CN110376303B - 正交试验优化清咽润喉制剂的提取工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了制剂制造领域的正交试验优化清咽润喉制剂的提取工艺，这种工艺以提取液中没食子酸、东莨菪内酯、滨蒿内酯、荷叶碱含量和出膏率的综合加权评分为评价指标，采用L9(34)正交试验，以乙醇浓度、料液比、提取次数、提取时间为考察因素，优化清咽润喉制剂的提取工艺并进行工艺验证。经正交试验优化后的清咽润喉制剂提取工艺可行性好、重复性好，为后续的生产工艺研究提供了一定的依据。

Description

正交试验优化清咽润喉制剂的提取工艺
技术领域
本发明属于制剂制造领域，具体是正交试验优化清咽润喉制剂的提取工艺。
背景技术
对于咽炎疾病而言，咽炎分为2类。咽部黏膜、黏膜下组织的急性炎症归于急性咽炎。而咽部黏膜、黏膜下及淋巴组织的弥漫性慢性炎症则归于慢性咽炎。慢性咽炎具有症状顽固、较难彻底治愈的特点。
就近年来调查研究咽炎的治疗效果显示，不管是用中医的方法、西医的方法还是用中西医结合的方法，对咽炎的治疗均有一定的疗效。但西医治疗咽炎主要以改善局部炎症反应为主，中医治疗咽炎不仅改善局部炎症反应，而且对机体整体状况也有改善作用。因此，近年来中医方面和中药制剂方面对咽炎治疗的研究逐渐增多。
又因为糖果业是我国食品行业的领军行业，我国虽然是糖果的生产和消费大国，但据统计资料数据显示，我国的人均消费水平并不高。由于人们保健意识加强，所以消费者在食品消费时，更加注重选择具有保健功能的食品。现代社会的“食疗”理念随着人们生活水平的提高不断发生变更，现在人们食用糖果不单是为了补充能量和满足口感，更多的是从中获得不同的营养成分，诸如膳食纤维素、维生素、生物碱类、皂苷类、微量元素、菌类多糖、不饱和脂肪酸、乳酸菌制品及其他生物活性成分等。从而达到保健的目的，对自身健康起到有益作用。
从目前市场情况来看，功能性糖果可分为三大类。而润喉糖类属于第一类功能性糖果，主要作用为提神、清凉、润喉等。
正因上文所述，本发明人在结合食疗和咽炎发病机理的情况下，对咽炎治疗的喉糖处方进行研究，现有技术中的喉糖处方主要由古方青龙白虎汤加荷叶而来。青龙白虎汤出自清代医书，现代用治急性咽喉炎、扁桃体炎、感冒、消化不良等症。该方佐以荷叶，利用荷叶中抑菌成分加强其对咽炎的治疗效果。
但是在实际应用中，往往发现该处方见效缓慢且对于急性咽炎的患者不能及时缓解喉部的不适感，亟需对配方进行优化改进减少患者服药疗程和痛苦。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是优化清咽润喉制剂的配方，用以减少患者服药疗程和痛苦。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：提取液中没食子酸、东莨菪内酯、滨蒿内酯、荷叶碱含量和出膏率的综合加权评分为评价指标，采用L9(34)正交试验，以乙醇浓度、料液比、提取次数、提取时间为考察因素，优化清咽润喉制剂的提取工艺并进行工艺验证。
进一步，对于青果中没食子酸、东莨菪内酯、滨蒿内酯含量的测量方法包括以下步骤：
S1、供试品溶液的粗加工：称取10.0g青果粗粉、10.0g荷叶细丝和10.0g鲜莱菔小丁，置于1000ml圆底烧瓶中，加10倍量纯度为75％乙醇，提取1h，共提2次，随后取出，过滤，摇匀；
S2、供试品溶液的精加工：取10ml粗加工滤液，经旋转蒸发仪挥干，随后用10ml甲醇超声溶解，置于10ml棕色容量瓶内，加甲醇定容至刻度线，振摇均匀，取过0.22μm微孔滤膜的续滤液，即为供试品溶液；
