CN114487159B - 一种用于川贝清肺糖浆的检测方法 - Google Patents

一种用于川贝清肺糖浆的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于川贝清肺糖浆的检测方法，具体涉及一种中药制剂的检测方法，该检测方法对枇杷叶薄层色谱法进行鉴别，对甘草中的甘草酸铵含量进行测定。通过方法学考察，该检测方法具有专属性强、耐用性好、良好的回收率等效果，能有效的检测川贝清肺糖浆的质量情况，进一步提高产品质量，对于质量标准的提升具有重要意义。

Description

一种用于川贝清肺糖浆的检测方法
技术领域
本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种川贝清肺糖浆的检测方法。
背景技术
川贝清肺糖浆，为贵州威利德制药有限公司的产品，功效为清肺润燥，止咳化痰。用于风热感冒引起胡燥咳，咽干，咽痛等。
川贝清肺糖浆收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂》，标准编号为WS3－B－0184－90。目前川贝清肺糖浆的质量标准有：处方，制法，性状，检查，功能与主治，用法与用量，贮藏，无鉴别和含量测定。其中，
处方：枇杷叶250g、苦杏仁50g、川贝母5g、麦冬天50g、地黄50g、甘草50g、桔梗30g、薄荷15g。
制法：以上八味，苦杏仁加温水浸泡24小时，加热蒸馏，蒸馏液导入盛有90％乙醇的容器中，俟馏液量到达40ml，停止蒸馏，蒸馏液测定苦杏仁苷含量[照苦杏仁项下含量测定方法测定(173页)]，并稀释至每100ml含苦杏仁苷1.79，薄荷加热蒸馏，收集蒸馏液100ml，另器保存；其余枇杷叶等六味与上述两种药渣加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液静置，取上清液浓缩至适量。另取蔗糖600g加水煮沸溶解，滤过，制成单糖浆，加入防腐剂适量与上述浓缩液，混匀，滤过，加入上述苦杏仁水40ml各薄荷蒸馏液，加水至1000ml，混匀，即得。产品为棕褐色的粘稠液体；气芳香，味甜。
检查：相对密度，应不低于1.22；其他，应符合糖浆剂项下的各项规定。
川贝清肺糖浆剂中含有多味中药制剂，其中所含的枇杷叶和甘草在药物配伍中占有较为重要的地位，直接影响了川贝清肺糖浆的治疗效果。而由于糖浆剂的制备工艺中对防菌灭菌的要求较高，可能会导致有效成分随工艺的流失。因此需要通过精密可靠的鉴别和含量检测方法来获取有效成分的实际含量，以达到较好的质量控制效果。
为了解决上述问题，有效的提高产品质量，提升川贝清肺糖浆的质量标准，本发明团队对川贝清肺糖浆原检测方法进行深入研发、考察，建立了一种用于川贝清肺糖浆的检测方法，该方法增加了枇杷叶的薄层色谱鉴别，增加了甘草酸铵的含量测定，不仅有效控制川贝清肺糖浆成品的质量，还能进一步提高产品质量标准。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于川贝清肺糖浆的检测方法。
本发明提供一种用于川贝清肺糖浆的检测方法，所述方法包括：
川贝清肺糖浆中枇杷叶的薄层鉴别；川贝清肺糖浆中甘草酸铵的含量测定。
本发明所述糖浆中枇杷叶药材薄层鉴别方法为：取本品20～30ml，乙酸乙酯提取1～3次，每次20～30ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材0.5～1.5g，加水20～30ml，煎煮0.5～1.5小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各2～10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例5～7：1：1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以9～11％硫酸乙醇溶液，在加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点。
优选的，本发明所述糖浆中枇杷叶药材薄层鉴别方法为：取本品25ml，乙酸乙酯提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材1g，加水25ml，煎煮1小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例6：1：1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点。
本发明所述糖浆中甘草酸铵含量测定的方法为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：C18色谱柱，柱温25℃；以甲醇为流动相A，以0.08～0.12％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.8～1.2mL/min；检测波长为220～240nm；理论塔板数按甘草酸铵峰计算，应不低于2500；
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取本品5ml，至25ml容量瓶，加0.6-1％氨水适量，振摇15-45min，加0.6-1％氨水至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液；
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
优选的，所述色谱条件与系统适用性试验为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：C18色谱柱，柱温25℃；以甲醇为流动相A，以0.09～0.11％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.9～1.1mL/min；检测波长为223～238nm；理论塔板数按甘草酸铵峰计算，应不低于2500。
进一步优选的，所述色谱条件与系统适用性试验为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：C18色谱柱，柱温25℃；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1mL/min；检测波长为237nm；理论塔板数按甘草酸铵峰计算，应不低于2500。
