CN102297926A - 一种止咳片的快速薄层鉴别与三成分同时定量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种止咳片的快速薄层鉴别与三成分同时定量测定方法。其特征在于：用薄层色谱法在5块薄层板上对制剂中的前胡、黄芩、麻黄、枇杷叶、金银花、苦杏仁和桔梗进行了鉴别。方法简便、快捷，前6项鉴别只需样品2g，甲醇23ml，展开剂40ml，时间2小时。用HPLC法，对制剂中的盐酸麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷进行了同时定量测定，快捷的前处理技术，有效排除了干扰，使三成分的同时定量测定基线平稳，待测定波峰重现性良好。快速薄层鉴别和三成分的同时定量测定构成了一部高水准的药品质量标准，不但可多指标控制药品质量，与常规方法相比，提高检测效率3倍，节省时间3/4，降低成本80％，减少环境污染90％。
Description
技术领域
本发明涉及一种止咳片的快速薄层鉴别与三成分同时定量测定方法。
背景技术
在防病治病方面，中药复方提取制剂占据着重要的位置，中药提取之后，其植物组织已不符存在，显微鉴别亦无能为力，所以其质量控制方法都是以各种有效成分为指标，进行薄层鉴别与含量测定。但在各类国家质量标准中，薄层鉴别多是处理一个样品溶液，一块薄层板，展开一次，一种显色剂，鉴别一味药材。为排除干扰，样品的前处理程序多复杂、烦琐，需用大量的有机试剂反复纯化处理，费力、费时、费试剂、污染环境，危害健康，检测周期长。这样，一个含6～7项薄层鉴别和二项含量测定的质量标准检测完成，一般要花费一周的时间，如遇复试，时间翻倍，检测速度严重制约着中药现代化生产速度。所以寻找简便、快捷的检测方法、提高检测效率、降低检测成本，成为中药质量控制必须突破的难关。以中国药典2010年版一部收载的金蒲胶囊质量标准为例剖析如下。该标准项下收载了7项薄层鉴别和两项含量测定。具体方法如下：
【鉴别】(1)取本品内容物4g，加甲醇20ml，浸渍10分钟，滤过，取滤液10ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴中加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液。吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶5∶1的30～60℃的石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变成红色。
(2)取本品内容物4g，加浓氨试液1ml与三氯甲烷20ml，浸渍1小时，时时振摇，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇5ml使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索乙素对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液20μl、对照品溶液1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为10∶6∶1的正己烷-三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰，挥尽薄层板上吸附的碘，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(3)取本品内容物3g，加三氯甲烷25ml，加热回流5小时，滤过，滤液中加活性炭0.3g，振摇，放置30分钟，滤过，滤液浓缩至干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。另取华蟾酥毒基对照品，加三氯甲烷制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液10μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4∶3∶3的环己烷-三氯甲烷-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(4)取本品内容物6g，加80％丙酮溶液20ml，超声处理30分钟，静置，取上清液，作为供试品溶液。另取红花对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为7∶0.4∶2∶3的乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(5)取本品内容物6g，加甲醇50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，加1％氢氧化钠溶液洗涤2次，每次20ml，取正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗至中性，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为13∶7∶2的三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；置紫外光灯365nm下检视，显相同颜色的荧光斑点。
