液，即得；
测定法：精密吸取等量的对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。
优选地，所述供试品溶液的制备中，脉络宁颗粒与25%~100%甲醇的用量比为1g：5~25mL。
优选地，每10g脉络宁颗粒中，以哈巴苷和哈巴俄苷的总量计，不少于3.2 mg。
优选地，本发明的脉络宁颗粒的质量检测方法，还包括牛膝的薄层鉴别：
薄层层析：以牛膝对照药材及齐墩果酸对照品为对照，照薄层色谱法，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂，喷以硫酸乙醇溶液使显色，在日光下检视；
其中，供试品溶液的制备：加盐酸乙醇溶液加热回流，滤过，滤液蒸至近干，加水使溶解，三氯甲烷提取，提取液蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得；
对照药材溶液的制备：取牛膝对照药材，同法制成对照药材溶液；
对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品，加甲醇制成溶液，即得。
优选地，本发明的脉络宁颗粒的质量检测方法，还包括玄参的薄层鉴别：
薄层层析：以哈巴俄苷对照品为对照，照薄层色谱法，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-冰醋酸-水为展开剂，香草醛硫酸溶液喷雾显色；
其中，供试品溶液的制备：加甲醇超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加水使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取，所得正丁醇液用氨试液洗涤，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得；
对照品溶液的制备：取哈巴俄苷对照品，加甲醇制成溶液，即得。
优选地，本发明的脉络宁颗粒的质量检测方法，还包括石斛的高效液相色谱鉴别：
以石斛酚对照品为对照，照高效液相色谱法，以乙腈-0.05%磷酸（30:70）为流动相，以206 nm为测定波长进行测定；
其中，供试品溶液的制备：加甲醇处理，滤过，滤液蒸干，残渣加水加热使溶解，三氯甲烷提取，提取液蒸干，加甲醇使溶解，滤过，取续滤液，即得；
对照品溶液的制备：取石斛酚对照品适量，加甲醇制成溶液，即得。
优选地，牛膝的薄层鉴别具体包括：
供试品溶液的制备：取脉络宁颗粒，加盐酸乙醇溶液，加热回流1~1.5小时，滤过，滤液蒸至近干，加水使溶解，用三氯甲烷提取2~4次，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得；对照药材溶液的制备：取牛膝对照药材，同法制成对照药材溶液；对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品，加甲醇制成溶液，即得；
薄层层析：照薄层色谱法，吸取供试品溶液、对照药材及对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20:6:1）为展开剂，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视；
优选地，玄参的薄层鉴别具体包括：
供试品溶液的制备：取脉络宁颗粒，研细，加甲醇，超声处理15~45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水使溶解，用水饱和正丁醇提取1~3次，合并正丁醇液，用氨试液洗涤1~3次，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得；对照品溶液的制备：取哈巴俄苷对照品，加甲醇制成溶液，即得；
薄层层析：照薄层色谱法，吸取供试品溶液、对照品溶液，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-冰醋酸-水（15:0.5:1:1:2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰，在日光下检视；
优选地，石斛的高效液相色谱鉴别具体包括：
供试品溶液的制备：取脉络宁颗粒，加甲醇，处理15~45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水加热使溶解，用三氯甲烷振摇提取3~5次，合并提取液，蒸干，加甲醇使溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液；对照品溶液的制备：取石斛酚对照品适量，加甲醇制成溶液，即得；
高效液相色谱鉴别：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05%磷酸（30:70）为流动相；检测波长为206 nm。
本发明可至少取得如下有益效果其中之一：
1、本发明对脉络宁颗粒的含量测定，采用高效液相色谱法测定哈巴苷和哈巴俄苷的含量，以玄参中主要功效成分为质量指标物质，很好地反映了脉络宁颗粒中有效成分的含量，即很好地反应了成品质量。方法的准确性和精度高，稳定，通过多次试验，重复性好，结果精确可靠。
