CN109709249A - 一种基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法，属于中药质量检测技术领域。所述方法包括以下步骤：S1：含量测定：通过对哈巴苷、哈巴俄苷的含量测定，以确定玄参是否符合《中国药典》的含量要求；S2：指纹图谱相似度评价：采用相似度分析对桃叶珊瑚苷、哈巴苷、阿魏酸、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸的特征图谱鉴别，用于增加对玄参质量真假、优劣的鉴别，以及对玄参质量均一性、稳定性的评价；S3：综合评分：建立一个加权综合评价体系对玄参的质量进行全面评估。本发明通过增加肉桂酸的含量测定以及对玄参主要活性成分的特征图谱鉴别，并对其检测成分通过加权评分进行综合质量评价，有利于更准确地评定玄参的质量。
Description
技术领域
本发明属于中药质量检测技术领域，具体涉及一种基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法。
背景技术
玄参为玄参科植物玄参ScraphularianingpoensisHemsl.的干燥根。冬季茎叶枯萎时采挖，除去根茎、幼芽、须根及泥沙，晒或烘至半干，堆放3～6天，反复数次至干燥。玄参是一种常用的中药材，始载于《神农本草经》，列为中品。《名医别录》云：“生何间川谷及冤句”。玄参别名：元参、乌元参、黑参、重台、鬼藏、正马、鹿肠、玄台、逐马、馥草、野脂麻、山当归、水萝卜。玄参的用药历史悠久，具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结的功效。用于热入营血，温毒发斑，热病伤阴，舌绛烦渴，津伤便秘，骨蒸劳嗽，目赤，咽痛，白喉，瘰疬，痈肿疮毒。为历代《中国药典》所收载，其疗效确切、应用广泛。临床应用的玄参饮片是由玄参中药材加工而成，取玄参药材除去残留根茎和杂质，洗净，润透，切薄片，干燥；或微泡，蒸透，稍晾，切薄片，干燥，即得。
经对玄参的研究发现，在玄参中含量较高的主要活性成分有：桃叶珊瑚苷、哈巴苷、阿魏酸、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸等，经研究和查询相关文献发现玄参中各主要活性成分的药理作用与临床应用的关系为：
(1)肉桂酸
肉桂酸，又名β-苯丙烯酸、3-苯基-2-丙烯酸。具有轻泻、抗肿瘤、抗细菌及真菌、升白细胞、利胆的作用(国家医药管理局中草药情报中心站，1986； Liuetal，1995)。能够抑制多种诱变剂的SOS诱导活性，而且其甲酯结构具有较强的抗诱变潜力(Miyazawaetal,1998)。对人肺癌细胞有明显抑制作用。肉桂酸有抗血栓形成的作用，主要表现为具有延长凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)及抑制凝血酶的作用(PizzoSV，1986)。功效性的甲氧基肉桂酸具有解热作用(周浓)。
此外，肉桂酸还可用于合成治疗冠心病的重要药物乳酸可心定和心痛平，及合成氯苯氨丁酸和肉桂本哌嗪；还有抑制形成酪氨基酸酶及使黑色素合成量减少的作用，对紫外线有一定的隔绝作用，能使褐斑变浅，甚至消失，具有显著的抗氧化功效，对于减慢皱纹的出现有很好的疗效，是高级防晒霜中必不可少的成分之一。
(2)哈巴苷
玄参中哈巴苷含量较高，含量为0.289～5.997mg/g(周佳，2017)。哈巴苷能抗菌、解热、镇痛、解痉、抗心律不齐，增加心肌营养性血流量，提高耐缺氧能力等功效。
(3)哈巴俄苷
哈巴俄苷为玄参中含量较高的成分之一，含量为1.517～9.735mg/g(周佳，2017)。具有抗慢性炎症、降压、镇痛、解痉、抗乙肝病毒以及免疫促进作用(王东辉，2011)。对炎症介质的产生和体外诱导的血小板聚集都有不同程度的抑制作用。还可促进阴虚小鼠脾淋巴细胞增殖，诱导脾淋巴细胞产生IL-2，能降低阴虚小鼠血浆中cAMP的含量，并能调整cAMP/cGMP比值至正常对照组水平，使抑制的免疫功能得以恢复，推测哈巴俄苷为玄参产生滋阴作用的物质基础之一 (谢丽华，2001)。
(4)桃叶珊瑚苷
桃叶珊瑚苷为玄参中含量较高的成分之一，属环烯醚萜类化合物，其相对分子质量为346，分子式为C15H22O9,桃叶珊瑚苷具有保肝护肝(促进干细胞再生，明显抑制乙型肝炎病毒DNA的复制，可作为治疗非酒精性脂肪肝的潜在药物)、解毒抗菌(其苷元及有效多聚体是一种抗菌素，对6种革兰阴性菌、阳性菌和致病真菌都有一定的抑制效果)、抗炎(与其7,8位双键及6-O取代基有关)、神经保护(可保护神经元细胞、调控神经元细胞的凋亡。缓解急性脑出血引起的神经元损伤，对糖尿病脑病神经元有保护作用)、抗肿瘤(诱导骨髓白血病K562 细胞凋亡)、抗氧化及抗光老化作用、抗骨质疏松、保护心血管、促进伤口愈合等作用。药动学研究表明其口服生物利用度低，仅为19.3％，难以被肠道吸收，需酶解为桃叶珊瑚苷苷元而发挥疗效。到目前为止，在天然产物中分离得到的 6-O取代桃叶珊瑚苷衍生物共有23个，其中20个来自于玄参属植物。
(5)阿魏酸