S3、提取对照组溶液，精密称取2.00mg没食子酸对照品于10ml棕色容量瓶内，加入甲醇，使之溶解，并定容至刻度线，振摇均匀；随后精密称取1.00mg东莨菪内酯对照品和1.00mg滨蒿内酯对照品置于同一个25ml棕色容量瓶内，加入甲醇溶解，定容至刻度线，振摇均匀；从中精密移取1ml东莨菪内酯和滨蒿内酯混合对照品溶液于25ml容量瓶内，加甲醇定容至刻度线，振摇均匀；最后移取上述没食子酸对照品3ml、东莨菪内酯和滨蒿内酯混合对照品5ml于10ml棕色容量瓶内，加入甲醇，定容至刻度线；即得没食子酸浓度为0.06000mg·ml-1、东莨菪内酯浓度为0.00800mg·ml-1、滨蒿内酯浓度为0.00800mg·ml-1的混合对照品溶液暂储于冰箱内，备用；
S4、利用SHIMADZU Shim-pack GIST C18柱(4.6mm×250mm,5μm)制作色谱；色谱条件如下，流动相：乙腈-0.5％冰乙酸水溶液，梯度洗脱(0～5min，2.5％乙腈；5～21min，3％～27％乙腈；21～30min，27％～35％；30～32min，3.5％～2.5％乙腈；32～37min，2.5％乙腈)；检测波长：271nm和345nm；柱温：30℃；流速：1.0ml·min-1；进样量：10μl；
S5、标准曲线绘制根据S3中的色谱图取上述混合对照品溶液，分别进样2、4、6、8、10和12μl，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得到3个混合对照品的回归方程。
进一步，荷叶中荷叶碱含量检测包括以下步骤，
S1、供试品溶液的粗加工，称取10.0g青果粗粉、10.0g荷叶细丝、10.0g鲜莱菔小丁，置于1000ml圆底烧瓶中，加10倍量75％乙醇，提取1h，共2次；
S2、供试品的精加工，取出，过滤，振摇均匀，取过0.22μm微孔滤膜的续滤液，即为供试品溶液；
S3、对照品溶液的制备，精密称取2.61mg荷叶碱对照品，置于25ml棕色容量瓶内，加入甲醇，使对照品溶解，并定容至刻度线，倒转摇匀，从上述容量瓶中精密移取1ml对照品溶液，置于10ml容量瓶内，定容至刻度线，即得浓度为0.01044mg·ml-1荷叶碱对照品溶液，暂储于冰箱内，备用；
S4、SHIMADZU Shim-pack GIST C18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：乙腈-0.1％三乙胺溶液(60:40)；检测波长：270nm；柱温：30℃；流速：0.8ml·min-1；进样量：10μl；
S5、标准曲线绘制，取上述荷叶碱对照品溶液，分别进样2、6、10、14、18和22μl，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标。
进一步，以青果中没食子酸含量、东莨菪内酯含量、滨蒿内酯含量，荷叶中荷叶碱含量和出膏率作为考察指标，采用综合评分的方法，其中综合评分＝没食子酸ⅰ/没食子酸max×30％×100+东莨菪内酯ⅰ/东莨菪内酯max×20％×100+滨蒿内酯ⅰ/滨蒿内酯max×20％×100+荷叶碱ⅰ/荷叶碱max×20％×100+干膏率ⅰ/干膏率max×10％×100。
进一步，通过单因素实验筛选出乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取次数(C)和提取时间(D)4个因素，并将这4个因素作为正交试验的考察因素，每个因素设置3个水平坐标；同样以青果中没食子酸含量、东莨菪内酯含量、滨蒿内酯含量，荷叶中荷叶碱含量和出膏率作为考察指标，采用L9(34)正交表进行试验，取其综合评分。