2、本发明还改进了牛膝、玄参和石斛的定性鉴别方法，检测结果更准确，操作环境对各检测结果均无影响，通过多次试验，重复性好，结果精确可靠。本发明改善了脉络宁颗粒中牛膝、玄参的提取和层析方法，提高了牛膝、玄参的提取率和提取效率，薄层色谱能够很好地分离和显色，检视效果好，结果准确，阴性对照无干扰。石斛的鉴别中采用石斛酚对照品为对照，与滨蒿内酯相比石斛酚具有专属性，结果更准确；并且脉络宁颗粒中石斛酚的含量低，薄层色谱法不能很好的显色，因此本发明采用高效液相色谱法进行鉴别，具有用量少、灵敏度高、精度高的优点。
3、本发明的质量检测方法，选择最能表征药材有效成分的指标进行检测以控制成品质量，方法快速、准确、有效、稳定，可操作性强，保证了制剂更加安全、有效，适于推广应用。
附图说明
图1为牛膝的薄层鉴别色谱图：（a）现有技术方法：1、3供试品，2为牛膝对照药材，4为齐墩果酸对照品；（b）本发明方法：1.牛膝对照药材，2.齐墩果酸对照品，3.阴性对照，4、5、6供试品，批号1904005、1904006、1904007；
图2为玄参的薄层鉴别色谱图：（a）现有技术方法：1、2、3供试品批号1904005、1904006、1904007，4玄参对照药材；（b）现有技术方法重复实验：1、2、3供试品批号1904005、1904006、1904007，4玄参对照药材；（c）本发明方法：1阴性对照，2、3、4供试品批号1904005、1904006、1904007，5哈巴俄苷对照品，6玄参对照药材；（d）本发明方法重复实验：1阴性对照，2、3、4供试品批号1904005、1904006、1904007，5哈巴俄苷对照品；
图3为石斛鉴别的HPLC色谱图一（Sunfire C18柱）：（a）石斛酚对照品；（b）缺石斛阴性样品；
图4为石斛鉴别的HPLC色谱图二（Sunfire C18柱）：（a）脉络宁颗粒供试品（批号1904005）；（b）脉络宁颗粒供试品（批号1904006）；（c）脉络宁颗粒供试品（批号1904007）；
图5为石斛鉴别的HPLC色谱图三：（a）石斛酚对照品；（b）脉络宁颗粒供试品（批号1904005）；（c）石斛酚对照品；（d）脉络宁颗粒供试品（批号1904005）；其中，（a）、（b）的色谱柱为CAPCELL PAK C18柱，（c）、（d）的色谱柱为依利特C18柱；
图6为哈巴苷和哈巴俄苷的紫外光谱图：（a）哈巴苷；（b）哈巴俄苷；
图7为玄参鉴别的HPLC色谱图（AlltimaTM C18柱）：（a）哈巴苷和哈巴俄苷混合对照品；（b）哈巴苷对照品；（c）哈巴俄苷对照品；（d）脉络宁颗粒供试品（批号1904006）；（e）缺玄参阴性对照样品；
图8为哈巴苷标准曲线图；
图9为哈巴俄苷标准曲线图；
图10为玄参鉴别的HPLC色谱图（TechMate C18-ST柱）：（a）哈巴苷和哈巴俄苷混合对照品；（b）哈巴苷对照品；（c）哈巴俄苷对照品；（d）脉络宁颗粒供试品（批号1904006）；
图11为玄参鉴别的HPLC色谱图（依利特C18柱）：（a）哈巴苷和哈巴俄苷混合对照品；（b）哈巴苷对照品；（c）哈巴俄苷对照品；（d）脉络宁颗粒供试品（批号1904006）。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例中的附图，对本发明的实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的原料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
脉络宁颗粒的制备：
取牛膝 950g，玄参950g，石斛 950g，金银花608g，山银花（灰毡毛忍冬）342g。以上五味，加水6倍量浸渍2小时，煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.17（80℃），加入乙醇使含醇量达66%，静置24小时，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.35～1.37（80℃），加入乙醇使含醇量达80%，静置12小时，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.35～1.37（80℃），加入糊精适量、甜菊苷8g，混匀，制颗粒，干燥，制成1000g，即得。
将不同实验批次所得脉络宁颗粒用于以下实施例进行质量检测。
实施例1 定性鉴别
1.牛膝薄层鉴别
1.1试剂与试药
脉络宁颗粒: 来源：江西银涛药业有限公司 批号:1904005、1904006、1904007
牛膝对照药材: 来源：中国食品药品检定研究院 批号：121066-201508
齐墩果酸对照品：来源：中国食品药品检定研究院 批号：110709-201808。
阴性对照样品：取缺牛膝的原辅料，按处方量及工艺自制阴性。
薄层板：自制硅胶G及普通预制硅胶G薄层板。
其它试剂均为分析纯。
1.2 薄层色谱鉴别试验
供试品溶液的制备：取本品2g，研细，加盐酸乙醇溶液（1→10）40mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸至近干，加水30mL使溶解，用三氯甲烷振摇提取3次，每次30mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备：取牛膝对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。