阿魏酸化学名为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，肉桂酸的衍生物之一，是植物界普遍存在的一种酚酸。对玄参中肉桂酸和其衍生物(阿魏酸等)对H2O2的清除能力进行研究，结果表明具有强抗氧化剂功效。药理实验表明，阿魏酸及其衍生物具有增加冠脉血流量、保护心肌缺血、抗血小板凝集和血栓、抗辐射(降低辐射引起机体活性氧的增多，抑制辐射引起的粘附损伤，对受辐射内皮细胞产生保护作用)、抗氧化(具有很好的抗氧化活性，不仅能清除自由基，而且能抑制和清除产生自由基的酶)、抗炎抗病毒(对大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌均有一定的抑制效果)、抗肿瘤(促进血管平滑肌细胞彼此黏附，抑制癌细胞迁移。对抗结肠癌的研究较多)、抗突变、增加免疫力、抗抑郁等多种作用。阿魏酸还抑制皮肤黑色素的沉积，进而延缓衰老，改善皮肤细嫩度。还具有预防骨质流失，改善妇女更年期综合征功效，对老年人具有恢复和改善记忆的功能。阿魏酸盐和阿魏酸酯类含有酚羟基和苯烯结构，可清除自由基和拮抗内皮素功能，使其能双重保护血管内皮功能，可应用于心血管疾病的治疗。
(6)安格洛苷C
玄参中总苯丙素苷类的主要成分为安格洛苷C和麦角甾苷，两者重量比为 90～95:10～5，两者含量之和占总苯丙素苷总重量的80％以上(专利CN1931868A， 2007)。安格洛苷C在玄参中具有较高的含量(张雪梅，2011)，含量为0.898～ 3.568mg/g(周佳，2017)。研究表明具有抗氧化、消炎功效(Diazetal,2004)。一般认为环烯醚萜苷类物质是玄参的抗炎主要成分。但AHMED研究表明，苯丙素苷类抗氧化活性明显比环烯醚萜类强。玄参的抗炎、抗氧化作用可能主要与其苯丙素苷类中的成分安格洛苷C有关(曾华武，1999)。安格洛苷C具有抗血小板聚集及保肝作用，还能显著降低尿酸水平。安格洛苷C通过抑制导致心肌肥大、心室重构的有关刺激、介导因素，从而改善心肌肥大、心室肥厚的症状和心肌的生物学功能(专利CN101940579A,2011)。
由于玄参的应用广、效疗多、成分复杂，目前《中国药典》仅收载有哈巴苷和哈巴俄苷的薄层鉴别与含量测定方法，而忽视了对其它活性成分的检测与质量评定，不能准确地评价玄参的产品质量和疗效，指导临床用药。因此，探讨一种对其多种活性成分进行检测和综合质量评价的方法显得尤为重要。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法。
本发明的具体方案如下：
一种基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法，包括以下步骤：
S1：含量测定：通过对哈巴苷、哈巴俄苷的含量测定，以确定玄参是否符合《中国药典》的含量要求，建立肉桂酸的含量测定方法以进一步增加对玄参质量控制的专属性，初步判别玄参质量的优劣；
S2：指纹图谱相似度评价：采用相似度分析对桃叶珊瑚苷、哈巴苷、阿魏酸、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸的特征图谱鉴别，用于增加对玄参质量真假、优劣的鉴别，以及对玄参质量的均一性、稳定性的评价；
S3：综合评分：建立一个加权综合评价体系对玄参的质量进行全面评估，以比较得出玄参质量的优劣。
优选地，所述对肉桂酸的含量测定具体方法为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；梯度洗脱程序为：0～10 分钟，流动相A60→70％，流动相B40→30％；10～12分钟，流动相A70→60％，流动相B30→40％；检测波长为264nm，理论塔板数按肉桂酸计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：取肉桂酸对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含肉桂酸20μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取过三号筛的玄参样品粉末约1.0g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人50％甲醇50ml，密塞，称定重量，浸泡1小时，采用功率 500W、频率40kHz的超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
优选地，对哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸的含量测定具体方法为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～25 分钟，流动相A5→35％，流动相B95→65％；25～35分钟，流动相A35→70％，流动相B65→30％；35～37分钟，流动相A70→5％，流动相B30→95％，检测波长为 207nm，理论塔板数按哈巴苷哈巴俄苷与哈巴苷峰计算均应不低于5000；
对照品溶液的制备：取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品和肉桂酸对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含哈巴苷60ug、哈巴俄苷40ug、肉桂酸20ug 的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取过三号筛的玄参样品粉末约1.0g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，浸泡1小时，采用功率500W、频率40kHz的超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