优选的，
所述供试品溶液的制备为：取本品5ml，至25ml容量瓶，加0.8-1％氨水适量，振摇15-30min，加0.8-1％氨水至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
进一步优选的，所述供试品溶液的制备为：取本品5ml，至25ml容量瓶，加50～100％甲醇适量，充分振摇使溶解，加50～100％甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
再进一步优选的，所述供试品溶液的制备为：取本品5ml，至25ml容量瓶，加0.8％氨水适量，振摇15min，加0.8％氨水至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
优选的，所述川贝清肺糖浆的枇杷叶药材薄层鉴别方法中，加热至斑点显色清晰，其加热温度为90～110℃。
进一步优选的，所述川贝清肺糖浆的枇杷叶药材薄层鉴别方法中，加热至斑点显色清晰，其加热温度为100℃。
有益效果：
1、本发明在川贝清肺糖浆的原质量标准基础上，新增了枇杷叶药材的薄层鉴别和甘草酸铵的含量测定，更有利于保证产品的质量，对于提升检测标准具有重要意义。
2、本发明枇杷叶药材的薄层鉴别方法，通过了提取溶剂、提取方式、提取时间、展开剂及比例进行了筛选实验，得到了一种鉴别枇杷叶的药材薄层方法，该方法检测结果斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好；并按药典2015年版四部通则9101(中药质量标准分析方法验证指导原则)要求，经过了方法学考察，表明不同湿度条件下，不同温度条件下，用高效薄层板和硅胶G商品板进行试验，色谱图斑点清晰，分离好，符合要求，Rf值适中，验证试验表明重现性好、耐用性好，且无阴性干扰，进一步证明了该薄层鉴别方法的准确性和可靠性。
3、本发明对待测成分甘草酸铵含量测定方法进行了流动相、样品提取方式及提取时间、色谱柱规格等进行筛选，得到了一种甘草酸铵含量测定方法，该方法出峰时间快、峰形好，分离度、峰纯度均合格，且准确度高，稳定性好，操作简便快捷。
4、本发明甘草酸铵含量检测方法通过了方法学验证考察，在系统适用性确认中，结果显示甘草酸铵峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.46％；保留时间的相对标准偏差(RSD)小于1.0％；理论塔板数均大于2500；分离度均大于1.5；故甘草酸铵含量测定方法符合系统适用性要求；在专属性考察中，结果显示空白溶剂对各峰出峰位置处无干扰，本方法测定的含量具有专属性；在精密度考察中，结果显示6份样品含量结果，RSD为0.70％，表明有良好的精密度，符合要求；在重复性试验中，结果显示6份样品含量结果，RSD为0.26％，说明有良好的重复性；在加样回收率试验中，结果表明甘草酸铵的回收率为100.78％、100.47％、101.86％、100.54％、100.27％、100.80％，平均为100.79％，RSD为0.56％，说明本法有良好的回收率；线性关系的考察中，结果表明甘草酸铵进样量在0.1987μg～2.1853μg范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y＝9973.6537X-133.9857，R＝0.9995；在耐用性、流速变化试验、不同色谱柱试验、被测溶液的稳定性试验考察中，结果RSD值均合格，说明被测溶液在24h内稳定。
5、本发明根据重复性试验结果，6份样品中甘草酸铵的平均含量为0.4791mg/ml。
附图说明
图1枇杷叶专属性考察展开结果(注：薄层图点样从左到右依次表示为样品20161001，20161002，20161003，阴性样品，枇杷叶对照药材)；
图2枇杷叶用硅胶G自制版考察展开结果(注：薄层图点样从左到右依次表示为样品20161001，20161002，20161003，阴性样品，枇杷叶对照药材)；
图3枇杷叶用硅胶G预制板考察展开结果(注：薄层图点样从左到右依次表示为样品20161001，20161002，20161003，阴性样品，枇杷叶对照药材)；
图4枇杷叶在低湿度30％条件下开展结果(注：薄层图点样从左到右依次表示为样品20161001，20161002，20161003，阴性样品，枇杷叶对照药材)；
图5枇杷叶在高湿度85％条件下开展结果(注：薄层图点样从左到右依次表示为样品20161001，20161002，20161003，阴性样品，枇杷叶对照药材)；
图6枇杷叶在低温5℃条件下开展结果(注：薄层图点样从左到右依次表示为样品20161001，20161002，20161003，阴性样品，枇杷叶对照药材)；
图7枇杷叶在室温25℃条件下开展结果(注：薄层图点样从左到右依次表示为样品20161001，20161002，20161003，阴性样品，枇杷叶对照药材)。
具体实施方式
实施例1
【性状】本品为棕褐色的粘稠液体；气芳香，味甜。
【鉴别】取本品25ml，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材1g，加水25ml，煎煮1小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；
照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为6：1：1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点。
【检查】相对密度应不低于1.22；
其他符合糖浆项下有关的各项规定。
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2015版四部通则0512)测定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：WatersXBridge TM C18 5μm，4.6×250mm，柱温25℃；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1mL/min；检测波长为237nm；理论塔板数按甘草酸铵峰计算，应不低于2500；