(6)取本品内容物5g，加三氯甲烷20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取胆酸对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液10μl、对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶7∶5的异辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(7)取本品内容物10g，加三氯甲烷30ml，加热回流4小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。另取穿山甲对照药材2g，同法制成对照药材溶液。吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为20∶1的甲苯-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干。喷以体积比为9∶1的醋酐-硫酸的混合溶液，80℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
苦参含量测定
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为18∶18∶70∶0.1的乙腈-甲醇-pH6.8的磷酸盐缓冲液-三乙胺为流动相，检测波长为220nm，理论板数，按苦参碱峰计算不低于8000。
对照品溶液制备取苦参碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。
供试品溶液制备取装量差异项下的本品内容物，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨溶液2ml使湿润，再加三氯甲烷25ml，以功率250w，频率33kHz，超声处理20分钟，滤过，取滤液，再用三氯甲烷洗涤残渣、容器及滤器4次，每次5ml，滤过，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每粒含苦参以苦参碱C16H24N2O计，不得少于0.16mg。
蟾酥含量测定
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为43.5∶56.5的乙腈-水为流动相，检测波长为292nm，理论板数，按华蟾酥毒基峰计算应不低于4000。
对照品溶液制备取华蟾酥毒基对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.16mg的溶液，即得。
供试品溶液制备取本品40粒的内容物，精密称定，混匀，研细，取约5g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷适量，加热回流5小时，滤过，滤液加活性炭0.3g，振摇，放置5分钟，滤过，用三氯甲烷10ml，分次洗涤滤器及滤渣，合并滤液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每粒含蟾酥以华蟾酥毒基C26H34O6计，不得少于25μg。
上述例子中的7项薄层鉴别，粗略地计算一下，7项薄层鉴别仅样品前处理时间，就要花费20小时，样品38g，有机溶剂370ml，加上展开剂70ml与展开时间14小时，1批样品的薄层鉴别，就要花去约5天的时间与440ml有机溶剂。加上苦参与蟾酥的定量测定时间3天，样品处理溶剂165ml，流动相中的有机相330ml，一批样品的薄层鉴别和定量测定完成，需时间8天，有机试剂770ml。如遇复试，得到检测结果，就需半月时间，检测速度无法与机械化大生产相匹配。提高检测效率、降低检测成本、减少环境污染，成了检测人员刻不容缓的奋斗目标，我们就是在该背景条件下，发明了一种止咳片的快速薄层鉴别与三成分同时定量测定方法。
该止咳片，由黄芩、蜜炙枇杷叶、蜜炙麻黄、苦杏仁、前胡、桑白皮、瓜蒌、苦杏仁、金银花、竹茹十味中药组成，配比如下：
上述处方中的十味中药，蜜炙枇把叶、蜜炙麻黄、苦杏仁、前胡用8-10倍量40-70％乙醇提取1-3次，每次1-3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，备用；桑白皮、竹茹、瓜蒌、桔梗、金银花，加8-10倍量水煎煮至沸，加入黄芩，煎煮1-3次，每次1-3小时，合并提取液，滤过，滤液浓缩至在60℃测定相对密度为1.05-1.10清膏，加乙醇，使含醇量达70-75％，冷藏放置20-24小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，与醇提液合并，浓缩至在60℃测定相对密度为1.10-1.18清膏，喷雾干燥。取喷雾粉与10-30％淀粉，混匀，制粒，加0.1-0.5％的硬脂酸镁，压片，包薄膜衣，即得。
发明内容
本发明就是针对检测速度无法与机械化大生产相匹配的难点，发明了采用同一供试品溶液与甲醇超声的各药材的上清溶液，在4块薄层板上，简便、快捷地完成前胡、黄芩、麻黄、枇杷叶、金银花、苦杏仁六味药材鉴别。为排除干扰，采用另一种供试品溶液，完成桔梗药材的鉴别。并用同一非缓冲盐流动相，以等度洗脱的方式，20分钟内同时测定盐酸麻黄碱、伪麻黄碱与苦杏仁苷。