优选地，所述采用相似度分析对桃叶珊瑚苷、哈巴苷、阿魏酸、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸的特征图谱鉴别，具体方法为：
A：将玄参样品中桃叶珊瑚苷、哈巴苷、阿魏酸、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸的特征图谱导入“中药色谱特征图谱相似度分析”软件，采用“中位数”法进行峰匹配之后，生成对照谱图；
B：对玄参标准品进行定性分析，得出标准品中各成分共有峰的相对保留时间为：桃叶珊瑚苷5.6min，哈巴苷7.2min，阿魏酸19.1min，安格洛苷20.8min、哈巴俄苷25.8min、肉桂酸29.4min；
C：将样品各成分共有峰的相对保留时间与标准品中各成分共有峰的相对保留时间进行对比，指认玄参样品特征对照谱图中各峰对应的成分，用于对玄参质量真假、优劣的鉴别，以及对玄参质量均一性、稳定性的评价。
优选地，所述加权综合评价体系具体为：
玄参中哈巴俄苷、哈巴苷及安格洛苷C含量较高，且安格洛苷C抗氧化活性、抗炎、抗血小板聚集作用比哈巴苷、哈巴俄苷要强，故将哈巴俄苷、哈巴苷总量的权重系数定为0.4，安格洛苷C的权重系数定为0.3，桃叶珊瑚苷因口服生物利用度低，故将其权重系数定为0.1，肉桂酸及阿魏酸在玄参中相比于其他成分含量要低，故其权重系数定为0.1；
以Xij表示第i批次样品的第j个指标的测定值，首先以各指标的最大值(Xj) max即各色谱图中第j个指标在各色谱峰中峰面积最大者作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理，Dij表示第j个指标下的第i批次样品的标准化数据；即Dij＝100*Xij/(Xj)max，故各评价指标加权处理均为Dij*各指标权重系数，综合评分为各项指标评分相加总和。
优选地，所述加权综合评价体系具体为：
以Xij表示第i批次样品的第j个指标的测定值，首先以各指标的最大值(Xj) max即各色谱图中第j个指标在各色谱峰中峰面积最大者作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理，Dij表示第j个指标下的第i批次样品的标准化数据；
Dij＝100*Xij/(Xj)max (1)
再按各指标的重要程度和各组数据的相对标准差确定加权系数，以SDj表示第j个指标下Dij的标准差，以RSDj表示第j个指标的相对标准差，则根据各指标相对标准差赋权为RSD/RSDj，其中RSD为指定指标的相对标准差；根据各指标的重要程度赋权为Ej，由于不能确定各组分对药效的贡献大小，故认为指纹图谱中的各个色谱峰所代表的各组分都很重要，均设为1，结合各指标的重要程度和各组数据的相对标准差确定的权重系数为：
Fj＝Ej×RSD/RSDj，j＝1，2，.......，k (2)
因此，多指标实验公式为：
Pi＝∑(Fj×Dij)/∑Fj，i＝1，2，.......，n；j＝1，2，.......，k (3)
计算的Pi值越大表示玄参的综合质量越好。
优选地，以哈巴俄苷为参照物，所述RSD为哈巴俄苷的指定指标。
优选地，还建立有《玄参商品规格等级标准评定表》。
优选地，还包括根据《玄参商品规格等级标准评定表》对玄参的性状、检查、浸出物、含量测定指标进行等级评价。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过增加肉桂酸的含量测定方法和桃叶珊瑚苷、哈巴苷、阿魏酸、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸等主要活性成分的特征图谱鉴别，并对其检测成分通过加权评分进行综合质量评价，有利于更全面系统和准确评定玄参的产品质量，可以避免掺假、提高疗效、促进传统中医药的健康发展。
附图说明
图1为液相指纹图谱精密度实验图谱1(相对保留时间)；
图2为液相指纹图谱精密度实验图谱2(峰面积比)；
图3为液相指纹图谱重复性实验图谱1(相对保留时间)；
图4为液相指纹图谱重复性实验图谱2(峰面积比)；
图5为液相指纹图谱稳定性实验图谱1(相对保留时间)；
图6为液相指纹图谱稳定性实验图谱2(峰面积比)；
图7为玄参饮片特征图谱。
其中，图7中2号峰为桃叶珊瑚苷，3号峰为哈巴苷，4号峰为阿魏酸，5 号峰为安格洛苷C，6号(S)峰为哈巴俄苷，7号峰为肉桂酸。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的技术方案，现通过以下实施方式加以说明，以下实施方式属于本发明的保护范围，但不限制本发明的保护范围。
一种基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法，包括以下步骤：
S1：含量测定：通过对哈巴苷、哈巴俄苷的含量测定，以确定玄参是否符合《中国药典》的含量要求，建立肉桂酸的含量测定方法以进一步增加对玄参质量控制的专属性，初步判别玄参质量的优劣；