进一步，还包括验证试验，所述验证试验如下：称取10g青果粗粉、10.0g荷叶细丝、10.0g鲜莱菔小丁，置于1000ml圆底烧瓶中，加10倍量75％乙醇，每次提取0.5h，共提3次。
有益效果与技术原理：相对于传统的提验方法，采用本技术方案时，通过初步筛选，暂时确定了如下2个色谱条件。即甲醇-0.5％冰乙酸溶液(7:93)；271nm；30℃；1.0ml·min-1和甲醇-0.1％磷酸溶液(15:85)；271nm；25℃；1.0ml·min-1。
用青果精加工后的试品溶液制备的供试品进行实验时，甲醇-0.5％冰乙酸溶液(7:93)跑出的没食子酸的峰无论分离度还是拖尾因子均达标。而甲醇-0.1％磷酸溶液(15:85)跑出的没食子酸由于有机相比例较前一个有所增加，故没食子酸提前出峰，导致前面的峰积在一起，分离度达不到。
现有技术中用HPLC法同时测定青果中东莨菪内酯和滨蒿内酯，色谱条件为流动相：乙腈-0.5％冰乙酸溶液(16:84)；检测波长：345nm；柱温：35℃；流速：1.0ml·min-1。用青果精加工后的试品溶液项进行实验时，用该色谱条件跑出的东莨菪内酯和滨蒿内酯的峰分离度、拖尾因子均达标。但是东莨菪内酯的保留时间为18.9min，滨蒿内酯的保留时间为40.9min。如果用该色谱条件测定东莨菪内酯和滨蒿内酯含量，则进样一针分析时间过长，从时间和消耗流动相的量上考虑均不可取。
综上所述，由于流动相均可以用0.5％冰乙酸溶液，所以决定用HPLC法同时测定青果中没食子酸、东莨菪内酯和滨蒿内酯含量。又因为之前没食子酸用的是7％的甲醇，故初步设计的色谱条件为：流动相：乙腈-0.05％冰乙酸水溶液，梯度洗脱。0～20min，3％～40％乙腈；20～22min，40％～3％乙腈；22～27min，3％乙腈。流速：1.0ml·min-1。检测波长为271nm和345nm(多波长同时检测)；柱温：30℃。
该梯度没食子酸没有分开，是因为乙腈比例升太快，故前面的3％的乙腈保留5min。该梯度东莨菪内酯也没分开，也是由于乙腈比例升得太快，故降低乙腈比例使其保留时间往后延。即0～5min，3％乙腈；5～25min，3％～35％乙腈；25～27min，35％～3％；27～32min，3％乙腈。修改后的梯度，没食子酸、东莨菪内酯还是分不开，故改为0～5min，2.5％乙腈；5～30min，3％～35％乙腈；30～32min，35％～3％；32～37min，3％乙腈。该梯度分开了没食子酸，但分离东莨菪内酯效果还是不理想。经过多次修改，梯度为0～5min，2.5％乙腈；5～30min，3％～40％乙腈；30～32min，40％～3％；32～37min，3％乙腈。
增加乙腈比例，东莨菪内酯前面的峰反应强烈，保留时间提前得更多，故该梯度把东莨菪内酯分离了出来。后面的滨蒿内酯因为越到后面，乙腈变化比原来更剧烈，所以周围很多小峰更容易压在一起。故从20min(东莨菪内酯出峰处或提前2-4min左右)，具体是先从20min变，看其变化对东莨菪内酯是否有影响，若有影响，则改为21min或22min开始变化，再调节乙腈比例。
调节后的乙腈比例为：0～5min，2.5％乙腈；5～20min，3％～25％乙腈；20～30min，25％～35％；30～32min，35％～2.5％乙腈；32～37min，2.5％乙腈。结果滨蒿内酯出峰情况并不理想，故视情况微调了时间和比例。也即是：0～5min，2.5％乙腈；5～21min，3％～27％乙腈；21～30min，27％～35％；30～32min，35％～2.5％乙腈；32～37min，2.5％乙腈。
附图说明
图1为青果供试品溶液和青果的混合对照品溶液的色谱图；
图2为图1中的没食子酸回归方程图；
图3为图1中的东莨菪内酯回归方程图；