该发明7味药材的薄层鉴别，三种有效成分的定量测定，一共需用供试样品5.5g，前处理时间2小时，加上薄层展开与定量测定的时间、溶剂，总花费溶剂220ml，时间2天，与上述的金蒲胶囊比较，都是7味药材的薄层鉴别与2-3种成分的定量测定，本发明可提高检测效率4倍，节约供试品86％、有机溶剂74％，是一套简便、快捷、高效、低耗、低污染、多指标控制药品质量的现代化标准。其中前胡、黄芩、麻黄和苦杏仁的薄层鉴别以及盐酸麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷的同时定量测定为首次报道。
本研究中样品以含水甲醇提取后，吸取一定量，通过氧化铝柱除杂，含水甲醇洗脱，滤过，续滤液进样的程序，去除了绿原酸、黄芩苷等酸性成分的干扰，使供试品溶液成为近无色的澄清溶液。首次以普通的反相色谱柱，非缓冲盐体系，体积比为4.5∶9∶86.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相，进行了盐酸麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷的同时定量测定，待测成分波峰分离良好，色谱柱耐用性广。
通过方法学考察，盐酸麻黄碱进样量在0.0505～0.505μg，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝2294941.7X+1112，γ＝0.999997(见表1、图8)；苦杏仁苷进样量在0.1488～1.488μg，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝728603X+3142，γ＝0.99996(见表2、图9)。采用加样回收实验，结果表明：盐酸麻黄碱9次测定的平均回收率为100.14％，RSD为1.99％(见表3)；苦杏仁苷9次测定的平均回收率为97.88％，RSD为1.64％(见表4)。精密度(见表5)、稳定性(见表6)、重复性(见表7)、专属性(见图10、11、12、13)与柱耐用性(见表8、图14、15、16)实验均符合方法学要求。适用于止咳片中盐酸麻黄碱和苦杏仁苷的同时定量测定。
本发明解决其技术问题所采用的方案为：
(1)快速薄层鉴别方法
①取止咳片，研细，称取2g，加甲醇4ml，超声处理10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取前胡、黄芩和麻黄对照药材各0.1～0.3g，分别加甲醇1～3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液。吸取供试品溶液8～10μl，对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为20∶4∶0.5的氯仿-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与前胡对照药材色谱相应的位置上，至少显三个相同的荧光斑点(见图1)；置紫外光灯254nm下检视，在与黄芩对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点(见图2)；喷以2％的茚三酮无水乙醇溶液，100℃烘烤至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与麻黄对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点(见图3)。经空白对照，空白样品(不含前胡或黄芩或麻黄的样品)不干扰测定，鉴别专属。
②取枇杷叶对照药材0.1～0.3g，分别加甲醇1～3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液。吸取鉴别①项下的供试品溶液和对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为7.5∶2.5∶0.15的环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，100℃烘烤至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点(见图4)。经空白对照，空白样品(不含枇杷叶的样品)不干扰测定，鉴别专属。
③取金银花对照药材0.1～0.2g，加甲醇1～3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液。吸取鉴别①项下的供试品溶液和对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为15∶5∶5的乙酸丁酯-甲酸-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，100℃烘烤约5分钟，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点(见图5)。经空白对照，空白样品(不含金银花的样品)不干扰测定，鉴别专属。
④取苦杏仁对照药材0.2～0.5g，加甲醇2～4ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液。吸取鉴别①项下的供试品溶液和对照药材溶液各5～8μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为15∶2∶0.1的环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％磷钼酸乙醇溶液，100℃烘烤至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，至少显2个相同颜色斑点(见图6)。经空白对照，空白样品(不含苦杏仁的样品)不干扰测定，鉴别专属。
