CN102048714A

CN102048714A - 苯二酚类化合物在制备抗补体药物中的用途

Info

Publication number: CN102048714A
Application number: CN2009101979193A
Authority: CN
Inventors: 陈道峰; 金家宏
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2009-10-29
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2011-05-11

Abstract

本发明属中药制药领域，涉及式1的苯二酚类化合物的药物新用途。本发明从姜科豆蔻属植物草果(Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)果实中提取活性物质苯二酚类化合物并通过体外抗补体活性评价试验证实其对补体系统的经典途径和旁路途径具有显著的抑制作用。所述化合物对补体系统的经典途径抑制作用CH₅₀为61±12μg/ml～91±19μg/ml，对旁路途径抑制作用的AP₅₀为58±17μg/ml～121±18μg/ml。本发明的苯二酚类化合物可制备抗补体药物。

Description

苯二酚类化合物在制备抗补体药物中的用途

技术领域

本发明属中药制药领域，涉及草果中的苯二酚类化合物在制备抗补体药物中的新用途。

背景技术

补体系统的过度激活会引发系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病。抗补体药物研究多年来一直是世界药学研究的热点和重点。目前对此类疾病尚无理想的治疗药物，因此临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。直接从天然产物中研究开发补体抑制剂的成本低，并且大多数活性成分作为天然产物的一部分可以直接被机体消化吸收，因此近年来从天然来源中寻找新的具有抗补体活性的药物受到人们越来越多的关注。国内外的学者从包括海洋生物在内的天然产物中分离得到一些的具有补体系统抑制作用的单体化合物，为抗补体药物的研究与开发提供了广阔的前景。姜科(Zingiberaceae)豆蔻属(Amomum)植物作为日常生活中必备的香料植物，也是我国传统的中药材。本属植物化学成分复杂，主要含有挥发油、黄酮、苯酚衍生物等成分，其中挥发油类化合物作为主要成分具有燥湿散寒、除痰截疟、消食化积功效，黄酮类化合物具有抗氧化作用。

草果为豆蔻属(Amomum)植物草果(Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)的干燥成熟果实，性温、味辛，入脾胃两经，具有燥湿散寒、除痰截疟、消食化积功效，在临床上可单独使用或与其他中药合用用于治疗咽喉肿痛、肝炎、肝脓肿等疾病。近年来对草果的研究仅集中在化学成分的分离及结构鉴定上，从中分离得到了一些黄酮类、苯酚类化合物，但是迄今为止尚未见对补体系统具有抑制作用的化合物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供具有抗补体活性的物质，具体涉及草果中的苯二酚类化合物在制备抗补体药物中的新用途。特别涉及其中的化合物邻苯二酚(1)、对苯二酚(2)、3-甲氧基-邻苯二酚(3)、2-甲氧基-间苯二酚(4)、2-甲氧基-对苯二酚(5)在制备抗补体药物中的用途。

本发明应用现代药理筛选方法，对植物药中抗补体活性物质进行研究，从姜科豆蔻属(Amomum)植物草果(Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)果实中分离得到苯二酚类活性物质并经实验证实，其对补体系统的经典途径和旁路途径均有较强的抑制作用。

本发明的活性苯二酚类化合物具有式I的化学结构：

上述的苯二酚类化合物，当R₁＝R₂＝OH，R₃＝R₄＝H时，化合物为邻苯二酚(1)；当R₁＝R₄＝OH，R₂＝R₃＝H时，化合物为对苯二酚(2)，当R₁＝R₂＝OH，R₃＝OCH₃，R₄＝H时，化合物为3-甲氧基-邻苯二酚(3)，当R₁＝R₃＝OH，R₂＝OCH₃，R₄＝H时，化合物为2-甲氧基-间苯二酚(4)，当R₁＝R₄＝OH，R₂＝OCH₃，R₃＝H时，化合物为2-甲氧基-对苯二酚(5)。

本发明所述的苯二酚类化合物通过下述方法制备：

取草果干燥成熟果实15kg，用乙醇室温冷浸50L×10次，合并提取液浓缩至无醇味，提取液加水稀释至2L，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取各2L×3次，合并正丁醇萃取液浓缩至干即得正丁醇萃取物86.2g。正丁醇部位经AB-8型大孔吸附树脂处理后，50％乙醇洗脱部位干法上样进行硅胶柱色谱，以石油醚(60～90℃)、石油醚(60～90℃)-丙酮、丙酮梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱，分离得到化合物邻苯二酚(1)、对苯二酚(2)、3-甲氧基-邻苯二酚(3)、2-甲氧基-间苯二酚(4)、2-甲氧基-对苯二酚(5)。

其中，邻苯二酚(1)：白色无定形粉末，¹H-NMR(400MHz，CD₃ COCD₃，ppm)：δ7.78(2H，dd，7.8，1.9Hz，H-3，6)，6.82(2H，dd，7.8，1.9Hz，H-2，5)。

其中，对苯二酚(2)：白色针状晶体，¹H-NMR(400MHz，CDCl₃，ppm)：δ6.65(4H，s，H-2，3，5，6)，3.34(2H，brs，2×OH)。

其中，3-甲氧基-邻苯二酚(3)：白色无定形粉末，¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆，ppm)：δ7.58(1H，dd，8，2Hz，H-6)，δ7.57(1H，d，8Hz，H-5)，6.91(1H，dd，8，2Hz，H-4)。

其中，2-甲氧基-间苯二酚(4)：白色无定形粉末，¹H-NMR (500MHz，CD₃COCD₃，ppm)：δ7.58(2H，d，8Hz，H-2，4)，6.91(1H，d，8Hz，H-3)。