图4为图1中的滨蒿内酯回归方程图；
图5为荷叶碱供试品溶液和荷叶碱对照品溶液的色谱图；
图6为图5中荷叶碱回归方程图；
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
正交试验优化清咽润喉制剂的提取工艺以提取液中没食子酸、东莨菪内酯、滨蒿内酯、荷叶碱含量和出膏率的综合加权评分为评价指标，采用L9(34)正交试验，以乙醇浓度、料液比、提取次数、提取时间为考察因素，优化清咽润喉制剂的提取工艺并进行工艺验证。
具体实施过程如下：其中没食子酸对照品、东莨菪内酯对照品、滨蒿内酯对照品和荷叶碱对照品纯度分别为99.04％、99.00％、98.00％、98.91％。青果药材和荷叶药材经西南医科大学生药学教研室庄元春副教授鉴定分别为橄榄科植物橄榄(Canarium albumRaeusc)的干燥成熟果实；睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn)的干燥叶。
青果中没食子酸、东莨菪内酯和滨蒿内酯含量的供试品溶液的制备，操作人员先称取称取10.0g青果粗粉、10.0g荷叶细丝、10.0g鲜莱菔小丁，置于1000ml圆底烧瓶中，加10倍量75％乙醇，提取1h，共提2次。取出，过滤，摇匀。取10ml滤液，经旋转蒸发仪挥干，随后用10ml甲醇超声溶解，置于10ml棕色容量瓶内，加甲醇定容至刻度线，振摇均匀，取过0.22μm微孔滤膜的续滤液，即为供试品溶液。
密称取2mg没食子酸对照品于10ml棕色容量瓶内，加入甲醇，使之溶解，并定容至刻度线，振摇均匀。精密称取1.00mg东莨菪内酯对照品、1.00mg滨蒿内酯对照品置于同一个25ml棕色容量瓶内，加入甲醇溶解，定容至刻度线，振摇均匀。从中精密移取1ml东莨菪内酯和滨蒿内酯混合对照品溶液于25ml容量瓶内，加甲醇定容至刻度线，振摇均匀。最后移取上述没食子酸对照品3ml、东莨菪内酯和滨蒿内酯混合对照品5ml于10ml棕色容量瓶内，加入甲醇，定容至刻度线。即得没食子酸浓度为0.06000mg·ml-1、东莨菪内酯浓度为0.00800mg·ml-1、滨蒿内酯浓度为0.00800mg·ml-1的混合对照品溶液。暂储于冰箱内，备用。
请参考图1和表1，其中(271nm：A-1没食子酸对照品和B-1没食子酸供试品345nm：A-2、A-3东莨菪内酯、滨蒿内酯对照品；B-2、B-3东莨菪内酯、滨蒿内酯供试品)青果供试品溶液和青果的混合对照品溶液的色谱制作以及标准曲线绘制，操作人员利用高效液相柱，
Figure BDA0002141842630000071
表1回归方程表
设定条件为：流动相：乙腈-0.5％冰乙酸水溶液，梯度洗脱(0～5min，2.5％乙腈；5～12min，3％～27％乙腈；21～30min，27％～35％；30～32min，35％～2.5％乙腈；32～37min，2.5％乙腈)；检测波长：271nm和345nm；柱温：30℃；流速：1.0ml·min-1；进样量：10μl。
请参考图2、图3和图4，青果供试品溶液和青果的混合对照品溶液的色谱条件，取上述混合对照品溶液，分别进样2、4、6、8、10、12μl，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标。可分别得到3个混合对照品的回归方程。
随后对青果供试品溶液和青果的混合对照品溶液进行性能检测，性能检测包括精密度试验、稳定性试验和重复性试验。
关于精密度试验，取青果供试品溶液和青果的混合对照品溶液10μl，连续进样6次，对精密度进行考察。按照青果供试品溶液和青果的混合对照品溶液的色谱条件分别测定峰面积。没食子酸、东莨菪内酯、滨蒿内酯峰面积的RSD分别为1.70％、1.15％、2.00％(n＝6)。说明仪器有良好的精密度。