⑤取止咳片，除去包衣，研细，称取3g，加热水25ml，超声使溶解，棉花滤过，滤液加盐酸2ml，沸水浴中加热30分钟，冷却，加乙酸乙酯20～25ml，萃取，乙酸乙酯层蒸干，残留物加甲醇1ml，使溶解，作为供试品溶液；另取桔梗对照药材0.5～0.8g，加热水20ml、盐酸2ml，沸水浴中加热30分钟，冷却，棉花滤过，滤液加乙酸乙酯15～20ml，萃取，乙酸乙酯层蒸干，残留物加甲醇1ml，使溶解，作为对照药材溶液；吸取供试品溶液5～8μl，对照药材溶液8～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4∶1∶4∶1的氯仿-乙酸乙酯-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，喷以体积比为1∶6的5％香草醛硫酸溶液∶乙醇的混合溶液，热风吹至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色主斑点(见图7)。经空白对照，空白样品(不含桔梗的样品)不干扰测定，鉴别专属。
麻黄与苦杏仁含量测定
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为4.5∶9∶86.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；检测波长207nm；理论板数按苦杏仁苷峰计算不低于1500。
对照品溶液的制备取盐酸麻黄碱和苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成储备液，在取储备液适量，加70％甲醇制成每1ml含盐酸麻黄碱12μg、苦杏仁苷35μg的混合溶液，作为对照品溶液。再取盐酸伪麻黄碱适量，加70％甲醇制成每1ml含盐酸伪麻黄碱5μg的溶液，作为定位溶液。
供试品溶液的制备取止咳片20片，除去包衣，精密称定，研细，取0.3～0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70％甲醇15～25ml，密塞，称定重量，以功率250w、频率40kHz，超声处理15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续溶液2ml，置装有100-120目中性氧化铝1～1.5g的内径1cm的色谱柱上，用70～80％甲醇洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用70～80％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照品溶液与定位溶液各8～10μl、供试品溶液10～15μl，注入液相色谱仪，以盐酸伪麻黄碱确认保留时间与盐酸麻黄碱一致，以盐酸麻黄碱计算含量。
本品每片含麻黄以盐酸麻黄碱计，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总量不得低于0.7mg，含苦杏仁以苦杏仁苷计不得低于2.7mg。
本发明的原理如下：
1.根据中药各有效成分的化学结构和极性不同，随着展开剂的移动，在薄层板上的吸附、解吸附的能力而不一样，使各有效成分的斑点得以分离。又借助各成分极性大小，选取极性近似的有效成分，在不同的检视条件下，呈现不同的斑点颜色，在同一块薄层板上可同时互不干扰地检测数种有效成分，同一供试品溶液，供多项鉴别应用。
2.通过调整流动相的组分、比例以及检测波长，使性质不同的有效成分能在同一流动相中，同一检测波长下，都能呈现一定的波峰面积，而且其波峰面积与含量呈良好线性关系，而得以定量测定。
本发明的创新点及有益效果如下：
(1)突破了一个样品溶液，一块薄层板，展开一次，检测一种中药的传统鉴别方式，创新了采用同一供试品溶液与甲醇超声的各对照药材上清液，在4块薄层板上，完成6味中药的快速薄层鉴别检测。6项鉴别只需样品2g，甲醇23ml，展开剂40ml，时间2小时，其简便性、快捷性，是目前传统鉴别方法都不具备的。
(2)在同一块薄层板上，三种不同的检视条件下，同时检出前胡、黄芩和麻黄的薄层鉴别、苦杏仁磷钼酸乙醇溶液显色的低毒性显色技术以及桔梗脂溶性水解提取液中偏水溶性成分的专属鉴别方法为首次报道，拓宽了鉴别思路，具创新性与实用性。
(3)本处方由十味中药组成，成分复杂，既有酸性的绿原酸、苦杏仁苷、黄芩苷类，又有碱性的麻黄碱类，而且黄芩苷类在反相色谱柱上，具有很强的保留性质。通过调酸碱性的萃取方式，无法使酸性的苦杏仁苷与碱性的麻黄碱共存，亦无法同时测定，而且导致前处理繁琐、费时。本发明正是针对该问题，利用生物碱和苦杏仁苷都能溶于含水甲醇的特性，用含水甲醇提取，再通过氧化铝小柱，巧妙地使强酸性的绿原酸和黄芩苷类被吸附，而弱酸性的苦杏仁苷和碱性麻黄碱类不被吸附的酸碱度之差，排除了绿原酸和黄芩苷类的干扰，得到近于无色的供试品溶液，保证了测定图谱基线平稳、待测定波峰重现性良好。配以优选的流动相组分与比例，使麻黄碱和苦杏仁苷在20分钟内同时测定完毕，麻黄碱保留时间约6分钟，苦杏仁苷的保留时间约12分钟，波峰分离良好。
