CN106501442A - 一种芩黄清肺散的质量检测方法 - Google Patents

一种芩黄清肺散的质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种芩黄清肺散的质量检测方法，所述方法包括：采用显微鉴定和薄层色谱法对芩黄清肺散样品中的黄芩、大黄、枇杷叶和甘草进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对芩黄清肺散样品中的主要成分黄芩的含量进行测定；通过上述方法对芩黄清肺散样品的组成成分分别进行检测，可有效控制芩黄清肺散样品的质量，使芩黄清肺散更安全、可靠、有效的应用于临床。

Description

一种芩黄清肺散的质量检测方法
技术领域
本发明涉及质量检测领域，尤其涉及的是一种芩黄清肺散的质量检测方法。
背景技术
芩黄清肺散是一种由黄芩、大黄、枇杷叶和甘草四位中药组成的纯中药制剂，具有清肺热、止咳喘的功效。临床上应用芩黄清肺散防止鸡传染性喉气管炎等畜禽呼吸系统疾病已有二十年的历史，其临床疗效确切，副作用小。
在申报兽药的过程中，需要对药品进行质量检测，而现有技术并没有系统完整的对芩黄清肺散的质量进行检测的方法。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种芩黄清肺散的质量检测方法，旨在解决现有技术缺少对芩黄清肺散质量进行系统完整检测的问题。
本发明的技术方案如下：
一种芩黄清肺散的质量检测方法，其中，包括步骤：
A、采用水合氯醛对样品进行透化，将透化后的样品置于显微镜下，根据观察到的显微特征确定样品中的组成成分；
B、采用薄层色谱法对样品中的组成成分分别进行定性鉴别；
C、采用高效液相色谱法对样品中的黄芩成分进行定量测定。
较佳地，所述的芩黄清肺散的质量检测方法，其中，所述步骤B具体包括：
B1、对样品中的黄芩成分进行薄层色谱鉴别的过程中，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水作为展开剂，以三氯化铁乙醇溶液作为显色剂；
B2、对样品中的大黄成分进行薄层色谱鉴别的过程中，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸作为展开剂，在紫外光灯的照射下进行显色；
B3、对样品中的枇杷叶成分进行薄层色谱鉴别的过程中，以甲苯-丙酮作为展开剂，通过喷洒硫酸乙醇溶液，并在90-120℃的加热条件下进行显色；
B4、对样品中的甘草成分进行薄层色谱鉴别的过程中，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸作为展开剂，通过喷洒硫酸乙醇溶液，并在90-120℃的加热条件下进行显色。
较佳地，所述的芩黄清肺散的质量检测方法，其中，所述步骤C中，高效液相色谱法中的流动相采用的是质量比为47:53:0.2的甲醇-水-磷酸。
较佳地，所述的芩黄清肺散的质量检测方法，其中，所述流动相的流速为0.5-1.5ml/min。
较佳地，所述的芩黄清肺散的质量检测方法，其中，所述高效液相色谱法中的检测波长为260-300nm，柱温为30-50℃。
较佳地，所述的芩黄清肺散的质量检测方法，其中，所述步骤C之后还包括：
D、对样品中的黄芩成分进行重复性试验。
较佳地，所述的芩黄清肺散的质量检测方法，其中，所述步骤C之后还包括：
E、对样品进行回收率试验。
有益效果：本发明提供一种芩黄清肺散的质量检测方法，所述方法具体为：采用显微鉴定和薄层色谱法对芩黄清肺散样品中的黄芩、大黄、枇杷叶和甘草进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对芩黄清肺散样品中的主要成分黄芩的含量进行测定；通过上述方法对芩黄清肺散样品的组成成分分别进行检测，可有效控制芩黄清肺散样品的质量，使芩黄清肺散更安全、可靠、有效的应用于临床。
附图说明
图1为本发明一种芩黄清肺散的质量检测方法较佳实施例的流程图。
图2为本发明芩黄清肺散样品中的黄芩成分显微示意图。
图3为本发明芩黄清肺散样品中的大黄成分显微示意图。
图4为本发明芩黄清肺散样品中的枇杷叶成分显微示意图。
图5为本发明芩黄清肺散样品中的甘草成分显微示意图。
图6为本发明对芩黄清肺散样品中的黄芩成分进行薄层色谱鉴别的结果示意图。
图7为本发明对芩黄清肺散样品中的大黄成分进行薄层色谱鉴别的结果示意图。
图8为本发明对芩黄清肺散样品中的枇杷叶成分进行薄层色谱鉴别的结果示意图。
图9为本发明对芩黄清肺散样品中的甘草成分进行薄层色谱鉴别的第一结果示意图。
图10为本发明对芩黄清肺散样品中的甘草成分进行薄层色谱鉴别的第二结果示意图。