关于稳定性试验，取青果供试品溶液和青果的混合对照品溶液分别放置0、2、4、6、12和24h，按照青果供试品溶液和青果的混合对照品溶液的色谱条件注入高效液相色谱仪，对供试品的稳定性进行考察。没食子酸、东莨菪内酯、滨蒿内酯峰面积的RSD分别为1.66％、2.09％、1.00％(n＝6)。表明供试品溶液在24h内稳定。
关于重复性试验，取青果供试品溶液和青果的平行供试品溶液6份，按照青果供试品溶液和青果的混合对照品溶液的色谱条件注入高效液相色谱仪，没食子酸、东莨菪内酯和滨蒿内酯平均含量为0.856mg·g-1、0.017mg·g-1、0.048mg·g-1，RSD分别为1.00％、1.62％、2.80％(n＝6)。表明该法重复性良好。
荷叶中荷叶碱供试品溶液的制备，称取10.0g青果粗粉、10.0g荷叶细丝、10.0g鲜莱菔小丁，置于1000ml圆底烧瓶中，加10倍量75％乙醇，提取1h，共2次。取出，过滤，振摇均匀，取过0.22μm微孔滤膜的续滤液，即为供试品溶液。
荷叶碱对照品溶液的制备精密称取2.61mg荷叶碱对照品，置于25ml棕色容量瓶内，加入甲醇，使对照品溶解，并定容至刻度线，倒转摇匀。从上述容量瓶中精密移取1ml对照品溶液，置于10ml容量瓶内，定容至刻度线，即得浓度为0.1044mg·ml-1荷叶碱对照品溶液。暂储于冰箱内，备用。
请参考图5(A-1：荷叶碱对照品B-1：荷叶碱供试品)，荷叶碱供试品溶液和荷叶碱对照品溶液的色谱制作以及标准曲线绘制，操作人员利用高效液相柱，设定条件为：流动相：乙腈-0.1％三乙胺溶液(60:40)；检测波长：270nm；柱温：30℃；流速：0.8ml·min-1；进样量：10μl。
请参考图6根据荷叶碱供试品溶液和荷叶碱对照品溶液的色谱，取上述荷叶碱对照品溶液，分别进样2、6、10、14、18、22μl，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得到回归方程：y＝3000000x+4079.2，r＝0.9999。结果表明：在范围0.06264～0.22968μg内荷叶碱的进样量与峰面积呈现出良好的线性关系。
随后对叶碱供试品溶液和荷叶碱对照品溶液进行性能检测，性能检测包括精密度试验、稳定性试验和重复性试验。
关于精密度试验，取上述对照品溶液10μl，连续进样6次，对精密度进行考察。按照荷叶碱供试品溶液和荷叶碱对照品溶液的色谱条件分别测定峰面积，计算其RSD为0.27％(n＝6)。说明仪器有良好的精密度。
关于稳定性试验，将叶碱供试品溶液和荷叶碱对照品溶液分别放置0、2、4、6、12和24h，荷叶碱供试品溶液和荷叶碱对照品溶液的色谱条件注入高效液相色谱仪，对供试品的稳定性进行考察。荷叶碱峰面积的RSD为1.32％(n＝6)。表明供试品溶液在24h内稳定。
关于重复性试验，取叶碱供试品溶液和荷叶碱对照品溶液的平行供试品溶液6份，按照荷叶碱供试品溶液和荷叶碱对照品溶液的色谱条件注入高效液相色谱仪，荷叶碱平均含量为0.978mg·g-1，RSD为1.10％(n＝6)，表明该法重复性良好。
清咽润喉糖处方提取工艺正交试验，以青果中没食子酸含量、东莨菪内酯含量、滨蒿内酯含量，荷叶中荷叶碱含量和出膏率作为考察指标，采用综合评分的方法，其中综合评分＝没食子酸ⅰ/没食子酸max×30％×100+东莨菪内酯ⅰ/东莨菪内酯max×20％×100+滨蒿内酯ⅰ/滨蒿内酯max×20％×100+荷叶碱ⅰ/荷叶碱max×20％×100+干膏率ⅰ/干膏率max×10％×100。