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取本品5ml，至25ml容量瓶，加0.8％氨水适量，振摇15min，加0.8％氨水至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品每1ml含甘草以甘草酸(C42H62O16)计，不得少于0.20mg。
实施例2
【性状】本品为棕褐色的粘稠液体；气芳香，味甜。
【鉴别】取本品30ml，乙酸乙酯提取3次，每次30ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材1.5g，加水30ml，煎煮1.5小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为7：1：1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以11％硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点；
【检查】相对密度应不低于1.22；
其他符合糖浆项下有关的各项规定。
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2015版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：WatersXBridge TM C18 5μm，4.6×250mm，柱温25℃；以甲醇为流动相A，以0.12％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.2mL/min，检测波长为240nm；理论塔板数按甘草酸铵峰计算，应不低于2500；
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取本品5ml，至25ml容量瓶，加0.6％氨水适量，振摇20min，加0.6％氨水至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品每1ml含甘草以甘草酸(C42H62O16)计，不得少于0.20mg。
实施例3
【性状】本品为棕褐色的粘稠液体；气芳香，味甜。
【鉴别】取本品20ml，乙酸乙酯提取1次，每次20ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材0.5g，加水20ml，煎煮0.5小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为5：1：1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以9％硫酸乙醇溶液，在90℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点；
【检查】相对密度应不低于1.22；
其他符合糖浆项下有关的各项规定。
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2015版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：WatersXBridge TM C18 5μm，4.6×250mm，柱温25℃；以甲醇为流动相A，以0.08％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.8mL/min，检测波长为220nm；理论塔板数按甘草酸铵峰计算，应不低于2500；
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取本品5ml，至25ml容量瓶，加1％氨水适量，振摇45min，加1％氨水至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品每1ml含甘草以甘草酸(C42H62O16)计，不得少于0.20mg。
实施例4
【性状】本品为棕褐色的粘稠液体；气芳香，味甜。
【鉴别】取本品25ml，乙酸乙酯提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材1g，加水25ml，煎煮1小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为5：1：1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点；
【检查】相对密度应不低于1.22(附录26页)
其他符合糖浆项下有关的各项规定。
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2015版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：WatersXBridge TM C18 5μm，4.6×250mm，柱温25℃；以甲醇为流动相A，以0.09％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1mL/min，检测波长为237nm；理论塔板数按甘草酸铵峰计算，应不低于2500；
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取本品5ml，至25ml容量瓶，加0.7％氨水适量，振摇25min，加0.7％氨水至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品每1ml含甘草以甘草酸(C42H62O16)计，不得少于0.20mg。
实施例5
【性状】本品为棕褐色的粘稠液体；气芳香，味甜。
【鉴别】取本品25ml，乙酸乙酯提取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材1g，加水25ml，煎煮1小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各8μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为5：1：1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以9％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点；