S2：指纹图谱相似度评价：采用相似度分析对桃叶珊瑚苷、哈巴苷、阿魏酸、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸的特征图谱鉴别，用于增加对玄参质量真假、优劣的鉴别，以及对玄参质量均一性、稳定性的评价；
S3：综合评分：建立一个加权综合评价体系对玄参的质量进行全面评估，以比较得出玄参质量的优劣。
为了更全面的对玄参进行质量评价，本发明新增肉桂酸的含量测定方法，具体操作步骤和方法学如下：
1.1仪器与试药
仪器：Agilent1100高效液相色谱仪；C18(Polarls150×4.6mm，5μ)色谱柱，Chemstation工作站。
试剂：乙腈、甲醇为色谱试剂，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。
对照品：肉桂酸为中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用 (111730-201508)。
1.2色谱条件与系统适用性试验
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为264nm，理论塔板数按肉桂酸计算应不低于3000。
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～10 | 60→70 | 40→30 |
| 10～12 | 70→60 | 30→40 |
1.3对照品溶液的制备
取肉桂酸对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含肉桂酸20μg的溶液，即得。
1.4供试品溶液的制备
取本品过三号筛的粉末约1.0g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人50％甲醇50ml，密塞，称定重量，浸泡1小时，超声处理(功率500W，频率40kHz)45 分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.5测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
1.6线性关系考察
精密量取肉桂酸对照品溶液(1.0mg﹒ml-1)1ml，加色谱甲醇分别稀释至浓度为0.5，1.0，5.0，10.0，50.0，100.0μg﹒ml-1，按上述色谱条件测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标。得回归方程为：A＝123.82*C+32.303 (R2＝0.9998)。
1.7精密度实验
精密量取标准品溶液，稀释至浓度为10μg·ml-1，按照上述色谱条件测定，连续进样6次，结果肉桂酸峰面积的RSD(相对标准偏差)为1.31％，表明仪器精密度良好。结果见下表1。
表1肉桂酸含量测定精密度实验(n＝6)
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD％ |
| 峰面积 | 1374.3 | 1343.3 | 1359.3 | 1381.5 | 1353.0 | 1390.0 | 1.31 |
1.8稳定性实验
取同一份玄参供试品溶液，分别于制备后第1，2，3，4，5d进样分析，按照上述色谱条件测定，计算肉桂酸峰面积RSD为2.36％，表明样品中肉桂酸含量较稳定。结果见下表2。
表2肉桂酸含量测定稳定性实验(n＝5)
1.9重复性实验
精密配制同一批次玄参供试液5份，按照上述色谱条件测定，计算得到肉桂酸含量RSD为0.83％，表明该方法重复性良好。结果见下表3。
表3肉桂酸含量测定重复性实验(n＝6)
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD％ |
| 含量 | 0.0295％ | 0.0296％ | 0.0298％ | 0.0297％ | 0.0293％ | 0.0291％ | 0.83 |
1.10加样回收率实验
取XSY1号玄参饮片样品粉末(过三号筛，肉桂酸含量0.02949％)约1.0g 精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人50％甲醇50ml，密塞，称定重量，浸泡1 小时，超声处理(功率500W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过制成供试品溶液(20mg/ml)。精密量取9份上述供试品溶液，每份0.5ml，编号1～9，1～3号精密加入10.1μg/ml肉桂酸对照品溶液0.63ml，4～6号精密加入10.1μg/ml肉桂酸对照品溶液0.53ml，7～ 9号精密加入10.1μg/ml肉桂酸对照品溶液0.42ml，混合均匀，按照肉桂酸含量测定方法项下色谱条件测定，结果见下表4。结果表明，本方法加样回收率好。
表4玄参中肉桂酸加样回收率实验结果(n＝9)
1.11玄参饮片样品测定结果
按拟定的含量测定方法测定43批玄参饮片样品中肉桂酸的含量，结果见下表5。上述玄参饮片样品的平均含量0.020％，按平均含量的75％折算，本品按干燥品计算，含肉桂酸的含量不得低于0.015％，用于对玄参进行质量评价的主要活性成分指标之一。