其中，2-甲氧基-对苯二酚(5)：白色无定形粉末，¹H-NMR(400MHz，Acetone-d₆，ppm)：δ7.59(1H，dd，8，2Hz，H-5)，7.56(1H，d，2Hz，H-3)，6.80(1H，d，8Hz，H-6)，3.88(3H，s，-OCH₃)。

上述苯二酚类化合物经体外经典途径和旁路抗补体活性评价试验，结果证实，所述化合物对补体系统的经典途径和旁路途径均有显著抑制作用(表1)。其中，邻苯二酚(1)和对苯二酚(2)对补体系统的经典途径有最强的抑制作用，50％溶血所需供试品浓度(CH₅₀)分别为64±15μg/ml和61±12μg/ml，与阳性对照肝素作用强度相当；邻苯二酚(1)、对苯二酚(2)、3-甲氧基-邻苯二酚(3)、2-甲氧基-间苯二酚(4)对补体系统的旁路途径有很强的抑制作用，50％溶血所需供试品浓度(AP₅₀)分别为63±16μg/ml、58±17μg/ml、75±14μg/ml、81±20μg/ml，较阳性对照肝素作用更强，2-甲氧基-对苯二酚(5)AP₅₀为121±18μg/ml，与肝素作用相当。本发明的苯二酚类化合物可制备抗补体药物。

表1是化合物1～5对补体系统经典途径和旁路途径抑制作用的数据

表1

附图说明：

图1是化合物1～5的提取分离流程图。

具体实施方式

实施例1 制备正丁醇萃取物，得苯二酚类化合物

取草果干燥成熟果实15kg，用乙醇室温冷浸50L×10次，合并提取液浓缩至无醇味，提取液加水稀释至2L，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取各2L×3次，合并正丁醇萃取液浓缩至干即得正丁醇萃取物86.2g。正丁醇部位经AB-8型大孔吸附树脂处理，50％乙醇洗脱部位(21.3g)进行硅胶柱色谱，以石油醚(60～90℃)、石油醚-丙酮、丙酮梯度洗脱，具体步骤如下：

1、石油醚-丙酮(3∶1)洗脱所得流份，氯仿-丙酮(5∶1)进行反复硅胶柱色谱，得到化合物(1)(10mg)、(3)(9mg)、(4)(12mg)。采用波谱学方法分析，其结构分别确定为邻苯二酚、3-甲氧基-邻苯二酚和2-甲氧基-间苯二酚。

2、石油醚-丙酮(2∶1)洗脱所得流份，氯仿-甲醇(15∶1)进行反复硅胶柱色谱，得到化合物(2)(7mg)、化合物(5)(15mg)。采用波谱学方法分析，其结构确定为对苯二酚、2-甲氧基-对苯二酚。

实施例2 体外抗补体经典途径试验

取补体(豚鼠血清)0.1ml，加入BBS配制成1∶5溶液，用BBS对倍稀释成1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320和1∶640溶液。取1∶1000溶血素、各浓度补体及2％SRBC各0.1ml溶于0.3ml BBS中，混匀，37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min。分别取每管上清液0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.1ml 2％ SRBC溶于0.5ml三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。取临界浓度的补体与供试品混匀，于37℃预水浴10min后，加入适量BBS、溶血素和2％ SRBC。将每管37℃水浴30min后放入低温高速离心机，5000rpm、4℃条件下离心10min后分别取每管上清液0.2ml于96孔板，405nm下测定吸光度。实验同时设置化合物对照组、补体组和全溶血组。将化合物组吸光度值扣除相应化合物对照组吸光度值后计算溶血率。以化合物浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图。计算CH₅₀值。

实施例3 体外抗补体旁路途径试验

取补体(人血清)0.2ml，加入AP稀释液配制成1∶5稀释溶液，并对倍稀释成1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320和1∶640溶液。取各浓度补体0.15ml、AP稀释液0.15ml及0.5％ RE 0.20ml，混匀，37℃水浴30min后放置入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.20ml 0.5％ RE溶于0.3ml三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。取确定的临界浓度的补体与供试品混匀，于37℃预水浴10min后，按照表1-2加入适量0.5％ RE。将每管37℃水浴30min后放置入低温高速离心机，5000rpm、4℃，离心10min后分别取每管上清液0.2ml于96孔板，405nm下测定吸光度。实验同时设置化合物对照组、补体组和全溶血组。将化合物组吸光度值扣除相应化合物对照组吸光度值后计算溶血率。以化合物浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图。计算AP₅₀值。

本发明实验采用的试剂均为本领域公知技术，可市购。

Claims

1.式I的苯二酚类化合物在制备抗补体药物中的用途，

其中，当R₁＝R₂＝OH，R₃＝R₄＝H时，化合物为邻苯二酚(1)；

当R₁＝R₄＝OH，R₂＝R₃＝H时，化合物为对苯二酚(2)；

当R₁＝R₂＝OH，R₃＝OCH₃，R₄＝H时，化合物为3-甲氧基-邻苯二酚(3)；

当R₁＝R₃＝OH，R₂＝OCH₃，R₄＝H时，化合物为2-甲氧基-间苯二酚(4)；

当R₁＝R₄＝OH，R₂＝OCH₃，R₃＝H时，化合物为2-甲氧基-对苯二酚(5)。

2.按权利要求1所述的用途，其中所述的苯二酚类化合物通过下述步骤制备：

①取草果果实粗粉，用50％乙醇室温冷浸，合并提取液浓缩至无醇味，提取液加水稀释，正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液浓缩至干即得正丁醇部位；

②正丁醇部位经AB-8型大孔吸附树脂处理，50％乙醇洗脱部位干法上样进行硅胶柱色谱，以石油醚(60～90℃)、石油醚-丙酮、丙酮梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱，分离得到所述的化合物。