对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：取阴性对照样品，同供试品溶液制备方法制成缺牛膝阴性对照溶液。
薄层层析（实验环境：T=25.0℃，RH=50%）：照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液10μL、对照药材及对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上（自制的硅胶G薄层板），以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20:6:1）为展开剂，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。
结果发现，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照中相应位置无斑点。通过多次试验，即三个批号的供试品，均在相应位置显相同颜色的斑点。结果表明，本发明的检测方法重复性好，阴性对照无干扰，结果见图1（b）。
1.3耐用性考察
1.3.1不同薄层板的比较
取牛膝对照药材及齐墩果酸对照品溶液，三批样品溶液（按正文拟订的方法制备），分别点于自制的硅胶G薄层板、普通预制硅胶G薄层板（上海东方药品科技实业有限公司）和普通预制硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂）上，结果三种不同品牌的薄层板均能达到良好的分离效果，结果基本一致。（实验环境：T：25.5℃，RH：45%）
1.3.2不同温度的比较
取牛膝对照药材及齐墩果酸对照品溶液，三批样品溶液（按正文拟订的方法制备），点于自制的硅胶G薄层板上， 分别考察常温常湿 （T=25.0℃，RH=50%）、低温常湿（T=8.0℃，RH =46%）及高温常湿（T=35.0℃，RH=52%）三种条件下的分离情况，结果表明在以上温度条件下均能达到良好的分离效果，温度对分离影响不大，结果基本一致。
1.3.3不同相对湿度的比较
取牛膝对照药材及齐墩果酸对照品溶液，三批样品溶液（按正文拟订的方法制备），点于自制的硅胶G薄层板上，分别考察常温常湿（T=25.0℃，RH=50%）、常温高湿（T=24.5℃，RH=72%）和常温低湿（T=25.5℃，RH=32%）三种条件下的分离情况，结果表明在以上相对湿度条件下均能达到良好的分离效果，湿度对分离影响不大，结果基本一致。
2.玄参薄层鉴别
2.1试剂与试药
脉络宁颗粒：来源：江西银涛药业有限公司 批号:1904005、1904006、1904007。
玄参对照药材：来源：中国食品药品检定研究院 批号：121008-201609。
哈巴俄苷对照品：来源：中国食品药品检定研究院 批号：111730-201307。
阴性对照样品: 取缺玄参的原辅料，按处方量及工艺自制阴性。
薄层板：自制硅胶G及普通预制硅胶G薄层板。
其它试剂均为分析纯。
2.2 试验记录
供试品溶液的制备：取本品5g，研细，加甲醇50mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水25mL使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次30mL，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备: 取玄参对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。
对照品溶液的制备: 取哈巴俄苷对照品，加甲醇制成每lmL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备:取缺玄参的原辅料，同供试品溶液制备方法制成缺玄参阴性对照溶液。
薄层层析（实验环境：T=25.0℃，RH=50%）：照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液10μL、对照品溶液4μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-冰醋酸-水（15:0.5:1:1:2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰，在日光下检视。
结果如图2（c）所示。结果发现，三个批号的供试品色谱中，在与哈巴俄苷对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点。而阴性对照1与玄参对照药材6存在部分相同斑点（图2（c）中方框所示位置），即在对脉络宁颗粒中玄参的鉴别中，玄参对照药材的薄层色谱不具专属性，无准确性。故未将玄参对照药材增加到本发明的检测方法中。
通过多次试验发现，本发明的检测方法结果准确，重复性好，结果见图2中（c）和（d）。本发明采用玄参的专属性活性成分哈巴俄苷作为对照，该成分的专属性强；对照药材和供试品的提取方式相同，提取出的成分一致、无偏差；检测结果准确，图谱所显示的斑点强弱一致，点的个数一致，检视效果良好，重现性好；显色采用日光下检视，斑点清晰。
2.3耐用性考察
2.3.1不同薄层板的比较