(4)中国药典2010年版一部收载的麻黄有三个品种，即木贼麻黄、草麻黄和中麻黄。文献报道其麻黄碱含量差异较大，在木贼麻黄和草麻黄中以麻黄碱为主，伪麻黄碱含量较少；中麻黄中伪麻黄碱含量较高，麻黄碱含量较少。因此目前在国家各类中药质量标准中，都是以麻黄碱和伪麻黄碱分别测定的含量相加控制产品质量。鉴于盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱二者为同分异构体，其光谱图和单位浓度的波峰面积都相同，又都是止咳有效成分，所以调整为保留时间相同的同一波峰，以盐酸麻黄碱计二者的总量，解决了以普通的等度洗脱，同一流动相无法同时测定苦杏仁苷的难题，方法简便、快捷、准确，成本低，效率高。
(5)本发明与传统的质量检测方法相比，提高检测效率3～4倍，节省检测时间80％，降低检测成本80％，减少环境污染90％，为一部具有推广应用前景的示范性检测方法。
附图说明
图1为前胡的薄层鉴别。
图2为黄芩的薄层鉴别。
图3为麻黄的薄层鉴别。
图4为枇杷叶薄层鉴别。
图5为金银花薄层鉴别。
图6为苦杏仁薄层鉴别。
图7为桔梗薄层鉴别。
图8盐酸麻黄碱对照品线性关系图
图9苦杏仁苷对照品线性关系图
图10盐酸麻黄碱和苦杏仁苷对照品HPLC色谱图
图11止咳片样品的HPLC色谱图。
图12缺苦杏仁的空白样品HPLC色谱图
图13缺麻黄的空白样品HPLC色谱图
图14 Grace Smart色谱柱(5μm，4.6×250mm)止咳片样品的HPLC色谱图。
图15迪马dimonsil色谱柱(5μm，4.6×150mm)止咳片样品的HPLC色谱图。
图16日本岛津SP-ODS色谱柱(5μm，4.6×150mm)止咳片样品的HPLC色谱图。
图1，图2和图3为同一块薄层板，图1是在紫外灯365nm下检视前胡的荧光斑点，图2是在紫外灯254nm下检视黄芩的斑点，图3是显色后在日光下检视麻黄的斑点，图1、图2和图3的样品标号一样，1为黄芩对照药材，2为黄芩空白，3、4、5为样品，6为前胡对照药材，7为麻黄对照药材，8为前胡空白，9为麻黄空白。
图4中，1空白，2为枇杷叶对照药材，3、4、5为样品。
图5中，1为金银花对照药材，2、3、4为样品，5为空白。
图6中，1、2、3为样品，4为苦杏仁对照药材，5为空白。
图7中，1为空白，2为桔梗对照药材，3、4、5为样品。
图8、图9中，横坐标为进样量μg，纵坐标为峰面积。
图10、图11、图12、图13、图14、图15、图16中，1为盐酸麻黄碱，2为苦杏仁苷。
本发明具体实施方式如下：
①取止咳片，研细，称取2g，加甲醇4ml，超声处理10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取前胡、黄芩和麻黄对照药材各0.1～0.3g，分别加甲醇1～3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液。吸取供试品溶液8～10μl，对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为20∶4∶0.5的氯仿-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与前胡对照药材色谱相应的位置上，至少显三个相同的荧光斑点；置紫外光灯254nm下检视，在与黄芩对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；喷以2％的茚三酮无水乙醇溶液，100℃烘烤至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与麻黄对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。
②取枇杷叶对照药材0.1～0.3g，分别加甲醇1～3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液。吸取鉴别①项下的供试品溶液和对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为7.5∶2.5∶0.15的环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，100℃烘烤至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。
③取金银花对照药材0.1～0.2g，加甲醇1～3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液。吸取鉴别①项下的供试品溶液和对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为15∶5∶5的乙酸丁酯-甲酸-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，100℃烘烤约5分钟，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。
④取苦杏仁对照药材0.2～0.5g，加甲醇2～4ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液。吸取鉴别①项下的供试品溶液和对照药材溶液各5～8μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为15∶2∶0.1的环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％磷钼酸乙醇溶液，100℃烘烤至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，至少显2个相同颜色斑点。