通过单因素实验筛选出乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取次数(C)、提取时间(D)4个因素，并将这4个因素作为正交试验的考察因素，每个因素设置3个水平。因素水平表见表2
Figure BDA0002141842630000091
Figure BDA0002141842630000101
表2因素水平表
同样以青果中没食子酸含量、东莨菪内酯含量、滨蒿内酯含量，荷叶中荷叶碱含量和出膏率作为考察指标，采用L9(34)正交表进行试验，取其综合评分。综合评分同上述。
试验结果，由表3正交试验结果可知，
Figure BDA0002141842630000102
表3正交试验的结果表
提取次数(C)对清咽润喉制剂方提取影响最大，其次是料液比(B)、乙醇浓度(A)，提取时间(D)对清咽润喉制剂方提取影响最小，即C＞B＞A＞D。采用该综合评分的方法，以青果中没食子酸含量、东莨菪内酯含量、滨蒿内酯含量，荷叶中荷叶碱含量以及干膏率为指标，得到的最佳提取工艺是：以75％乙醇为提取溶剂，加热回流提取3次，每次0.5h，料液比为10:1。即：A2B2C3D1。
验证结论，称取10g青果粗粉、10.0g荷叶细丝、10.0g鲜莱菔小丁，置于1000ml圆底烧瓶中，加10倍量75％乙醇，每次提取0.5h，共提3次。制备3份。结果表明：没食子酸平均含量、东莨菪内酯平均含量、滨蒿内酯平均含量、荷叶碱平均含量和平均干膏率分别为0.931mg·g-1、0.019mg·g-1、0.063mg·g-1、0.970mg·g-1、18.094％(RSD分别为1.20％、1.62％、1.28％、1.10％、2.05％，n＝3)。验证实验结果表明：10倍量的75％乙醇提取3次，每次0.5h，该工艺可行性好。
综上所述，由实验结果和验证实验可知，经正交试验优化后的清咽润喉制剂提取工艺，即以75％乙醇为提取溶剂，加热回流提取3次，每次0.5h，料液比为10:1。该工艺可行性好、重复性好，为后续的生产工艺研究提供了一定的依据。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (4)

1.正交试验优化清咽润喉制剂的提取工艺，其特征在于：以提取液中没食子酸、东莨菪内酯、滨蒿内酯、荷叶碱含量和出膏率的综合加权评分为评价指标，采用L9（34）正交试验，以乙醇浓度、料液比、提取次数、提取时间为考察因素，优化清咽润喉制剂的提取工艺并进行工艺验证；
对于青果中没食子酸、东莨菪内酯、滨蒿内酯含量的测量方法包括以下步骤，
S1、供试品溶液的粗加工：称取10.0g青果粗粉、10.0g荷叶细丝和10.0g鲜莱菔小丁，置于1000ml圆底烧瓶中，加10倍量纯度为75%乙醇，提取1h，共提2次，随后取出，过滤，摇匀；
S2、供试品溶液的精加工：取10ml粗加工滤液，经旋转蒸发仪挥干，随后用10ml甲醇超声溶解，置于10ml棕色容量瓶内，加甲醇定容至刻度线，振摇均匀，取过0.22 μm微孔滤膜的续滤液，即为供试品溶液；
S3、提取对照组溶液，精密称取2.00mg没食子酸对照品于10ml棕色容量瓶内，加入甲醇，使之溶解，并定容至刻度线，振摇均匀；随后精密称取1.00mg东莨菪内酯对照品和1.00mg滨蒿内酯对照品置于同一个25ml棕色容量瓶内，加入甲醇溶解，定容至刻度线，振摇均匀；从中精密移取1ml东莨菪内酯和滨蒿内酯混合对照品溶液于25ml容量瓶内，加甲醇定容至刻度线，振摇均匀；最后移取上述没食子酸对照品3ml、东莨菪内酯和滨蒿内酯混合对照品5ml于10ml棕色容量瓶内，加入甲醇，定容至刻度线；即得没食子酸浓度为0.06000mg·ml-1、东莨菪内酯浓度为0.00800mg·ml-1、滨蒿内酯浓度为0.00800mg·ml-1的混合对照品溶液暂储于冰箱内，备用；