取哈巴俄苷对照品溶液，三批样品溶液，分别点于自制的硅胶G薄层板、普通预制硅胶G薄层板（上海东方药品科技实业有限公司）和普通预制硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂）上，结果三种不同品牌的薄层板均能达到良好的分离效果，结果基本一致。（实验环境：T：25.5℃，RH：45%）
2.3.2不同温度的比较
取哈巴俄苷对照品溶液，三批样品溶液，点于自制的硅胶G薄层板上， 分别考察常温常湿 （A：T=25.0℃，RH=50%）、低温常湿（B：T=8.0℃，RH =46%）及高温常湿（B：T=35.0℃，RH=52%）三种条件下的分离情况，结果表明在以上温度条件下均能达到良好的分离效果，温度对分离影响不大，结果基本一致。
2.3.3不同相对湿度的比较
取哈巴俄苷对照品溶液，三批样品溶液（按正文拟订的方法制备），点于自制的硅胶G薄层板上，分别考察常温常湿（T=25.0℃，RH=50%）、常温高湿（T=24.5℃，RH=72%）和常温低湿（T=25.5℃，RH=32%）三种条件下的分离情况，结果表明在以上相对湿度条件下均能达到良好的分离效果，湿度对分离影响不大，结果基本一致。
3.石斛高效液相色鉴别
3.1试剂与试药
仪器Agilent1260高效液相色谱仪，安捷伦液相工作站，DAD测器。
脉络宁颗粒: 来源：江西银涛药业有限公司 批号:1904005、1904006、1904007。
石斛酚对照品：来源：中国食品药品检定研究院 批号：111875-201001
阴性对照样品: 取缺石斛的原辅料，按处方量及工艺自制阴性。
试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，水为Milli-Q制备的纯化水，其他均为分析纯。
3.2 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱:Sunfire C18柱（4.6×250mm，5μm）
流动相:乙腈-0.05%磷酸（30:70）
检测波长: 206nm
流速: 1.000mL/min ，柱温: 30℃，
理论板数按石斛酚峰计算应不低于5000。
取石斛酚对照品适量，加甲醇制成适当的浓度，以甲醇为空白，在400～200nm波长范围内进行光谱扫描，确定最大吸收峰；并参照脉络宁注射液的石斛鉴别，故确定206nm为测定波长。
3.3 液相色谱试验
供试品溶液的制备：取本品4g，研细，加甲醇40mL，处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水30mL加热使溶解，用三氯甲烷振摇提取4次，每次20mL，合并提取液，蒸干，加甲醇1mL使溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备: 取石斛酚对照品适量，加甲醇制成每lmL含20μg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备:取阴性样品，同供试品溶液制备方法制成缺石斛阴性对照溶液。
分别吸取上述三种溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。供试品色谱中呈现与对照品色谱峰保留时间相一致的色谱峰。
如图3所示，石斛酚对照品HPLC色谱图（保留时间：34.849分钟；理论板数：16776）；缺石斛阴性样品HPLC色谱图中，无特征峰。
如图4所示，脉络宁颗粒供试品（批号：1904005）HPLC色谱图（保留时间：34.962分钟；理论板数：18002）；脉络宁颗粒供试品（批号：1904006）HPLC色谱图（保留时间：34.885分钟；理论板数：17923）；脉络宁颗粒供试品（批号：1904007）HPLC色谱图（保留时间：34.917分钟；理论板数：17569）。
实验结果表明，在脉络宁颗粒的有效成分中，石斛酚具有专属性。
3.4 耐用性试验
分别采用三种不同的色谱柱进行液相色谱测定，见图5。色谱柱：
(1) Sunfire C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；见前述实验（图4）。
(2) CAPCELL PAK C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；
如图5（a）所示，石斛酚对照品HPLC色谱图中，保留时间：34.781 分钟；理论板数：19469；
如图5（b）所示，脉络宁颗粒供试品（批号：1904005）HPLC色谱图中，保留时间：34.768 分钟；理论板数：19020。
(3) 依利特 C18柱（250mm×4.6mm,5μm）
如图5（c）所示，石斛酚对照品HPLC色谱图中，保留时间：20.856 分钟；理论板数：17293；
如图5（d）所示，脉络宁颗粒供试品（批号：1904005）HPLC色谱图中，保留时间：20.913分钟；理论板数：15401。
结果表明，石斛酚峰在各种色谱柱均分离良好。
实施例2 含量测定
以高效液相色谱法测定哈巴苷和哈巴俄苷为对照的含量，具体实验方法如下。
1.仪器与试药
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，安捷伦液相工作站，DAD测器。
脉络宁颗粒: 江西银涛药业有限公司生产的11批脉络宁颗粒，批号分别为1904005、1904006、1904007、1904008、1907009、1907010、1907011、1911020、2006016、2001002、2001004。