⑤取止咳片，除去包衣，研细，称取3g，加热水25ml，超声使溶解，棉花滤过，滤液加盐酸2ml，沸水浴中加热30分钟，冷却，加乙酸乙酯20～25ml，萃取，乙酸乙酯层蒸干，残留物加甲醇1ml，使溶解，作为供试品溶液；另取桔梗对照药材0.5～0.8g，加热水20ml、盐酸2ml，沸水浴中加热30分钟，冷却，棉花滤过，滤液加乙酸乙酯15～20ml，萃取，乙酸乙酯层蒸干，残留物加甲醇1ml，使溶解，作为对照药材溶液；吸取供试品溶液5～8μl，对照药材溶液8～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4∶1∶4∶1的氯仿-乙酸乙酯-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，喷以体积比为1∶6的5％香草醛硫酸溶液∶乙醇的混合溶液，热风吹至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色主斑点。
麻黄与苦杏仁含量测定
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为4.5∶9∶86.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；检测波长207nm；理论板数按苦杏仁苷峰计算不低于1500。
对照品溶液的制备取盐酸麻黄碱和苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成储备液，在取储备液适量，加70％甲醇制成每1ml含盐酸麻黄碱12μg、苦杏仁苷35μg的混合溶液，作为对照品溶液。再取盐酸伪麻黄碱适量，加70％甲醇制成每1ml含盐酸伪麻黄碱5μg的溶液，作为定位溶液。
供试品溶液的制备取止咳片20片，除去包衣，精密称定，研细，取0.3～0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70％甲醇15～25ml，密塞，称定重量，以功率250w、频率40kHz，超声处理15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续溶液2ml，置装有100-120目中性氧化铝1～1.5g的内径1cm的色谱柱上，用70～80％甲醇洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用70～80％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照品溶液与定位溶液各8～10μl、供试品溶液10～15μl，注入液相色谱仪，以盐酸伪麻黄碱确认保留时间与盐酸麻黄碱一致，以盐酸麻黄碱计算含量。
本品每片含麻黄以盐酸麻黄碱计，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总量不得低于0.7mg，含苦杏仁以苦杏仁苷计不得低于2.7mg。制剂中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷的含量测定结果(见表9)。
表1盐酸麻黄碱进样量与峰面积
表2苦杏仁苷进样量与峰面积
表3样品中盐酸麻黄碱的回收率试验结果
表4样品中苦杏仁苷的回收率试验结果
表5精密度实验结果(峰面积)
表6稳定性实验结果(峰面积)
表7重复性试验结果
测定次数取样量(g) 盐酸麻黄碱含量(mg/g) 苦杏仁苷含量(mg/g)
表8不同色谱柱耐用性试验结果
表9止咳片中盐酸麻黄碱和苦杏仁苷含量测定结果
Claims (4)
1.本发明涉及一种止咳片的快速薄层鉴别与三成分同时定量测定方法，其特征在于：
(1)快速薄层鉴别方法
①取止咳片，除去包衣，研细，称取2g，加甲醇4ml，超声处理10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取前胡、黄芩和麻黄对照药材各0.1～0.3g，分别加甲醇1～3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液；吸取供试品溶液8～10μl，对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为20∶4∶0.5的氯仿-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与前胡对照药材色谱相应的位置上，至少显三个相同的荧光斑点；置紫外光灯254nm下检视，在与黄芩对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；喷以2％的茚三酮无水乙醇溶液，100℃烘烤至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与麻黄对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；
②取枇杷叶对照药材0.1～0.3g，分别加甲醇1～3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液；吸取鉴别①项下的供试品溶液和对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为7.5∶2.5∶0.15的环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，100℃烘烤至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；