【检查】相对密度应不低于1.22；
其他符合糖浆项下有关的各项规定。
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2015版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：C18色谱柱，以甲醇为流动相A，以0.11％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1mL/min，检测波长为237nm；理论塔板数按甘草酸铵峰计算，应不低于2500；
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取本品5ml，至25ml容量瓶，加0.9％氨水适量，振摇30min，加0.9％氨水至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品每1ml含甘草以甘草酸(C42H62O16)计，不得少于0.20mg。
实施例6
【性状】本品为棕褐色的粘稠液体；气芳香，味甜。
【鉴别】取本品20ml，乙酸乙酯提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材1g，加水20ml，煎煮1小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为7：1：1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以11％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点；
【检查】相对密度应不低于1.22；
其他符合糖浆项下有关的各项规定。
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2015版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：C18色谱柱，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1mL/min；检测波长为237nm；理论塔板数按甘草酸铵峰计算，应不低于2500；
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取本品5ml，至25ml容量瓶，加0.8％氨水适量，振摇35min，加0.8％氨水至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品每1ml含甘草以甘草酸(C42H62O16)计，不得少于0.20mg。
为了进一步验证本发明的有效性，发明人进行了一系列的验证试验，具体如下：
实验例1 枇杷叶薄层色谱法试验
1、试剂与试药
川贝清肺糖浆剂样品，批号：20161001、20161002、20161003；来源：贵州威利德制药有限公司；
枇杷叶对照药材(批号：121261-201303；来源：中国药品生物制品检定所)；
硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂生产)；自制硅胶G薄层板；
试剂：甲醇、乙酸乙酯、甲苯、丙酮、氯仿为分析纯。
2、薄层色谱方法的选择
常见的薄层色谱有硅胶薄层层析、纸层析、聚酰胺薄层层析等。纸层析适用于大极性成分如多糖类成分，聚酰胺层析适用于含有羟基较多的成分，而硅胶适合于低极性和中等极性化合物，适合于枇杷叶中化合物的分离,故选择硅胶层析进行实验。
3、供试品及对照品的制备
目前川贝清肺糖浆的原质量标准中还没有涉及枇杷叶的定性鉴别，为了进一步提升川贝清肺糖浆的质量标准，建立了川贝清肺糖浆中枇杷叶的薄层鉴别的方法，首先借鉴《中国药典》2015年版中枇杷叶定性鉴别方法进行检测：
鉴别方法：取本品1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。另取枇杷叶对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，斑点模糊且较小，明显拖尾，所有斑点较拥挤，前后干扰。
根据借鉴方法检测的薄层结果，出现的问题，结合川贝清肺糖浆的性质，对枇杷叶薄层鉴别方法中提取溶剂、提取方式、展开剂的选择及展开剂比例等进行考察，暂定考虑所用鉴别方法为：
暂定鉴别方法为：取本品25ml，乙酸乙酯提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材1g，加水25ml，煎煮1小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为7：2：1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点。
3.1提取溶剂的选择：
方法1：取本品川贝清肺糖浆25ml，加乙醇提取2次，每次25ml，合并乙醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液1；
方法2：取本品川贝清肺糖浆25ml，加氯仿提取2次，每次25ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液2；
方法3：取本品川贝清肺糖浆25ml，加乙酸乙酯提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液3；
以上三种提取溶剂处理的供试品溶液，分别按“3”项下所述的暂定鉴别方法进行薄层检测，结果见表1。
表1供试品提取溶剂的筛选表
结果，由表1可知，方法1处理的样品，斑点模糊，方法2、3处理的样品，在枇杷叶对照药材相对应的位置上均显斑点，且斑点清晰，没有干扰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好，但氯仿毒性较大，因此，选择乙酸乙酯为最佳提取溶剂。
3.2提取次数的选择：