哈巴苷对照品：来源：中国食品药品检定研究院 批号：111729-201707。
哈巴俄苷对照品：来源：中国食品药品检定研究院 批号：111730-201709。
阴性对照样品: 取缺玄参的原辅料，按处方量及工艺自制阴性。
试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，水为Milli-Q制备的纯化水，其他均为分析纯。
供试品溶液的制备：取装量差异项下的脉络宁颗粒，混匀，取适量，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率500W，频率40kHz）45分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每lmL含哈巴苷30μg、哈巴俄苷10μg的混合溶液，即得。
2. 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱:AlltimaTM C18柱（4.6×250mm，5μm）
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.03%磷酸溶液为流动相B，按表1的规定进行梯度洗脱；
表1 流动相梯度洗脱表
Figure 932186DEST_PATH_IMAGE001
流速：1.000mL/min，柱温：25℃。
理论板数按哈巴俄苷与哈巴苷峰计算均应不低于5000。
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
取哈巴苷和哈巴俄苷对照品适量，加50%甲醇制成适当的浓度，以50%甲醇为空白，在400~200nm波长范围内进行光谱扫描，哈巴苷最大吸收在196nm，而哈巴俄苷最大吸收为280nm（见图6）。结合处方中其他成分（如脉络宁颗粒中包含的其他环烯醚萜苷类）有干扰考虑，故确定检测哈巴苷时采用203nm、哈巴俄苷则采用280nm为测定波长，检测波长按表2的规定进行波长转换。按表2中检测波长分别对哈巴苷和哈巴俄苷对照品进行高效液相色谱测定，色谱图分别见图7中（b）和（c）。结果表明哈巴苷和哈巴俄苷具有不同的特征峰位置，可按本发明的检测波长表进行测定。
表2 检测波长表
时间（分钟) 检测波长(nm)
0〜20 203
20〜40 280
3. 供试品溶液制备的条件考察
3.1不同提取方法的考察
取本品（批号：1904006）两份，各2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别超声处理45分钟（功率500W，频率40kHz)、加热回流45分钟，其它照前述含量测定方法操作，对其提取方法进行了考察，结果列于表3。
表3 不同提取方法考察结果
Figure 52589DEST_PATH_IMAGE002
表3中结果表明，提取方法为超声处理45分钟最佳，哈巴苷和哈巴俄苷的含量更高。
3.2提取溶剂的考察
取本品（批号：1904006）三份，各2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、20%甲醇、50%甲醇各25mL，其它照前述含量测定方法操作，对其提取溶剂进行了考察，结果列于表4。
表4 不同提取溶剂考察结果
提取溶剂 100%甲醇 20%甲醇 30%甲醇 50%甲醇
哈巴苷含量（mg/g） 0.2717 0.3176 0.3220 0.3385
哈巴俄苷含量（mg/g） 0.1201 0.1105 0.1149 0.1200
表4中结果表明，以50%甲醇为提取溶剂最佳，此时哈巴苷和哈巴俄苷的含量最高。
3.3提取时间的考察
取本品（批号：1904006）三份，各2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，分别超声处理20分钟、45分钟、90分钟，其它照前述含量测定方法操作，对其提取时间进行了考察，结果列于表5。
表5不同提取时间考察结果
时间（分钟） 20 45 90
哈巴苷含量（mg/g） 0.3238 0.3385 0.3301
哈巴俄苷含量（mg/g） 0.1179 0.1200 0.1203
表5中结果表明，超声处理45分钟时哈巴苷和哈巴俄苷已基本提取完全，故确定45分钟为提取时间。
3.4提取溶剂体积的考察
取本品（批号：1904006）三份，各2g，精密称定，置锥形瓶中，分别加甲醇10mL、25mL、50mL，其它照前述含量测定方法操作，对其提取体积进行了考察，结果列于表6。
表6不同提取溶剂体积测定结果
溶剂用量（mL） 10 25 50
哈巴苷含量（mg/g） 0.3305 0.3385 0.3335
哈巴俄苷含量（mg/g） 0.1194 0.1200 0.1151
表6中结果表明，甲醇用量为25mL时哈巴苷和哈巴俄苷已基本提取完全，故确定25mL为提取体积。
4. 空白试验和供试品液相分离情况
取缺玄参的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制得阴性对照样品溶液，按前述色谱条件和测定法测定，比较混合对照品色谱、供试品溶液色谱及缺玄参的阴性对照样品溶液，液相色谱图分别见图7中（a）、（d）和（e）。结果表明，供试品中哈巴苷和哈巴俄苷色谱峰有较好的色谱分离性，且阴性无干扰。
5. 线性关系的考察