表5玄参饮片样品肉桂酸含量测定结果表
对哈巴苷、哈巴俄苷的含量测定，以确定玄参是否符合《中国药典》的含量要求，建立肉桂酸的含量测定方法以进一步增加对玄参质量控制的专属性，增加对玄参质量优劣的判别指标，具体操作方法为：
2.1仪器与试药
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪；C18(Polarls150×4.6mm，5μ)色谱柱，Chemstation工作站。
试剂：乙腈、甲醇为色谱试剂，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。
对照品：哈巴苷为中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用 (111729-201506)；哈巴俄苷为中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用 (111730-201508)；肉桂酸为中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用 (111730-201508)。
2.2色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为207nm。理论塔板数按哈巴苷哈巴俄苷与哈巴苷峰计算均应不低于5000。
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～25 | 5→35 | 95→65 |
| 25～35 | 35→70 | 65→30 |
| 35～37 | 70→5 | 30→95 |
2.3对照品溶液的制备
取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品和肉桂酸对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含哈巴苷60ug、哈巴俄苷40ug、肉桂酸20ug的溶液，即得。
2.4供试品溶液的制备
取本品粉末(过三号筛)约1.0g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，浸泡1小时，超声处理(功率500W，频率40kHz)45 分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.5测定法
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.6内参照物峰(哈巴俄苷)精密度实验
取同一供试品溶液，连续进样6次，分别对内参照物峰(哈巴俄苷)的保留时间和峰面积进行考察，计算其RSD％，其结果见下表6。
表6内参照物峰(哈巴俄苷)精密度实验数据
结果表明，内参照物峰(哈巴俄苷)保留时间RSD为0.112％，内参照物峰 (哈巴俄苷)峰面积RSD为1.582％，内参照物峰(哈巴俄苷)精密度良好。
2.7精密度实验
取同一供试品溶液，连续进样6次，分别对共有峰(峰面积大于0.5％)的相对保留时间和峰面积比值进行考察，计算其RSD％，并对其相似度进行考察。实验数据见表6、7、8，实验数据图谱见图1、2。
表6液相指纹图谱精密度实验数据1(相对保留时间)
表7液相指纹图谱精密度实验数据2(峰面积比值)
备注：单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值不作要求；且未达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积。
表8液相指纹图谱精密度实验数据3(相似度)
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | |
| S1 | 1.000 | 0.999 | 0.997 | 0.999 | 0.999 | 0.999 |
| S2 | 0.999 | 1.000 | 0.998 | 0.999 | 0.998 | 0.998 |
| S3 | 0.997 | 0.998 | 1.000 | 0.998 | 0.997 | 0.996 |
| S4 | 0.999 | 0.999 | 0.998 | 1.000 | 0.999 | 0.998 |
| S5 | 0.999 | 0.998 | 0.997 | 0.999 | 1.000 | 0.999 |
| S6 | 0.999 | 0.998 | 0.996 | 0.998 | 0.999 | 1.000 |
结果表明，各共有峰(峰面积大于0.5％)相对保留时间RSD为0.028％～ 0.288％，各共有峰(峰面积大于10％)峰面积比值RSD为0.173％～1.243％，且各峰相似度均在0.99以上，精密度良好。
2.8重复性实验
取同一批次玄参样品制备供试液6份，分别对共有峰(峰面积大于0.5％) 的相对保留时间和峰面积比值进行考察，计算其RSD％，并对其相似度进行考察。实验数据见表9、10、11，实验数据图谱见图3、4。
表9液相指纹图谱重复性实验数据1(相对保留时间)
表10液相指纹图谱重复性实验数据2(峰面积比值)