方法1：取本品川贝清肺糖浆25ml，加乙酸乙酯提取1次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液1；
方法2：取本品川贝清肺糖浆25ml，加乙酸乙酯提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液2；
方法3：取本品川贝清肺糖浆25ml，加乙酸乙酯提取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液3；
以上三种提取次数处理的样品，分别按“3”项下所述的暂定鉴别方法进行薄层检测，结果见表2。
表2提取次数的筛选表
结果，由表2可知，方法1处理的样品，斑点较弱，不明显，方法2、3处理的样品，斑点清晰，没有干扰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好，且两种处理的斑点相似，无差别，因此，选择提取的最佳次数为2次。
3.3供试品的点样量：
取本品川贝清肺糖浆25ml，加乙酸乙酯提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
分别吸取供试品溶液2μl、5μl、10μl,对照药材溶液10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为7：2：1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液；进行薄层检测，结果见表3。
表3供试品的点样量筛选表
结果，由表3可知，点样量为5μl，斑点符合要求，Rf值适中，重现性好，因此，选择供试品的最佳点样量为5μl。
3.4展开剂溶剂的选择：
根据化合物的性质及“相似相溶”的原则选择合适的展开溶剂。
枇杷叶成分偏中高极性，且提取时选择乙酸乙酯为提取溶剂，因此选择一种低极性溶剂调节溶剂，并调节适当比例，使得到最佳分离；
方法1：以氯仿-甲醇(8:2)为展开剂；
方法2：以乙酸乙酯-丙酮(7:3)为展开剂；
方法3：以甲苯-乙酸乙酯-丙酮(7:1:2)为展开剂；
方法4：以甲苯-乙酸乙酯-丙酮:(6:1:1)为展开剂；
以上四种展开剂展开，分别按“3”项下所述的暂定鉴别方法进行薄层检测，结果见表4。
表4展开剂筛选表
结果，由表4可知，方法4展开的样品，斑点明显，分离度符合要求，重现性好，因此，选择最佳展开剂为甲苯-乙酸乙酯-丙酮(6:1:1)。
3.5方法学验证
3.5.1专属性
取川贝清肺糖浆、枇杷叶对照药材及缺枇杷叶阴性样品，同“3.3”项所述方法制得供试品溶液、对照品溶液及阴性供试品溶液，点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮:(6:1:1)为展开剂,展开，取出，晾干，置日光下检视；在供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，且斑点分离较好，阴性无干扰。见图1。
3.5.2重现性
取川贝清肺糖浆3批，分别按“3.5.1”项下薄层鉴别方法展开，结果见表6。
表6重现性试验结果
3.5.3耐用性
3.5.3.1不同薄层板的比较
取川贝清肺糖浆3批，分别按“3.5.1”项下薄层鉴别方法展开，比较青岛海洋化工厂分厂硅胶G商品板和硅胶G自制板的薄层，结果见表7。见图2、图3。
表7不同薄层板耐用性结果表
结果：硅胶G预制板斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中；硅胶G自制版斑点清晰，分离达到要求,Rf值适中，故本方法耐用性好。
3.5.3.2不同湿度的比较
比较低湿度(30％)和高湿度(85％)环境下硅胶G预制板展开效果，结果见表8。见图4、图5。
表8低湿度(30％)和高湿度(85％)环境下高效薄层板展开效果表
结果：斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，两个条件下均能得到较好的鉴别色谱。
3.5.3.3不同温度的比较
比较低温(5℃)和室温(25℃)环境下硅胶G预制板展开效果，结果见表9。见图6、图7。
表9低温(5℃)和室温(25℃)环境下高效薄层板展开效果表
结果：斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，两个条件下均能得到较好的鉴别色谱。
3.6结论
经过上述方法学实验研究，川贝清肺糖浆中枇杷叶药材薄层鉴别方法为：
取本品25ml，乙酸乙酯提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；取不含枇杷叶的自制样品25mL，同供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液；另取枇杷叶对照药材1g，加水25ml，煎煮1小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为6：1：1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点；该方法在不同湿度条件下，用高效薄层板和硅胶G商品板进行试验，色谱图斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，验证试验表明重现性好、耐用性好。
实验例2 甘草酸铵含量检测方法的筛选
1、试剂、试药及仪器
川贝清肺糖浆剂样品，批号：20161001、20161002、20161003；
甘草酸铵对照药材(批号：110731-201619；来源：中国药品生物制品检定所)；
青岛海洋化工厂分厂生产的硅胶G薄层板及自制硅胶G薄层板；
试剂：乙腈为色谱纯；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、磷酸为分析纯；水为重蒸馏水；
高效液相色谱仪：THERMO液相色谱仪；超声清洗仪。
2、甘草酸铵含量方法流动相的选择
目前川贝清肺糖浆检测项目还没有涉及甘草酸铵含量，为了进一步提升川贝清肺糖浆的质量标准，建立了川贝清肺糖浆中甘草酸铵含量测定的方法，首先借鉴《中国药典》2015年版中甘草药材中甘草酸铵含量测定方法进行检测：