精密称取哈巴苷对照品12.14mg（含量为96.8%），置50mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为哈巴苷对照品母液；精密称取哈巴俄苷对照品11.17mg（含量为95.9%），置50mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为哈巴俄苷对照品母液；精密量取哈巴苷母液3mL、哈巴俄苷母液1mL至同一20mL量瓶中，加50%甲醇溶液至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液2μL、5μL、10μL、20μL、25μL、30μL，注入液相色谱仪，按前述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线。结果见表7、表8，以及图8、图9。
表7 哈巴苷线性关系测定结果
进样量（μg） 0.07051 0.1763 0.3525 0.7051 0.8814 1.0576
峰面积 64.80 162.35 321.05 639.70 788.75 927.00
表8 哈巴俄苷线性关系测定结果
进样量（μg） 0.02142 0.0536 0.1071 0.2142 0.2678 0.3214
峰面积 110.40 276.80 555.60 1111.30 1390.00 1664.00
由表7、表8，以及图8、图9可得：哈巴苷回归方程为y = 879.71x +8.3994 ，R2 =0.9995，哈巴俄苷回归方程为y = 5185.0x - 0.3032 ，R2 = 1.0000，哈巴苷在0.07051～1.0576μg、哈巴俄苷在0.02142～0.3214μg之间呈良好线性。
6. 精密度试验
精密吸取哈巴苷和哈巴俄苷混合对照品溶液，按前述液相色谱条件和测定法，重复进样6次，哈巴苷和哈巴俄苷峰面积相对标准偏差分别为0.7%和0.05%，见表9和表10。
表9 哈巴苷精密度试验结果
Figure 35589DEST_PATH_IMAGE003
表10 哈巴俄苷精密度试验结果
Figure 634060DEST_PATH_IMAGE004
测定结果表明，各成分精密度均良好，能够满足测定需要，说明本发明方法的精密度较高。
7. 重复性试验
精密吸取供试品溶液（批号：1904006），照前述色谱条件和测定法，将样品重复测定6次，实验结果分别见表11、12。
表11 哈巴苷重复性试验结果
Figure 648765DEST_PATH_IMAGE005
表12 哈巴俄苷重复性试验结果
Figure 940069DEST_PATH_IMAGE006
测定结果表明，本发明方法的重复性良好。
8. 稳定性试验
精密吸取供试品溶液（批号：1904006），按前述液相色谱条件和测定法，每隔一定时间进样一次，结果供试品溶液中哈巴苷和哈巴俄苷在20小时内峰面积无明显变化，结果见表13。
表13 稳定性试验结果
Figure 410365DEST_PATH_IMAGE007
测定结果表明，供试品溶液在20小时内稳定性良好，说明本发明的方法稳定性高。
9. 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的脉络宁颗粒（批号：1904006，哈巴苷0.3367mg/g、哈巴俄苷0.1187mg/g）适量，研细，取约1g，精密称定，置锥形瓶中，精密添加哈巴苷和哈巴俄苷混合对照品溶液（哈巴苷对照品：0.01410mg/mL、哈巴俄苷对照品：0.004285mg/mL）25mL，按照前述色谱条件和测定法进行试验，计算回收率，结果见表14、15。
表14 哈巴苷回收率试验结果
Figure 812527DEST_PATH_IMAGE008
表15 哈巴俄苷回收率试验结果
Figure 684668DEST_PATH_IMAGE009
测定结果表明，各成分加样回收率均良好。
10. 耐用性试验
取脉络宁颗粒，照供试品溶液制备法制备，照前述色谱条件和测定法，分别采用三种不同的色谱柱进行测定。结果见表16，色谱图见图10～11。
表16 色谱柱考察测定结果
Figure 146874DEST_PATH_IMAGE010
结果表明，哈巴俄苷峰在各种色谱柱均分离良好，测得含量无显著差异。
11. 样品测定及限度的制定
取脉络宁颗粒11批，照供试品溶液制备法制备，照前述色谱条件和测定法测定，测定结果见表17。
表17 样品测定结果
Figure 104465DEST_PATH_IMAGE011
以上11批成品的测定结果显示，本品每克含哈巴苷和哈巴俄苷的总量在0.1243～0.4554mg之间，哈巴苷和哈巴俄苷含量平均值为0.3580mg/g。因现有技术是以肉桂酸作为含量测定指标，故暂时无哈巴俄苷实际生产过程中的转移率。中国药典2015年版一部规定玄参以哈巴苷和哈巴俄苷的总量不得低于0.45％，按100%转移理论值为4.275mg/g；另考虑到药材的来源，以及制剂生产、贮藏等因素，本品暂定以目前收集的样品含量平均值的90%制定：“每10g脉络宁颗粒含玄参以哈巴苷（C15H24O10）和哈巴俄苷（C24H30O11）的总量计为3.2mg”较为合适，相当于原药材理论转移率为7.1%。
最终得：每10g脉络宁颗粒中，含玄参以哈巴苷（C15H24O10）和哈巴俄苷（C24H30O11）的总量计，不得少于3.2mg。