备注：单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值不作要求；且未达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积。
表11液相指纹图谱重复性实验数据3(相似度)
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | |
| S1 | 1.000 | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 0.998 | 0.998 |
| S2 | 0.999 | 1.000 | 0.999 | 0.998 | 0.998 | 0.998 |
| S3 | 0.999 | 0.999 | 1.000 | 0.999 | 0.998 | 0.999 |
| S4 | 0.999 | 0.998 | 0.999 | 1.000 | 0.998 | 0.999 |
| S5 | 0.998 | 0.998 | 0.998 | 0.998 | 1.000 | 0.998 |
| S6 | 0.998 | 0.998 | 0.999 | 0.999 | 0.998 | 1.000 |
结果表明，各共有峰(峰面积大于0.5％)相对保留时间RSD为0.027％～0.376％，各共有峰(峰面积大于10％)峰面积比值RSD为1.209％～2.321％，且各峰相似度均在0.99以上，重复性良好。
2.9稳定性实验
取同一份供试品溶液，分别于制备后第0h、3h、6h、12h、24h进样分析，分别对共有峰的相对保留时间和峰面积比值进行考察，计算其RSD％，并对其相似度进行考察。实验数据见表12、13、14，实验图谱见图5、6。
表12液相指纹图谱稳定性实验数据1(相对保留时间)
表13液相指纹图谱稳定性实验数据2(峰面积比值)
备注：单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值不作要求；且未达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积。
表14液相指纹图谱稳定性实验数据3(相似度)
结果表明，各共有峰(峰面积大于0.5％)相对保留时间RSD为0.037％～ 1.166％，各共有峰(峰面积大于10％)峰面积比值RSD为1.254％～1.902％，且各峰相似度均在0.97以上，稳定性良好。
采用相似度分析对桃叶珊瑚苷、哈巴苷、阿魏酸、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸的特征图谱鉴别，用于增加对玄参质量真假、优劣的鉴别，以及对玄参质量均一性、稳定性的评价；具体方法为：
A：将玄参样品中桃叶珊瑚苷、哈巴苷、阿魏酸、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸的特征图谱导入“中药色谱特征图谱相似度分析”软件，采用“中位数”法进行峰匹配之后，生成对照谱图；
B：对玄参标准品进行定性分析，得出标准品中各成分共有峰的相对保留时间，桃叶珊瑚苷5.6min，哈巴苷7.2min，阿魏酸19.1min，安格洛苷20.8min、哈巴俄苷25.8min、肉桂酸29.4min；
C：将样品各成分共有峰的相对保留时间与标准品中各成分共有峰的相对保留时间进行对比，指认玄参样品特征对照谱图中各峰对应的成分，用以对玄参样品各批次之间的质量优劣进行评价。
具体的，将所有样品的特征图谱导入“中药色谱特征图谱相似度分析”软件，采用“中位数”法进行峰匹配之后，生成对照谱图，见图7。可以指认出7个共有峰，7个共有峰的保留时间分别为3.4min(1号峰)、5.7min(2号峰)、7.2min (3号峰)、18.8min(4号峰)、20.7min(5号峰)、25.6(6号峰)min和29.3min (7号峰)，表明这些化学成分的总量能一定程度上代表玄参饮片的质量，根据标准品的定性分析，标准品的保留时间分别为桃叶珊瑚苷5.6min，哈巴苷 7.2min，阿魏酸19.1min，安格洛苷20.8min、哈巴俄苷25.8min、肉桂酸29.4min，可以指认玄参饮片特征对照谱图中5.7min(2号峰)为桃叶珊瑚苷、7.2min(3 号峰)为哈巴苷、18.8min(4号峰)为阿魏酸、20.7min(5号峰)为安格洛苷、 25.6min(6号峰)为哈巴俄苷、29.3min(7号峰)为肉桂酸。以6号峰哈巴俄苷对参照，对共有峰采用相对保留时间和相对保留峰面积表示。结果显示所有共有峰的相对保留时间RSD值均小于2.0％，相对保留时间值分别为0.130(1号峰)、0.192(2号峰)、0.272(3号峰)、0.725(4号峰)、0.815(5号峰)、1.000(S峰)和1.148(7号峰)。因此，在新的玄参饮片质量标准制定过程中引入化学成分的特征图谱将更具科学性。
由于特征图谱相似度评价可用作比较玄参质量的优劣与真假，但无法精准和全面的评价玄参质量的优劣，所以需要建立一个综合评价体系对玄参的质量进行全面评估，以准确评价玄参质量的优劣。