色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，按下表10中的规定进行梯度洗脱；检测波长为237nm。理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000。
表10流动相梯度洗脱程序
对照品溶液的制备取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70％乙醇分别制成每1ml含甘草酸铵0.2mg的溶液，即得(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)。
供试品溶液的制备取本品5ml，精密量取，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：取川贝清肺糖浆，按以上检测方法测定甘草酸铵含量，发现峰分离度差，峰形不好、精确度差、稳定性差、含量低等问题，针对此问题，对甘草酸铵含量方法中供试品提取方法、流动相、波长、提取溶剂及色谱柱等进行考察，具体如下：
2.1流动相的选择
参照《中国药典》2015年版“甘草”项下含量测定方法出现的问题，先暂定把“流动相A”分别替用为“甲醇”、“乙腈”、“乙酸乙酯”，其余条件不变，进行测定，结果显示以“甲醇”作“流动相A”的峰分离和峰形均较好，故“流动相A”优选为“甲醇”，但出峰时间较长，再一步再作分析。
2.2梯度洗脱程序的选择
针对“2.1”项下的检测出峰时间长的问题，以甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，改变其梯度洗脱程序，具体见表11。
表11流动相梯度洗脱程序
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 10 90
5～15 10～16.5 90～83.5
15～30 16.5～22.5 83.5～77.5
30～35 22.5～35 77.5～65
35～50 35 65
50～60 35～50 65～35
结果：按表11的梯度洗脱程序检测，结果显示峰形，峰纯度均良好，阴性无干扰，出峰快，故为优选“梯度洗脱程序”。
2.3检测波长的确定
取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70％乙醇分别制成每1ml含甘草酸铵0.2mg的溶液，在190～400nm波长下进行全波段扫描。
结果:在237nm左右，甘草酸铵有最大吸收峰且无杂质干扰，因此选择237nm作为甘草酸铵含量检测波长。
2.4提取溶剂的考察
取本品3份，每份5ml，精密量取，置25ml容量瓶中，分别用70％乙醇、乙醇、甲醇、0.5％的氨水进行提取，按上述优选的方法进行检测，结果见表12。
表12提取溶剂的选择
结果：采用0.5％氨水作溶剂，甘草酸铵含量最高，说明本品采用0.5％氨水作为提取溶剂，含量提取更完全，因此选择0.5％氨水暂定为试品提取溶剂。
2.5提取溶剂浓度的考察
取本品5份，每份5ml，置25ml容量瓶中，分别加入0.2％氨水、0.5％氨水、0.8％氨水、1％氨水提取供试品，按上述优化色谱条件进行测定，结果见表13。
表13提取溶剂浓度的选择
结果：采用0.8％氨水和1％氨水作溶剂，甘草酸铵含量相当，故提取溶剂优选为“0.8％氨水”。
2.6溶剂提取方式的考察
取本品3份，每份5ml，置25ml容量瓶中，加入0.8％氨水适量，分别振摇提取30分钟、超声处理30分钟、回流提取30分钟，取出，放冷，加0.8％氨水至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液，分别取10μl续滤液注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，结果见表14。
表14提取方式考察表
结果：采用不同提取方式甘草酸铵的含量基本一致，考虑操作简便易行，故选择振摇提取。
2.7提取时间的考察
取本品3份，每份5ml，置25ml容量瓶中，加入0.8％氨水适量，分别振摇15分钟、30分钟、45分钟，加0.8％氨水至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液，分别取10μl续滤液注入液相色谱仪，按上述优选色谱条件进行测定，结果见表15。
表15提取时间考察表
结果：采用不同提取时间甘草酸铵的含量基本一致，故选择振摇提取15分钟。
2.8色谱柱的考察
取本品5ml，置25ml容量瓶，加0.8％氨水适量，充分振摇使溶解，放冷，加0.8％氨水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，分别用：Waters XBridge TM(C18 5μm，4.6×250mm)；Viva C18(USP L1)(C18 5μm，4.6×250mm)；Dikma(C18 5μm，4.6×250mm)，按上述色谱条件进行测定：结果见表16。
表16不同品牌色谱柱对含量测定结果
结果：表明不同品牌十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱对含量测定无影响。
2.9结论：经过以上筛选实验，得出甘草酸铵含量测定的优选方法如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：C18色谱柱，柱温25℃；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表17进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为237nm；理论塔板数按甘草酸铵峰计算，应不低于2500；
表17流动相梯度洗脱程序
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加100％甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取本品5ml，至25ml容量瓶，加0.8％氨水适量，振摇15min，加0.8％氨水至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液；
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.10甘草酸铵含量检测方法学验证考察
2.10.1甘草酸铵含量测定样品制备与方法