对比例1
1.牛膝薄层鉴别
试剂与试药同实施例1。
供试品溶液的制备：取脉络宁颗粒2.5g，研细，加水10mL使溶解，加乙醇5mL、盐酸1mL，加热回流1小时，用三氯甲烷20mL振摇提取，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷2mL使溶解，即得。
对照药材溶液的制备：取牛膝对照药材2g，加乙醇20mL，加热回流40分钟，静置，取上清液10mL，加盐酸1mL，加热回流1小时，浓缩至5mL，加水10mL，用三氯甲烷20mL振摇提取，提取液蒸干，残渣加三氯甲烷2mL使溶解，即得。
对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，即得。
薄层层析（实验环境：T=25.0℃，RH=50%）：照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（40: 1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在110℃加热至斑点显色清晰，在日光下检视。若供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝色斑点，即表示供试品中含有牛膝。
如图1（a）所示，供试品的薄层色谱中齐墩果酸对应位置的显色效果较弱，无明显斑点。原因是在供试品溶液的制备中，其对供试品中齐墩果酸的提取效率低，且分离不完全，因此造成检视效果不理想。
2. 玄参薄层鉴别
试剂与试药同实施例1。
供试品溶液的制备：取脉络宁颗粒2g，研细，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次30mL，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，即得。
对照药材溶液的制备：取玄参对照药材1g，加水煎煮45分钟，滤过，滤液浓缩至20mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，即得。
薄层层析（实验环境：T=25.0℃，RH=50%）：照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60~90℃）-乙酸乙酯-甲酸（7: 3: 0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254nm）下检视。若供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，即表示供试品中含有玄参。
如图2中（a）（b）所示，此方法存在以下问题：
1. 对照药材和供试品的提取方式不一致，会造成提取出的成分有差异；
2. 通过重复试验发现，此方法的检测结果重现性差，图谱所显示的斑点强弱不一，点的个数不一，检视效果不理想。图2（b）中斑点强度比图2（a）的弱，所显示点的个数比图2（a）多。
3. 采用紫外灯（254nm）下检视，色谱中斑点显示不够清晰。
因而此检测方法对玄参的检测结果重现性差，检视效果不理想。本发明对其改进，采用玄参的专属性活性成分哈巴俄苷作为对照，该成分的专属性强；对照药材和供试品的提取方式一致，提取出的成分无偏差；检测结果准确，重现性好；显色采用日光下检视，斑点清晰，显色检视方法比在254nm下检视的专属性强。
3.石斛薄层鉴别
试剂与试药同实施例1。
供试品溶液的制备：取脉络宁颗粒10g，研细，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用三氯甲烷振摇提取4次，每次10mL，合并提取液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，即得。
对照品溶液的制备：取滨蒿内酯对照品，加三氯甲烷制成每1mL含0.3mg的溶液，即得。
薄层层析（实验环境：T=25.0℃，RH=50%）：照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μL、对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（2: 3: 3）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254nm）下检视。若供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，即表示供试品中含有石斛。
结果表明，批号1的薄层色谱中相应位置无显色斑点，而本发明方法在批号1的液相色谱图中检测出了石斛酚。这是因为石斛中滨蒿内酯成分不具专属性，37个石斛属物种中，只有球花石斛、密花石斛和短棒石斛中含有滨蒿内酯，可以将其作为药材鉴定的标准。因此，此检测方法不够准确。
对比例2 含量测定
采用2015年《中华人民共和国药典》第一部117页中的玄参含量测定方法，对脉络宁颗粒中玄参的含量进行高效液相色谱测定。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.03%磷酸溶液为流动相B，按表18的规定进行梯度洗脱；检测波长为210 nm。
表18 流动相梯度洗脱表
时间(分钟） 流动相A ( % ) 流动相B(%)
0~10 3→10 97→90