图11为本发明对芩黄清肺散样品中的甘草成分进行薄层色谱鉴别的第三结果示意图。
图12为本发明对芩黄清肺散样品中的甘草成分进行薄层色谱鉴别的第四结果示意图。
图13为本发明对芩黄清肺散样品中的甘草成分进行薄层色谱鉴别的第五结果示意图。
图14为本发明中黄芩苷对照品HPLC色谱图。
图15为本发明中芩黄清肺散样品HPLC色谱图。
图16为本发明中芩黄清肺散阴性对照品HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明提供一种芩黄清肺散的质量检测方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
具体地，本发明所提供的芩黄清肺散质量检测方法中所用到的仪器如下所示：
1x71型倒置荧光显微镜(日本Olympus公司),DD70薄层扫描色谱仪(德国DESAGA公司)、岛津LC-20A型系列高效液相色谱仪(SPD-M20A紫外检测器，LABSOL DB CH MLCPOA色谱工作站)、恒温水浴锅(广州红云电器二厂，型号：H.H.S21.6)，电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号：DHG-9075A)，超声波仪(xxx)、点样毛细管(华西医科大学仪器厂生产)，电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司，型号：BSA2245-CW)，100mm×200mm双槽玻璃层析缸(上海信谊仪器厂有限公司，型号：P-1)；薄层层析硅胶G和硅胶H板(青岛海洋化工有限公司，型号：201509012)；
进一步，本发明所提供的芩黄清肺散质量检测方法中所用到的药品和试剂如下所示：
黄芩对照药材(批号120955-201309：)；黄芩苷(批号：110715-201318)；大黄对照药材(批号：121249-201304)；大黄酸(批号：110757-200206)；枇杷叶对照药材(批号：121261-201303)；熊果酸(批号：110742-201421)；甘草对照药材(批号：120904-201519)；均购自中国食品药品检定研究院。芩黄清肺散(自制)；各缺少上述药物之一的4种阴性对照样品(自制)；磷酸、甲醇为色谱纯(Merk)，乙醇、甲酸、正己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、丁酮、冰醋酸、硫酸、三氯化铁、氢氧化钠均为分析纯，水为超纯水。
请参阅图1，图1为本发明一种芩黄清肺散的质量检测方法较佳实施例的流程图，如图所示，其包括步骤：
S100、采用水合氯醛对样品进行透化，将透化后的样品置于显微镜下，根据观察到的显微特征确定样品中的组成成分；
具体地，取过120目筛的芩黄清肺散样品适量，用水合氯醛对所述芩黄清肺散样品进行透化，水合氯醛作为一种良好的透明剂，能迅速渗入粉末组织细胞，增强透光度，并且水合氯醛还能溶解脂肪、淀粉粒等成分从而使细胞膨胀，适于观察样本中的组织细胞形态；将透化后的样品置于1x71型倒置荧光显微镜下，根据观察到的显微特征确定芩黄清肺散样品中的组成成分。
进一步，如图2-图5所示，芩黄清肺散样品中各成分的显微特征明显，在显微镜下可准确分辨，图2为黄芩的显微特征示意图，其为韧皮纤维状；图3为大黄的显微特征示意图，其为草酸钙簇晶状，直径为60-140μm；图4为枇杷叶的显微特征示意图，其为单细胞非腺毛状；图5为甘草的显微特征示意图，其为草酸钙方晶状。
S200、采用薄层色谱法对样品中的组成成分分别进行定性鉴别；
所述步骤S200具体包括：
S210、对样品中的黄芩成分进行薄层色谱鉴别的过程中，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水作为展开剂，以三氯化铁乙醇溶液作为显色剂；
具体地，取芩黄清肺散样品2g，加甲醇50mL，超声处理30min后进行过滤，滤液浓缩至10mL，再次滤过，取滤液作为供试品溶液。分别取缺黄芩的芩黄清肺散2g和黄芩对照药材1g，同法制成阴性对照品溶液和对照药材溶液；再取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；
分别吸取上述对照药材溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各4μL以及黄芩苷对照品溶液2μL，分别点在同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(按质量比计为5:3:1:1)为展开剂，置展开缸中预饱和30分钟，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铁乙醇溶液。