玄参具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结的功效。常用于热病烦渴、发斑、齿龈炎、扁桃体炎、咽喉炎、痈肿、急性淋巴结炎、淋巴结结核、肠燥便秘等症。玄参化学成分复杂，其主要化学成分为环烯醚萜苷类、苯丙素苷类，尚含有植物甾醇、有机酸、黄酮类、三萜皂苷、挥发油、糖类、生物碱等。玄参中环烯醚萜苷类和苯丙素苷类化合物被认为是玄参的主要有效成分，该两大成分可以说明玄参大部分的药理活性。目前药典中玄参只对哈巴苷、哈巴俄苷总量做了要求，并未涉及到苯丙素苷类成分，所以玄参的质量控制还需进一步完善。为了全面系统和准确评价玄参质量的优劣，将玄参中的主要活性成分哈巴苷、哈巴俄苷、桃叶珊瑚苷、安格洛苷C、阿魏酸、肉桂酸作为评价指标，通过综合加权评分方法对玄参质量进行评价。以下两种评价方法可选其中一种。
评价方法一(主观赋权法)：
以Xij表示第i批次样品的第j个指标的测定值。首先以各指标的最大值(Xj) max(即各色谱图中第j个指标在各色谱峰中峰面积最大者)作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理，Dij表示第j个指标下的第i批次样品的标准化数据。Dij＝100*Xij/(Xj)max。故各评价指标加权处理均为Dij*各指标权重系数。综合评分为各项指标评分相加总和。
评价方法二(客观赋权法)：
以Xij表示第i批次样品的第j个指标的测定值。首先以各指标的最大值(Xj) max(即各色谱图中第j个指标在各色谱峰中峰面积最大者)作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理，Dij表示第j个指标下的第i批次样品的标准化数据。
Dij＝100*Xij/(Xj)max (1)
再按各指标的重要程度和各组数据的相对标准差确定加权系数。以SDj表示第j个指标下Dij的标准差，以RSDj表示第j个指标的相对标准差，则根据各指标相对标准差赋权为RSD/RSDj，其中RSD为指定指标(参照物哈巴俄苷)的相对标准差；根据各指标的重要程度赋权为Ej，由于不能确定各组分对药效的贡献大小，故认为指纹图谱中的各个色谱峰所代表的各组分都很重要，均设为1。结合各指标的重要程度和各组数据的相对标准差确定的权重系数为：
Fj＝Ej×RSD/RSDj j＝1，2，.......，k (2)
因此，多指标实验公式为：
Pi＝∑(Fj×Dij)/∑Fj i＝1，2，.......，n；j＝1，2，.......，k (3)
(3)式计算所得的兼顾各指标综合效应的公式，得分越大越好。
为区别玄参质量的优劣，更好地推进玄参商品的优质优价，促进公平交易和行业良性发展，建立如下《玄参商品规格等级标准评定表》
玄参商品规格等级标准评定表
根据《玄参商品规格等级标准评定表》对玄参的性状、鉴别、检查、浸出物和含量测定指标进行权衡，以此评价玄参商品的规格和质量等级。
以上内容不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
Claims (9)
1.一种基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：含量测定：通过对哈巴苷、哈巴俄苷的含量测定，以确定玄参是否符合《中国药典》的含量要求，建立肉桂酸的含量测定方法以进一步增加对玄参质量控制的专属性，增加对玄参质量优劣的判定指标；
S2：指纹图谱相似度评价：采用相似度分析对桃叶珊瑚苷、哈巴苷、阿魏酸、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸的特征图谱鉴别，用于增加对玄参质量真假、优劣的鉴别，以及对玄参质量均一性、稳定性的评价；
S3：综合评分：建立一个加权综合评价体系对玄参的质量进行全面评估，以比较得出玄参质量的优劣。
2.根据权利要求1所述的基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法，其特征在于，所述对肉桂酸的含量测定具体方法为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；梯度洗脱程序为：0～10分钟，流动相A60→70％，流动相B40→30％；10～12分钟，流动相A70→60％，流动相B30→40％；检测波长为264nm，理论塔板数按肉桂酸计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：取肉桂酸对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含肉桂酸20μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取过三号筛的玄参样品粉末约1.0g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人50％甲醇50ml，密塞，称定重量，浸泡1小时，采用功率500W、频率40kHz的超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.根据权利要求1所述的基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法，其特征在于，对哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸的含量测定具体方法为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～25分钟，流动相A5→35％，流动相B95→65％；25～35分钟，流动相A35→70％，流动相B65→30％；35～37分钟，流动相A70→5％，流动相B30→95％，检测波长为207nm，理论塔板数按哈巴苷哈巴俄苷与哈巴苷峰计算均应不低于5000；
