CN107286217B - 四种基源郁金共有药效成分的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种四种基源郁金共有药效成分的提取方法，实现了对郁金药效成分的定性分析，确保药效成分的稳定性，并有利于生产过程的质量控制。本发明采用核磁共振对四种基源郁金共有药效成分进行结构鉴定，并采用薄层色谱法验证结果，与郁金质量之间存在高度相关性，能够准确表达郁金的质量和疗效。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，涉及一种四种基源郁金共有药效成分的提取方法。
背景技术
郁金，为姜科植物温郁金Curcuma wenyujin Y，H. Chenet C.Ling、姜黄Curcumalonga L.、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val.的干燥块根。性寒，味辛苦，入心、肝、胆经，可行气化瘀、清心解郁、利胆退黄。现代研究表明，郁金主要含有挥发油、姜黄素，亦含有多糖类，生物碱及各种微量元素，主要有免疫抑制、降血脂、保肝利胆、抗真菌、抗氧化、抗肿瘤、中枢抑制等药理作用，临床可用于对肝炎，胆囊炎，慢性胃炎，肿瘤，心血管疾病，精神分裂症等疾病的治疗。
2015年版《中国药典》收载了四种郁金为其正品来源：温郁金，主产于浙江瑞安，现代研究表明其主要含有莪术醇、莪术双酮、异味吉马烯、吉马烯、樟脑、龙脑、异龙脑、姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素等；桂郁金，主产于广西，以莪术酮类及类同温郁金和姜黄中的烯类酮类为主要成分；绿丝郁金，主产四川，主要成分有蓬莪术环氧酮、蓬莪术酮、蓬莪术环二烯、蓬莪术环二烯酮、姜黄醇酮等；黄丝郁金，主产于四川省双流、犍为等地，以姜黄酮、姜油烯、水芹烯、桉叶素、香桧稀，姜黄素、单去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、对羟基苯甲醛、香草醛、覆盆子酮、杜鹃醇 、( 2R，4R) -6-( 4'-羟苯基) -2，4-己二醇为主要活性成分，同时还含有生物碱、姜酮等。
临床使用中四种来源郁金均作为同一种药材使用，认为四种郁金含有相同的化学成分和药效作用，实际上因药材来源不同，四种郁金饮片的外观性状和化学组成及含量均有较大差异，影响郁金药效作用的统一和配伍后组方治疗效果的发挥。中药成分复杂，有效成分的分离、提纯、鉴别方法是药效质量控制的关键内容，现有技术中并没有关于不同基源郁金共有药效成分的分离方法的相关报道。因此从四种郁金中提取分离发挥药效的共有化学成分，对于解析四种郁金临床作为同一药用具有极为重要的意义，此外研究结果可进一步补充和完善郁金的质量标准。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供一种四种基源郁金共有药效成分的提取方法，方法简单，纯度高、稳定性、重复性好，有利于对郁金药材及饮片质量进行控制。
本发明技术方案如下：
一种四种基源郁金共有药效成分的提取方法，步骤包括：
1）取郁金饮片，磨粉，过20~40目筛，按照0.05～0.15g/mL的浓度加入95%乙醇，水浴加热回流1h，趁热过滤，滤渣再次加入95%乙醇，重复前述操作，合并两次过滤滤液，滤液旋蒸浓缩至无醇味，按体积比1:10加入蒸馏水，混匀，配制为均一溶液；
进一步地，步骤1）中，优选按照0.1 g/mL的浓度加入95%乙醇。
2）向步骤1）溶液中加入0.25～0.34倍体积的水饱和正丁醇溶液（现用现配）萃取，重复萃取至萃取液无色，合并萃取液，旋蒸浓缩为膏体；
3）将步骤2）膏体在70～80℃水浴蒸干，然后加入无水乙醇溶解，之后加入2倍质量的硅胶，混合均匀，再水浴蒸干，研磨至无结块，得到样品混合物；
进一步地，步骤3）中，所述硅胶，粒度为100～200目。