结果如图6所示，(图6中，1为对照品；2为对照药材；3-5为供试品；6为阴性对照)供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液无干扰。
S220、对样品中的大黄成分进行薄层色谱鉴别的过程中，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸作为展开剂，在紫外光灯的照射下进行显色；
具体地，取芩黄清肺散样品0.2g，加20mL甲醇，浸1h后滤过，取10mL蒸干，残渣加水10mL，再加1mL盐酸，水浴加热后加乙醚萃取2次，每次10mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为供试品溶液。分别取缺大黄的芩黄清肺散和大黄对照药材各0.2g，同法制成阴性对照品溶液和对照药材溶液。再取大黄酸对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；
在大黄的TLC鉴别试验中，本发明比较了加热回流提取和超声提取两种提取中药的方法，结果发现两种方法对结果无任何影响；展开剂系统本发明尝试了氯仿-乙酸乙酯(6:1)、石油醚-乙酸乙酯-甲酸(15:5:1)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(15:2:1)；此外，还用二次展开方式，第一次用石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸(9:2:0.5)展开，展距9cm后再以氯仿-甲醇-冰醋酸(8：2:0.2)为展开剂，结果都不理想，对照品发现在原点；
最后本发明以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(8:3:0.2)为展开剂，用硅胶H板进行试验结果良好；具体如下所示：吸取上述4种溶液各4μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(8:3:0.2)为展开剂，置展缸中预饱和30分钟，展开，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。
结果如图7所示(图7中，1为对照品；2为对照药材；3-5为供试品；6为阴性对照)，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙色斑点，阴性对照品溶液无干扰。
S230、对样品中的枇杷叶成分进行薄层色谱鉴别的过程中，以甲苯-丙酮作为展开剂，通过喷洒硫酸乙醇溶液，并在90-120℃的加热条件下进行显色；
具体地，取芩黄清肺散样品2g，加甲醇20mL,超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5mL使溶解，作为供试品溶液。分别取缺枇杷叶的芩黄清肺散和枇杷叶对照药材2g，同法制成阴性对照品溶液和对照药材溶液。再取熊果酸对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；
吸取上述4种溶液各4uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(5:1)为展开剂，展开，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
结果如图8所示(图8中，1为对照品；2为对照药材；3-5为供试品；6为阴性对照)，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液无干扰。
S240、对样品中的甘草成分进行薄层色谱鉴别的过程中，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸作为展开剂，通过喷洒硫酸乙醇溶液，并在90-120℃的加热条件下进行显色。
具体地，取芩黄清肺散样品10g，加70％乙醇50ml，超声处理30min，滤过，滤液加浓盐酸3ml，摇匀，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml分次溶解，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，合并乙醚提取液，再用水洗涤3-5次，每次20ml，弃去水液，乙醚液加氨水10ml，萃取2次，收集氨水加浓盐酸10ml后用乙醚萃取2次，每次10ml，后水洗3-4次，收集乙醚液，蒸干，加甲醇定容到2ml，作为供试品溶液。同法制备甘草阴性对照溶液。取甘草对照药材粉末1g，加70％乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液加浓盐酸2ml，摇匀，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液4ml；