对照品溶液的制备：取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品和肉桂酸对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含哈巴苷60ug、哈巴俄苷40ug、肉桂酸20ug的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取过三号筛的玄参样品粉末约1.0g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，浸泡1小时，采用功率500W、频率40kHz的超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
4.根据权利要求3所述的基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法，其特征在于，所述采用相似度分析对桃叶珊瑚苷、哈巴苷、阿魏酸、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸的特征图谱鉴别，具体方法为：
A：将玄参样品中桃叶珊瑚苷、哈巴苷、阿魏酸、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸的特征图谱导入“中药色谱特征图谱相似度分析”软件，采用“中位数”法进行峰匹配之后，生成对照谱图；
B：对玄参标准品进行定性分析，得出标准品中各成分共有峰的相对保留时间；
C：将样品各成分共有峰的相对保留时间与标准品中各成分共有峰的相对保留时间进行对比，指认玄参样品特征对照谱图中各峰对应的成分，用于对玄参质量真假、优劣的鉴别，及对玄参质量均一性、稳定性的评价。
5.根据权利要求3所述的基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法，其特征在于，所述加权综合评价体系具体为：
玄参中哈巴俄苷、哈巴苷及安格洛苷C含量较高，且安格洛苷C抗氧化活性、抗炎、抗血小板聚集作用比哈巴苷、哈巴俄苷要强，故将哈巴俄苷、哈巴苷总量的权重系数定为0.4，安格洛苷C的权重系数定为0.3，桃叶珊瑚苷因口服生物利用度低，故将其权重系数定为0.1，肉桂酸及阿魏酸在玄参中相比于其他成分含量要低，故其权重系数定为0.1；
以Xij表示第i批次样品的第j个指标的测定值，首先以各指标的最大值(Xj)max即各色谱图中第j个指标在各色谱峰中峰面积最大者作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理，Dij表示第j个指标下的第i批次样品的标准化数据；即Dij＝100*Xij/(Xj)max，故各评价指标加权处理均为Dij*各指标权重系数，综合评分为各项指标评分相加总和。
6.根据权利要求3所述的基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法，其特征在于，所述加权综合评价体系具体为：
以Xij表示第i批次样品的第j个指标的测定值，首先以各指标的最大值(Xj)max即各色谱图中第j个指标在各色谱峰中峰面积最大者作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理，Dij表示第j个指标下的第i批次样品的标准化数据；
Dij＝100*Xij/(Xj)max (1)
再按各指标的重要程度和各组数据的相对标准差确定加权系数，以SDj表示第j个指标下Dij的标准差，以RSDj表示第j个指标的相对标准差，则根据各指标相对标准差赋权为RSD/RSDj，其中RSD为指定指标的相对标准差；根据各指标的重要程度赋权为Ej，由于不能确定各组分对药效的贡献大小，故认为指纹图谱中的各个色谱峰所代表的各组分都很重要，均设为1，结合各指标的重要程度和各组数据的相对标准差确定的权重系数为：
Fj＝Ej×RSD/RSDj，j＝1，2，.......，k (2)
因此，多指标实验公式为：
Pi＝∑(Fj×Dij)/∑Fj，i＝1，2，.......，n；j＝1，2，.......，k (3)
计算的Pi值越大表示玄参的综合质量越好。
7.根据权利要求6所述的基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法，其特征在于，以哈巴俄苷为参照物，所述RSD为哈巴俄苷的指定指标。
8.根据权利要求3所述的基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法，其特征在于，还建立有《玄参商品规格等级标准评定表》。
9.根据权利要求3所述的基于玄参多活性成分检测的综合质量评价方法，其特征在于，还包括根据建立的《玄参商品规格等级标准评定表》对玄参的性状、检查、浸出物、含量进行等级评价。
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