4）取步骤3）取样品混合物10倍质量的硅胶，按 4～6g/mL加入洗脱剂，搅拌至无气泡，装入层析柱中，装实后在层析柱顶端保留有3～4cm高的洗脱剂，然后将步骤3）样品混合物加入到层析柱顶端，用洗脱剂洗脱并控制洗脱速度为3-4 mL/min，收集洗脱液并进行薄层色谱法鉴别，合并鉴别结果一致的洗脱液，浓缩并静置析晶；
进一步地，步骤4）中，所述硅胶，粒度为200～300目。
进一步地，步骤4）中，洗脱剂为体积比17:3的正己烷-乙酸乙酯混合液。
5）将步骤4）析出的晶体，用甲醇洗涤、重结晶后，加入二氯甲烷-甲醇溶液至晶体完全溶解，通过0.45 μm滤膜后滴加到Sephadex LH-20凝胶柱中，以流速为0.5～1 ml·min-1的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液并采用薄层色谱法鉴别，合并鉴别结果一致的洗脱液，浓缩并静置析晶，得四种基源郁金共有药效成分。
进一步地，步骤5）中，所述二氯甲烷-甲醇溶液优选体积比1:1。
进一步地，步骤5）中，所述滴加优选采用2 mL的针管。
进一步地，所述步骤4）、5）中薄层色谱法鉴别，展开与显色条件同2015版《中国药典》一部郁金项下薄层鉴别条件。
进一步地，所述的四种基源郁金为温郁金、桂郁金、绿丝郁金和黄丝郁金。
进一步地，所述的共有药效成分核磁共振分析为β-谷甾醇。
所述四种基源郁金共有药效成分，核磁共振分析与β-谷甾醇的1H-NMR与13C-NMR数据一致；所述β-谷甾醇结构式如下，为四种郁金属植物中首次分离鉴定的共有化合物。
本发明通过试验研究建立了一种四种基源郁金共有药效成分的提取方法，实现了对郁金药效成分的定性分析，确保药效成分的稳定性，并有利于生产过程的质量控制。本发明采用核磁共振对四种基源郁金共有药效成分的进行结构鉴定，并采用薄层色谱法验证结果，与郁金质量之间存在高度相关性，能够准确表达郁金的质量和疗效。
附图说明
图 1 为实施例1四种基源郁金共有药效成分薄层色谱图，图中1-温郁金对照药材、2-步骤5）浓缩液；
图 2 为实施例2四种基源郁金共有药效成分薄层色谱图（a图为日光下检视，b图为365nm紫外下检视），图中1-β-谷甾醇、2-温郁金、3-桂郁金、4-绿丝郁金、5-黄丝郁金；
图3 为对比例1硅胶柱的分离结果薄层色谱图（365 nm），图中1-郁金对照药材、2-柱层析后的浓缩液；
图4为四种基源郁金共有药效成分初步确定的薄层色谱图（a图为日光下检视，b图为365nm紫外下检视），图中1-温郁金、2-黄丝郁金、3-绿丝郁金、4-桂郁金、5-对照药材；
图5为四种基源郁金共有药效成分的富集部位的确定薄层色谱图（日光），图中1-温郁金、2-石油醚层、3-氯仿层、4-乙酸乙酯层、5-正丁醇饱和水溶液层；
图6 为四种基源郁金共有药效成分的1H-NMR图；
图7为四种基源郁金共有药效成分的1H-NMR图（部分放大）；
图8 为四种基源郁金共有药效成分的13C-NMR图；
图9为四种基源郁金共有药效成分的13C-NMR图（部分放大）；
图10 为以β-谷甾醇为对照品的四种不同基源郁金薄层色谱图（a图为日光下检视，b图为365nm紫外下检视），图中1-对照药材、2-温郁金、3-桂郁金、4-黄丝郁金、5-绿丝郁金、6-β谷甾醇。
具体实施方式
下面通过实施例进一步的描述本发明技术方案。这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。凡对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1
一种四种基源郁金共有药效成分的提取方法，原料为温郁金分别按照下述步骤提取共有药效成分：
1）取500g郁金饮片，磨粉，过40目筛，加入乙醇（95%，V/V）5000 mL中，水浴加热回流1h，趁热过滤，滤渣再次加入乙醇（95%，V/V）5000 mL中，水浴加热回流1h，趁热过滤，合并两次过滤滤液，滤液旋蒸浓缩至无醇味，按体积比1:10加入蒸馏水，混匀，配制为均一溶液；
