CN103508922B - 二肽类化合物及其在制备抗补体药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属中药制药领域，涉及式I二肽类化合物及其在制备抗补体药物中的新用途。本发明从堇菜科植物紫花地丁(Viola yedoensis Makino)的干燥全草乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位分离得到二肽类化合物并证实其对补体系统经典途径和旁路途径均有抑制作用，其中对补体系统经典途径的抑制作用(CH50)为0.21-0.23mg/ml，对旁路途径的抑制作用(AP50)为0.33-0.41mg/ml。本发明的二肽类化合物可作为药物活性成分制备抗补体药物，可进一步治疗因补体系统的过度激活引发的系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病。
Description
技术领域
本发明属中药制药领域，涉及紫花地丁中二肽类化合物及其在制备抗补体药物中的新用途。
背景技术
现有技术公开了补体系统的过度激活会引发系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种重大疾病。多年来抗补体药物的研究一直是世界药学研究的热点和重点。然而，迄今为止，临床治疗中对系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病尚缺乏较为理想的治疗药物，因此临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。从天然产物中研究开发补体抑制剂是近年来一个受到越来越多关注的重要研究领域，其具有成本低、毒性低等特点。国内外学者已从包括海洋生物在内的多种天然产物中分离得到多种具有补体系统抑制作用的单体化合物，为抗补体药物的研究与开发提供了广阔的前景。
中药紫花地丁为堇菜科植物紫花地丁(Viola yedoensis Makino)的干燥全草。其性苦、辛、寒；归心、肝经；具有清热解毒，凉血消肿的功效；用于黄疸内热、疔疮肿毒、喉痹肿痛等的治疗。现有技术对紫花地丁的药理研究仅集中在抗病毒和抗菌等方面，有关其化学成分研究中发现了一些黄酮类、香豆素和环肽化合物，但迄今为止尚未见从中药紫花地丁中公开具有补体抑制作用的化合物的报道。
发明内容
本发明的目的是提供新的具有抗补体活性的物质，具体涉及紫花地丁中的二肽类化合物，其包括化合物金色酰胺醇(aurantiamide,1)和金色酰胺醇酯(aurantiamide acetate,2)。
本发明的进一步目的是提供上述紫花地丁中二肽类化合物在制备抗补体药物中的用途。
本发明应用现代药理筛选方法，对分离得到的单体化合物进行抗补体活性评价研究。从紫花地丁(Viola yedoensis)的干燥全草乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位中分离得到活性二肽类化合物并证实其对补体系统经典途径和旁路途径均有抑制作用。
本发明的活性二肽类化合物具有式I的化学结构：
上述二肽类化合物，当R=H，化合物为金色酰胺醇(1)；当R=COCH3，化合物为金色酰胺醇酯(2)。
本发明所述的二肽类化合物通过下述方法制备：
取干燥的紫花地丁全草，粉碎，用95%乙醇室温冷浸，提取液浓缩至无醇味，浸膏加水稀释，依次以等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯萃取液并浓缩至干，即得乙酸乙酯萃取物；乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次以石油醚-丙酮（石油醚,50:1,30:1,20:1,10:1,5:1,1:1）梯度洗脱，得到7个流份（Fr1-7），其中流份Fr.4再经硅胶柱色谱（石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，30:1,20:1,15:1,10:1,5:1）和Sephadex LH-20（氯仿-甲醇，1:1）纯化，分离得到式I的化合物金色酰胺醇(aurantiamide,1)和金色酰胺醇酯(aurantiamide acetate,2)。
经鉴定，本发明的化合物1金色酰胺醇(aurantiamide)：白色粉末，分子式：C25H26N2O3；分子量：402；1H-NMR(400MHz,acetone-d6)δ:8.56(1H,d,J=8.5Hz,H-6),7.97(1H,d,J=8.5Hz,H-3),7.80(2H,t,J=7.0Hz,H-2',6'),7.51(1H,t,J=7.0Hz,H-4′),7.44(2H,t,J=7.5Hz,H-3′,5'),7.31(2H,d,J=7.0Hz,H-2″,6'″),7.24(2H,m,H-3″,5″),7.21(2H,m,H-2'″,6′″),7.16(2H,m,H-3′″,5′″),7.14(1H,m,H-4″),7.12(1H,m,H-4′″),4.68(1H,m,H-5),3.90(1H,m,H-2),3.30(1H,m,H-1),3.29(1H,d,J=6.0Hz,H-1),3.03(1H,dd,J=13.5,4.5Hz,H-8a),2.95(1H,dd,J=13.5,4.5Hz,H-8b),2.86(1H,dd,J=13.5,6.0Hz,H-9a),2.67(1H,dd,J=13.5,8.0Hz,H-9b);13C-NMR(100MHz,acetone-d6)δ:170.9(C-4),166.1(C-7),139.0(C-1′″),138.3(C-1″),134.1(C-1'),131.2(C-4'),129.1(C-2″,6″,2′″,6′″),128.1(C-3',5'),128.0(C-3″,5″,3′″,5′″),127.3(C-2',6'),126.1(C-4″),125.8(C-4′″),62.2(C-1),54.8(C-5),52.5(C-2),37.2(C-8),36.6(C-9)。