在甘草的TLC鉴别试验中，本发明先采用了正丁醇-冰醋酸-水(6:1:2)为展开剂，以GF254板进行实验，其结果如图9所示，(图9中，1为对照品；2为对照药材；3为阴性对照；4-6为供试品；)效果不好；当采用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)作为展开剂后，并在日光下观察结果，阴性对照无干扰，供试品与对照药材相应的位置上出现相应的斑点，而在紫外灯365nm下检视时，结果如图10所示，(图10中，1为对照品；2-4为供试品；5为阴性对照)阴性对照有干扰，因此这种方法也不可以；进一步，本发明用GF254板，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)为展开剂，跑出来的结果与三氯甲烷-水-甲醇(13:6:2)、正丁醇-水-冰醋酸(8:2:1)跑出来的试验类似，如图11-图12所示，(图11中，1为对照品；2为对照药材；3为阴性对照；4-6为供试品；图12中，1为对照药材，2-3为供试品，4为阴性对照)阴性和供试品跑出的斑点一致，对照药材的点与供试品不在相应的位置。
所以，怀疑是芩黄清肺散样品中甘草含量太低，而其它杂质有干扰，因此根据组方的特征和甘草的性质用盐酸加热回流后先用乙醚得到低极性的物质，除去色素，再让氨水与甘草次酸和其它成分结合，后加盐得到甘草次酸，然后再用乙醚萃取得到更纯的甘草次酸和甘草其它成分。结果显示与对照药材相比，供试品相应的位置出现斑点，阴性对照无干扰。方法独特，分离度好。
吸取上述对照药材溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(4：1：0.5)上层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视；
结果如图13所示，(图13中，1为对照药材；2-4为供试品；5为阴性对照)供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。
S300、采用高效液相色谱法对样品中的黄芩成分进行定量测定。
具体地，本发明采用的色谱柱为依利特C18柱(250mm×4·6mm，5μm)，其流动相采用的是质量比为47:53:0.2的甲醇-水-磷酸；流动相的流速为0.5-1.5ml/min，检测波长为260-300nm，柱温为30-50℃；优选地，检测波长为280nm；流速1mL/min；柱温40℃，在该参数条件下，测量结果更准确。
对照品溶液制备：黄芩苷对照品约3mg，精密称定于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。摇匀，超声波处理约5分钟至黄芩苷溶解，制成每1mL含约60μg左右的母液，即得。-20℃保存。使用前用0.45um的微孔过滤膜过滤；
供试品溶液制备：取芩黄清肺散样品粉末约0.3g，精密称定，加70％乙醇40ml，加热回流3小时，放冷，用滤纸过滤，滤液置100ml容量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤到EP管中，-20℃保存；
阴性对照品溶液的制备：取缺少黄芩的芩黄清肺散2g，加甲醇50ml，超声处理30min后过滤，滤液浓缩至10ml，再次过滤，取滤液作为阴性对照品溶液。
分别取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各20uL，注入高效液相色谱仪，记录高效液相色谱图。其结果如图14-图16所示，从供试品色谱图可以看出，在上述色谱条件下，理论塔板数黄芩苷大于2500，阴性对照在黄芩苷相同保留时间处无干扰峰。
线性范围考察：使用前，精密吸取上述黄芩苷对照品溶液的母液2、4、6、8、10ml，置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得到黄芩苷的浓度分别为12,24,36,48,60ug/mL。吸取20μL，注入高效液相色谱仪，以上述色谱条件测定峰面积。以对照品浓度作为横坐标(X)，峰面积作纵坐标(Y)，得出线性回归方程：y＝60732x-267829，r＝0.9999。结果表明，黄芩苷在0.604mg-3.02mg具有很好的线性关系。