2）向步骤1）溶液中加入正丁醇饱和水溶液（现用现配）萃取，重复萃取至萃取液无色正丁醇饱和水溶液，合并萃取液，旋蒸浓缩为膏体；
3）将步骤2）膏体在70～80℃水浴蒸干，然后加入无水乙醇溶解，之后加入2倍质量的100～200目硅胶，混合均匀，再水浴蒸干，研磨至无结块为止，得到样品混合物；
4）取步骤3）取样品混合物10倍质量的200～300目硅胶，按4～6 g/mL加入洗脱剂（体积比为 17:3的正己烷-乙酸乙酯混合液），搅拌至无气泡，装入层析柱中，装实后在层析柱顶端保留有3～4cm高的洗脱剂，将步骤3）中样品混合物加入层析柱顶端，用洗脱剂（体积比为 17:3的正己烷-乙酸乙酯混合液）洗脱并控制洗脱速度为3-4mL/min，收集洗脱液并进行薄层色谱法鉴别，合并鉴别结果一致的洗脱液，浓缩并静置析晶；
5）将步骤4）析出的晶体，加入少量甲醇洗涤晶体、重结晶后，加入二氯甲烷-甲醇（体积比1:1）溶液至晶体完全溶解，然后用2 mL的针管通过0.45 μm滤膜滴入Sephadex LH-20凝胶柱中，以二氯甲烷-甲醇 （体积比1:1）为洗脱剂、流速控制为0.5～1 ml·min-1进行洗脱，收集洗脱液，采用薄层色谱法鉴别，合并鉴别结果一致的洗脱液，浓缩（浓缩液）并静置析晶，得四种基源郁金共有药效成分。
步骤4）、5）中薄层色谱法鉴别，展开与显色条件同2015版《中国药典》一部郁金项下薄层鉴别条件。
实施例1从温郁金中提取的共有成分（步骤5）浓缩液）采用薄层色谱法分析，发现浓缩后杂质消失，得到较为纯的斑点，结果如图1。
实施例2
原料分别替换为桂郁金、绿丝郁金、黄丝郁金，共有药效成分的提取方法步骤同实施例1。
将实施例2，分别从桂郁金 、黄丝郁金 、绿丝郁金中提取的共有成分（步骤5）浓缩液），与实施例1温郁金中提取的共有成分（步骤5）浓缩液）以及β-谷甾醇，采用薄层色谱法分析，结果如图2。可见四种原料中提取的共有成分，浓缩后杂质很少,，得到较为纯的斑点，且与β-谷甾醇一致。
对比例1
同实施例1的步骤1）～4），步骤4）过硅胶柱液体浓缩后与对照药材进行薄层鉴别（原料为温郁金），对比发现经硅胶柱层析后除共有成分外，还明显存有其他杂质，结果见图3。
由图3可见，发现经硅胶柱色谱分离后仍不纯，故还需继续分离杂质。
一、四种基源郁金共有药效成分的初步确定
按照2015版《中国药典》“郁金”下“鉴别”项，对四种不同来源的郁金饮片进行薄层鉴别，发现四种郁金在相同位置存在相同的薄层斑点。结果见图4。
二、四种基源郁金共有药效成分所在部位的确定
取温郁金粉末5 g，加入95%乙醇100.0 ml，加热回流1小时，运用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，加入适量蒸馏水。依次加入：石油醚，氯仿，乙酸乙酯以及正丁醇饱和水溶液（现用现配），各萃取三次（30.0 ml，20.0 ml，20.0 ml），合并各极性部位萃取液。取每部分萃取液，用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩后分别加入适量氯仿（石油醚层）、乙酸乙酯（氯仿层）、乙酸乙酯（乙酸乙酯层）以及甲醇（水饱和正丁醇层）溶解，转移至2 ml容量瓶中，进行薄层鉴别，点样量分别为：3 μl，12 μl，3 μl，4 μl，6 μl，6 μl。展开与显色条件按2015版《中国药典》郁金项下薄层条件。结果见图5。
由图5可以看到，共有成分在石油醚层、氯仿层以及乙酸乙酯层均有不同程度的杂质干扰，而水饱和正丁醇层则较为纯净，测得水饱和正丁醇层对应斑点Rf=0.27，由此确定了水饱和正丁醇层为该共有成分的主要富集部位。
三、四种基源郁金共有药效成分鉴定
对四种基源郁金按照实施例1方法所得晶体进行核磁共振分析，结果见图6～9。
将该晶体的1H-NMR与13C-NMR数据与文献中β-谷甾醇的数据比较基本一致，故将该晶体结构定为β-谷甾醇，为四种郁金中首次分离鉴定的共有化合物。
四、以β-谷甾醇为对照品的TLC鉴别