S4、利用SHIMADZU Shim-pack GIST C18柱：4.6mm×250mm,5μm制作色谱；色谱条件如下，流动相：乙腈-0.5%冰乙酸水溶液，梯度洗脱：0～5min，2.5 %乙腈；5～21min，3 %～27%乙腈；21～30min，27 %～35%；30～32min，3.5 %～2.5%乙腈；32～37min，2.5 %乙腈；检测波长：271 nm和345nm；柱温：30℃；流速：1.0 ml·min-1；进样量：10μl；
S5、标准曲线绘制根据S3中的色谱图取上述混合对照品溶液，分别进样2、4、6、8、10和12μl，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得到3个混合对照品的回归方程；
荷叶中荷叶碱含量检测包括以下步骤，
S1、供试品溶液的粗加工，称取10.0g青果粗粉、10.0g荷叶细丝、10.0g鲜莱菔小丁，置于1000ml圆底烧瓶中，加10倍量75%乙醇，提取1h，共2次；
S2、供试品的精加工，取出，过滤，振摇均匀，取过
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μm微孔滤膜的续滤液，即为供试品溶液；
S3、对照品溶液的制备，精密称取2.61mg荷叶碱对照品，置于25ml棕色容量瓶内，加入甲醇，使对照品溶解，并定容至刻度线，倒转摇匀，从上述容量瓶中精密移取1ml对照品溶液，置于10ml容量瓶内，定容至刻度线，即得浓度为0.01044mg·ml-1荷叶碱对照品溶液，暂储于冰箱内，备用；
S4、SHIMADZU Shim-pack GIST C18柱：4.6 mm× 250mm,5μm；流动相：乙腈-0.1 %三乙胺溶液为60:40；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；流速：0.8 ml•min-1；进样量： 10μl；
S5、标准曲线绘制，取上述荷叶碱对照品溶液，分别进样2、6、10、14、18和22μl，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标。
2.根据权利要求1所述的正交试验优化清咽润喉制剂的提取工艺，其特征在于：以青果中没食子酸含量、东莨菪内酯含量、滨蒿内酯含量，荷叶中荷叶碱含量和出膏率作为考察指标，采用综合评分的方法，其中综合评分=没食子酸ⅰ/没食子酸max×30%×100+东莨菪内酯ⅰ/东莨菪内酯max×20%×100+滨蒿内酯ⅰ/滨蒿内酯max×20%×100+荷叶碱ⅰ/荷叶碱max×20%×100+干膏率ⅰ/干膏率max×10%×100。
3.根据权利要求2所述的正交试验优化清咽润喉制剂的提取工艺，其特征在于：通过单因素实验筛选出乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取次数（C）和提取时间（D）4个因素，并将这4个因素作为正交试验的考察因素，每个因素设置3个水平坐标；同样以青果中没食子酸含量、东莨菪内酯含量、滨蒿内酯含量，荷叶中荷叶碱含量和出膏率作为考察指标，采用L9（34）正交表进行试验，取其综合评分。
4.根据权利要求3所述的正交试验优化清咽润喉制剂的提取工艺，其特征在于：还包括验证试验，所述验证试验如下：称取10g青果粗粉、10.0g荷叶细丝、10.0g鲜莱菔小丁，置于1000ml圆底烧瓶中，加10倍量75%乙醇，每次提取0.5h，共提3次。
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