③取金银花对照药材0.1～0.2g，加甲醇1～3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液；吸取鉴别①项下的供试品溶液和对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为15∶5∶5的乙酸丁酯-甲酸-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，100℃烘烤约5分钟，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；
④取苦杏仁对照药材0.2～0.5g，加甲醇2～4ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液；吸取鉴别①项下的供试品溶液和对照药材溶液各5～8μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为15∶2∶0.1的环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％磷钼酸乙醇溶液，100℃烘烤至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，至少显2个相同颜色斑点；
⑤取止咳片，除去包衣，研细，称取3g，加热水25ml，超声使溶解，棉花滤过，滤液加盐酸2ml，沸水浴中加热30分钟，冷却，加乙酸乙酯20～25ml，萃取，乙酸乙酯层蒸干，残留物加甲醇1ml，使溶解，作为供试品溶液；另取桔梗对照药材0.5～0.8g，加热水20ml、盐酸2ml，沸水浴中加热30分钟，冷却，棉花滤过，滤液加乙酸乙酯15～20ml，萃取，乙酸乙酯层蒸干，残留物加甲醇1ml，使溶解，作为对照药材溶液；吸取供试品溶液5～8μl，对照药材溶液8～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4∶1∶4∶1的氯仿-乙酸乙酯-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，喷以体积比为1∶6的5％香草醛硫酸溶液∶乙醇的混合溶液，热风吹至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色主斑点；
(2).三成分同时定量测定方法
A.色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为4.5∶9∶86.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；检测波长207nm；理论板数按苦杏仁苷峰计算不低于1500；
B.对照品溶液制备取盐酸麻黄碱和苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成储备液，在取储备液适量，加70％甲醇制成每1ml含盐酸麻黄碱12μg、苦杏仁苷35μg的混合溶液，作为对照品溶液；再取盐酸伪麻黄碱适量，加70％甲醇制成每1ml含盐酸伪麻黄碱5μg的溶液，作为定位溶液；
C.供试品溶液制备取止咳片20片，除去包衣，精密称定，研细，取0.3～0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70％甲醇15～25ml，密塞，称定重量，以功率250w、频率40kHz，超声处理15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续溶液2ml，置装有100-120目中性氧化铝1～1.5g的内径1cm的色谱柱上，用70～80％甲醇洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用70～80％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
D.测定法分别精密吸取对照品溶液与定位溶液各8～10μl、供试品溶液10～15μl，注入液相色谱仪，以盐酸伪麻黄碱确认保留时间，以盐酸麻黄碱计算含量；
本品每片含麻黄以盐酸麻黄碱计，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总量，不得低于0.7mg，含苦杏仁以苦杏仁苷计不得低于2.7mg。
2.根据权利要求1所述的一种止咳片的快速薄层鉴别与三成分同时定量测定方法，其特征在于所述的盐酸伪麻黄碱定位溶液，系用于确定盐酸伪麻黄碱应与盐酸麻黄碱具相同的保留时间，为同一波峰。
3.根据权利要求1所述的一种止咳片的快速薄层鉴别与三成分同时定量测定方法，其特征在于所述的盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱，二者为同分异构体，其光谱图与单位浓度的峰面积都相同，又都是止咳有效成分，所以调整为保留时间相同的同一波峰，以盐酸麻黄碱计二者的总量，简便、快捷，可与苦杏仁苷以等度洗脱的方式，用同一流动相同时测定。
4.根据权利要求1所述的一种止咳片的快速薄层鉴别与三成分同时定量测定方法，其特征在于中性氧化铝柱的作用是去除干扰成分绿原酸和黄芩苷类，得到近于无色的供试品溶液，保证测定图谱基线平稳、待测定波峰重现性良好。
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