对β-谷甾醇、温郁金对照药材及按2015版《中国药典》法所制四种不同基源郁金饮片提取液进行薄层鉴别，按《药典》所记展开和显色条件进行展开和显色。结果见图10
β-谷甾醇醇具有一定的降血脂、抗炎作用、抗菌作用、抗肿瘤、镇痛等作用，而温郁金、桂郁金、绿丝郁金、黄丝郁金均有降血脂、抗炎、抗肿瘤、保肝、镇痛等药理作用的相关报道。结合郁金的功效与主治病症，认为β-谷甾醇应是郁金发挥活血止痛、利胆退黄功效的物质基础之一，进一步验证了β-谷甾醇是温郁金、桂郁金、绿丝郁金、黄丝郁金的共有药效成分，本发明提供的四种基源郁金共有药效成分的提取方法，方法简单，纯度高、稳定性、重复性好，有利于对郁金产品质量进行控制。
Claims (9)
1.一种四种基源郁金共有药效成分的提取方法，其特征在于，步骤包括：
1）取郁金饮片，磨粉，过20~40目筛，按照0.05～0.15g/mL的浓度加入95%乙醇，水浴加热回流1h，趁热过滤，滤渣再次加入95%乙醇，重复前述操作，合并两次过滤滤液，滤液旋蒸浓缩至无醇味，按体积比1:10加入蒸馏水，混匀，配制为均一溶液；
2）向步骤1）溶液中加入0.25～0.34倍体积的水饱和正丁醇溶液萃取，重复萃取至萃取液无色，合并萃取液，旋蒸浓缩为膏体；所述正丁醇溶液为现用现配；
3）将步骤2）膏体在70～80℃水浴蒸干，然后加入无水乙醇溶解，之后加入2倍质量的硅胶，混合均匀，再水浴蒸干，研磨至无结块，得到样品混合物；
4）称取硅胶，所述硅胶的质量为步骤3）制备的样品混合物质量的10倍，按 4～6g/mL加入洗脱剂，搅拌至无气泡，装入层析柱中，装实后在层析柱顶端保留有3～4cm高的洗脱剂，然后将步骤3）样品混合物加入到层析柱顶端，用洗脱剂洗脱并控制洗脱速度为3-4 mL/min，收集洗脱液并进行薄层色谱法鉴别，合并鉴别结果一致的洗脱液，浓缩并静置析晶；
5）将步骤4）析出的晶体，用甲醇洗涤、重结晶后，加入二氯甲烷-甲醇溶液至晶体完全溶解，通过0.45 μm滤膜后滴加到Sephadex LH-20凝胶柱中，以流速为0.5～1 ml·min-1的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液并采用薄层色谱法鉴别，合并鉴别结果一致的洗脱液，浓缩并静置析晶，得四种基源郁金共有药效成分。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤1）中，按照0.1 g/mL的浓度加入95%乙醇。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤3）中所述硅胶粒度为100～200目。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤4）中所述硅胶粒度为200～300目；洗脱剂为体积比17:3的正己烷-乙酸乙酯混合液。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤5）中，所述二氯甲烷-甲醇溶液体积比1:1；所述滴加采用2 mL的针管。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤4）、5）中薄层色谱法鉴别，展开与显色条件同2015版《中国药典》一部郁金项下薄层鉴别条件。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述的四种基源郁金为温郁金、桂郁金、绿丝郁金和黄丝郁金。
8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述的共有药效成分核磁共振分析为β-谷甾醇。
9.根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于：所述β-谷甾醇结构式如下，
。
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