10~20 10→33 90→67
20~25 33→50 67→50
25~30 50→80 50→20
30~35 80 20
35~37 80→3 20→97
流速：1.000mL/min，柱温：25℃。
理论板数按哈巴俄苷与哈巴苷峰计算均应不低于5000。
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果发现，该方法专属性较差，液相色谱图中在哈巴苷的位置上存在较为明显的干扰，并且通过摸索无法进行分离。因此，本实验未得出哈巴俄苷与哈巴苷的含量数据，即未得到玄参的含量。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.脉络宁颗粒的质量检测方法，其特征在于，包括高效液相色谱法测定脉络宁颗粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量：以流动相对哈巴苷和哈巴俄苷进行梯度洗脱，且哈巴苷的测定波长为200~207 nm，哈巴俄苷的测定波长为280 nm。
2.根据权利要求1所述的脉络宁颗粒的质量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法按以下规定进行梯度洗脱：0~13分钟，3% A→10%A；13~25分钟，10% A→30% A；25~30分钟，30% A→50% A；30~38分钟，50% A→80% A；38~40分钟，80% A。
3.根据权利要求2所述的脉络宁颗粒的质量检测方法，其特征在于，所述测定波长的规定如下：0~20分钟，200~207 nm为测定波长；20~40分钟，280 nm为测定波长。
4.根据权利要求1所述的脉络宁颗粒的质量检测方法，其特征在于，所述流动相以乙腈为流动相A，酸溶液为流动相B；所述酸溶液为磷酸溶液、甲酸溶液或乙酸溶液，浓度为0.01%~0.08%。
5.根据权利要求1所述的脉络宁颗粒的质量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法包括：
对照品溶液的制备：精密称取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品，加25%~100%甲醇制成含哈巴苷、哈巴俄苷的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备：精密称取脉络宁颗粒，加入25%~100%甲醇，超声或加热回流处理20~90分钟，滤过，取续滤液，即得；
测定法：精密吸取等量的对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。
6.根据权利要求5所述的脉络宁颗粒的质量检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备中，脉络宁颗粒与25%~100%甲醇的用量比为1g：5~25mL。
7.根据权利要求1所述的脉络宁颗粒的质量检测方法，其特征在于，每10g脉络宁颗粒中，以哈巴苷和哈巴俄苷的总量计，不少于3.2 mg。
8.根据权利要求1所述的脉络宁颗粒的质量检测方法，其特征在于，还包括牛膝的薄层鉴别：
薄层层析：以牛膝对照药材及齐墩果酸对照品为对照，照薄层色谱法，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂，喷以硫酸乙醇溶液使显色，在日光下检视；
其中，供试品溶液的制备：加盐酸乙醇溶液加热回流，滤过，滤液蒸至近干，加水使溶解，三氯甲烷提取，提取液蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得；
对照药材溶液的制备：取牛膝对照药材，同法制成对照药材溶液；
对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品，加甲醇制成溶液，即得。
9.根据权利要求1所述的脉络宁颗粒的质量检测方法，其特征在于，还包括玄参的薄层鉴别：
薄层层析：以哈巴俄苷对照品为对照，照薄层色谱法，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-冰醋酸-水为展开剂，香草醛硫酸溶液喷雾显色；
其中，供试品溶液的制备：加甲醇超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加水使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取，所得正丁醇液用氨试液洗涤，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解，即得；
对照品溶液的制备：取哈巴俄苷对照品，加甲醇制成溶液，即得。
10.根据权利要求1所述的脉络宁颗粒的质量检测方法，其特征在于，还包括石斛的高效液相色谱鉴别：
以石斛酚对照品为对照，照高效液相色谱法，以乙腈-0.05%磷酸（30:70）为流动相，以206 nm为测定波长进行测定；
其中，供试品溶液的制备：加甲醇处理，滤过，滤液蒸干，残渣加水加热使溶解，三氯甲烷提取，提取液蒸干，加甲醇使溶解，滤过，取续滤液，即得；
对照品溶液的制备：取石斛酚对照品适量，加甲醇制成溶液，即得。
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