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：C18色谱柱，柱温25℃；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表18中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为237nm；理论塔板数按甘草酸铵峰计算，应不低于2500；
表18流动相梯度洗脱程序
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加100％甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取本品5ml，至25ml容量瓶，加0.8％氨水适量，振摇15min，加0.8％氨水至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液；
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.10.2线性关系的考察
精密吸取甘草酸铵对照品溶液2、6、10、14、18、22μl进样，记录色谱，以峰面积为横坐标，以进样量(μg)为纵坐标作图，得到线性方程为Y＝9973.6537x-133.9857，R＝0.9995，结果见表19。
表19甘草酸铵线性关系考察
结果表明，甘草酸铵含量测定在0.1987μg～2.1853μg之间线性关系良好。
2.10.3重复性考察
分别量取6份川贝清肺糖浆样品，分别按“2.10.1”项下供试品溶液制备方法制成样品供试液，以既定色谱条件测定含量，并计算RSD，RSD应不大于3％。结果见表20：
表20重复性试验
结果表明，6份样品中甘草酸铵的平均含量为0.4791mg/ml，RSD为0.26％，表明方法重复性良好。
2.10.4精密度考察
取甘草酸铵对照品溶液0.099mg/ml，重复进样6次，记录色谱。结果见表21。
表21精密度试验
结果表明，6份样品中甘草酸铵的平均峰面积为9653，RSD为0.70％，表明方法精密度良好。
2.10.5加样回收率试验
采用加样回收，精密吸取已测定甘草酸铵含量为0.47mg/ml的样品，再加甘草酸铵对照品适量，按“2.10.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表22。
表22回收率试验
结果表明，甘草酸铵的回收率为100.79％，RSD为0.56％，说明本法有良好的回收率。
2.10.6稳定性试验：
按“2.10.1”项下含量测定方法制备样品，测试不同时间点被测溶液的峰面积，计算RSD考察被测溶液的稳定性。结果见表23。
表23溶液稳定性考察
结果：经试验C18色谱柱适用于该方法；其余测定条件小的变动能满足系统适用性试验要求；被测溶液甘草酸铵峰面积24h内RSD均小于2％，故被测溶液在24h内均稳定。
3甘草酸铵含量测定方法耐用性考察
3.1流动相组成变化试验：按“2.10.1”项下含量测定方法制备样品，配制不同浓度流动相进行检测，证明流动相组成小变动能满足系统适用性试验要求，结果见表24；
表24流动相组成变化试验结果
3.2柱温变化试验：按“2.10.1”项下含量测定方法制备样品，改变柱温进行检测，证明柱温的小变动能满足系统适用性试验要求。结果见表25。
表25柱温变化试验结果
3.3流速变化试验：按“2.10.1”项下含量测定方法制备样品，改变流速进行检测，证明流速的小变动，能满足系统适用性试验要求。结果见表26。
表26流速变化试验结果
3.4不同色谱柱试验：按“2.10.1”项下含量测定方法制备样品，用不同型号的色谱柱进行检测，证明不同色谱柱能满足系统适用性试要求。结果见表27。
表27不同色谱柱类型变化
耐用性考察结果表明，各个条件下测定结果基本一致，RSD％均符合要求，色谱图中甘草酸按峰型尖锐对称，分离度良好，表明本方法不同流速、不同色谱柱、不同温度耐用性良好。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种用于川贝清肺糖浆的质量检测方法，其特征在于，检测方法包括：川贝清肺糖浆中枇杷叶的薄层鉴别；川贝清肺糖浆中甘草酸铵的含量测定，
所述川贝清肺糖浆中枇杷叶的薄层鉴别为：
取本品25ml，乙酸乙酯提取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取枇杷叶对照药材1g，加水25ml，煎煮1小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法2015年版药典四部通则0502试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为6：1：1的甲苯-乙酸乙酯-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，阴性色谱在对照色谱相应的位置上无斑点；
所述川贝清肺糖浆中甘草酸铵的含量测定为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：C18色谱柱，柱温25℃；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1mL/min；检测波长为237nm；理论塔板数按甘草酸铵峰计算，应不低于2500；
对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取本品5ml，至25ml容量瓶，加0.6-1％氨水适量，振摇15-45min，加0.6-1％氨水至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液；
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，甘草酸铵的含量测定的供试品溶液的制备为：取本品5ml，至25ml容量瓶，加0.8％氨水适量，振摇15min，加0.8％氨水至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述加热，温度为100℃。
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