精密度试验：精密吸取同一份黄芩苷对照品溶液20uL，在检测波长为280nm；流速1mL/min；柱温40℃的条件下重复进样6次，测定峰面积，求得黄芩苷的RSD为1.78％，满足含量测定的要求。
进一步，本发明还对样品中的黄芩成分进行稳定性试验：取同一批供试品溶液(注明批号)，依上述色谱条件分别在0、4、8、12、24h进样20uL,记录色谱图，测定峰面积，结果表明，芩黄清肺散溶液在24h内测定值基本稳定，RSD为0.63％。
进一步，本发明还对样品中的黄芩成分进行重复性试验：取同一供试品(注明批号)平行称取6份，每份约0.6g，精密称取。依上述色谱条件测定，按外标法计算含量，求得黄芩苷含量的RSD值为0.99％。
进一步，本发明还对芩黄清肺散样品进行回收率试验：称取6份已知含量的芩黄清肺散样品(注明批号、黄芩苷含量)约0.15g，精密称定，以当前样品含量的0.8，1.0，1.2倍，分别精密加入黄芩苷，制备溶液，进样时每个提取液进样测定2次，按上述色谱条件测定，按公式：回收率％＝(C-A)/B(C:加入对照品后的测得值；A：样品中所含被测成分量；B：加入对照品量)计算回收率，结果如表1所示。
表1：加样回收率测试结果(n＝9)
黄芩作为芩黄清肺散样品中的君药，在样品组成成分中占的比例较大，含量较高，以黄芩作为含量测定的指标成分，可以准确的反应芩黄清肺散样品的质量，因此选择黄芩作为本发明中高效液相色谱定量分析的成分。通过上述高效液相色谱分析得到的结果是：芩黄清肺散样品中的黄芩在0.604mg-3.02mg(r＝0.9999)具有良好的线性范围，精密度、稳定性、重复性的RSD<3.0％；测得加样回收率为100.49％(RSD＝1.71％，n＝9)。
综上所述，本发明提供一种芩黄清肺散的质量检测方法，所述方法具体为：采用显微鉴定和薄层色谱法对芩黄清肺散样品中的黄芩、大黄、枇杷叶和甘草进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对芩黄清肺散样品中的主要成分黄芩的含量进行测定；通过上述方法对芩黄清肺散样品的组成成分分别进行检测，可有效控制芩黄清肺散样品的质量，使芩黄清肺散更安全、可靠、有效的应用于临床。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，例如，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种芩黄清肺散的质量检测方法，其特征在于，包括步骤：
A、采用水合氯醛对样品进行透化，将透化后的样品置于显微镜下，根据观察到的显微特征确定样品中的组成成分；
B、采用薄层色谱法对样品中的组成成分分别进行定性鉴别；
C、采用高效液相色谱法对样品中的黄芩成分进行定量测定。
2.根据权利要求1所述的芩黄清肺散的质量检测方法，其特征在于，所述步骤B具体包括：
B1、对样品中的黄芩成分进行薄层色谱鉴别的过程中，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水作为展开剂，以三氯化铁乙醇溶液作为显色剂；
B2、对样品中的大黄成分进行薄层色谱鉴别的过程中，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸作为展开剂，在紫外光灯的照射下进行显色；
B3、对样品中的枇杷叶成分进行薄层色谱鉴别的过程中，以甲苯-丙酮作为展开剂，通过喷洒硫酸乙醇溶液，并在90-120℃的加热条件下进行显色；
B4、对样品中的甘草成分进行薄层色谱鉴别的过程中，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸作为展开剂，通过喷洒硫酸乙醇溶液，并在90-120℃的加热条件下进行显色。
3.根据权利要求1所述的芩黄清肺散的质量检测方法，其特征在于，所述步骤C中，高效液相色谱法中的流动相采用的是质量比为47:53:0.2的甲醇-水-磷酸。
4.根据权利要求3所述的芩黄清肺散的质量检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.5-1.5ml/min。
5.根据权利要求1所述的芩黄清肺散的质量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中的检测波长为260-300nm，柱温为30-50℃。
6.根据权利要求1所述的芩黄清肺散的质量检测方法，其特征在于，所述步骤C之后还包括：
D、对样品中的黄芩成分进行重复性试验。
7.根据权利要求1所述的芩黄清肺散的质量检测方法，其特征在于，所述步骤C之后还包括：
E、对样品进行回收率试验。
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