化合物2金色酰胺醇酯(aurantiamide acetate)：白色无定性粉末；分子式：C27H28N2O4；分子量：444；1H-NMR(400MHz,acetone-d6)δ:7.44-7.74(5H,m,H-2'-6'),7.24-7.29(5H,m,H-2″-6″),7.07-7.17(5H,m,H-2′″-6′″),6.76(1H,d,J=7.5Hz,H-8),6.09(1H,d,J=8.0Hz,H-5),4.79(1H,m,H-7),4.38(1H,m,H-4),3.97(1H,dd,J=11.4,4.0Hz,H-3a),3.84(1H,dd,J=11.4,4.0Hz,H-3b),3.26(1H,dd,J=13.5,5.8Hz,H-10a),3.09(1H,dd,J=13.5,5.8Hz,H-10b),2.78(1H,dd,J=13.8,7.0Hz,H-11a),2.74(1H,dd,J=13.8,7.0Hz,H-11b),2.06(3H,s,H-1);13C-NMR(100MHz,acetone-d6)δ:170.7(C-2),170.2(C-6),167.1(C-9),136.7(C-1″),136.6(C-1′″),133.7(C-1'),131.9(C-4'),129.3(C-3″,5″),129.1(C-3′″,5′″),128.8(C-2″,6″),128.7(C-4″),128.6(C-2',6'),127.1(2′″,6′″),127.0(C-3',5'),125.8(C-4′″),64.6(C-3),55.0(C-7),49.5(C-4),38.4(C-10),37.5(C-11),20.7(C-1)。
本发明的二肽类化合物进行了体外抗补体活性试验，通过经典途径和旁路途径体外抗补体活性试验测定，结果表明，所述的二肽类化合物对补体系统的经典途径和旁路途径均有抑制作用，所述化合物对补体系统经典途径的抑制作用(CH50)为0.21-0.23mg/ml，对旁路途径的抑制作用(AP50)为0.33-0.41mg/ml(如表1所示)。
表1.化合物1-2对补体系统经典途径和旁路途径的抑制作用(Mean±SD,n=3)。
表1
本发明的二肽类化合物可作为药物活性成分制备抗补体药物，可进一步治疗因补体系统的过度激活引发的系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病。
附图说明
图1.紫花地丁乙酸乙酯萃取部位二肽化合物1-2的提取分离流程图。
具体实施方式
实施例1.制备二肽类化合物
取干燥的紫花地丁全草20kg，粉碎，用95%乙醇室温冷浸（50L×5次），合并提取液并浓缩至无醇味，浸膏加水稀释至2.5L，依次以等体积石油醚（60-90°C）、乙酸乙酯、正丁醇萃取（各2.5L×3次），合并乙酸乙酯萃取液并浓缩至干，即得乙酸乙酯萃取物180g。乙酸乙酯萃取部位经硅胶（200-300目）柱色谱分离，依次以石油醚-丙酮（石油醚,50:1,30:1,20:1,10:1,5:1,1:1）梯度洗脱，得到7个流份（Fr1-7），其中流份Fr.4（21.5g）再经硅胶柱色谱（石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂,30:1,20:1,15:1,10:1,5:1）和Sephadex LH-20（氯仿-甲醇,1:1）反复纯化，分离得到2个化合物，分别鉴定为金色酰胺醇(aurantiamide,1)和金色酰胺醇酯(aurantiamide acetate,2)。
化合物1金色酰胺醇(aurantiamide)：白色粉末，分子式：C25H26N2O3；分子量：402；1H-NMR(400MHz,acetone-d6)δ:8.56(1H,d,J=8.5Hz,H-6),7.97(1H,d,J=8.5Hz,H-3),7.80(2H,t,J=7.0Hz,H-2',6'),7.51(1H,t,J=7.0Hz,H-4'),7.44(2H,t,J=7.5Hz,H-3',5'),7.31(2H,d,J=7.0Hz,H-2″,6'″),7.24(2H,m,H-3″,5″),7.21(2H,m,H-2′″',6′″),7.16(2H,m,H-3'″,5′″),7.14(1H,m,H-4″),7.12(1H,m,H-4′″),4.68(1H,m,H-5),3.90(1H,m,H-2),3.30(1H,m,H-1),3.29(1H,d,J=6.0Hz,H-1),3.03(1H,dd,J=13.5,4.5Hz,H-8a),2.95(1H,dd,J=13.5,4.5Hz,H-8b),2.86(1H,dd,J=13.5,6.0Hz,H-9a),2.67(1H,dd,J=13.5,8.0Hz,H-9b);13C-NMR(100MHz,acetone-d6)δ:170.9(C-4),166.1(C-7),139.0(C-1′″),138.3(C-1″),134.1(C-1'),131.2(C-4'),129.1(C-2″,6″,2′″,6′″),128.1(C-3',5'),128.0(C-3″,5″,3′″,5′″),127.3(C-2',6'),126.1(C-4'″),125.8(C-4′″),62.2(C-1),54.8(C-5),52.5(C-2),37.2(C-8),36.6(C-9)。
化合物2金色酰胺醇酯(aurantiamide acetate)：白色无定性粉末；分子式：C27H28N2O4；分子量：444；1H-NMR(400MHz,acetone-d6)δ:7.44-7.74(5H,m,H-2'-6′),7.24-7.29(5H,m,H-2″-6″),7.07-7.17(5H,m,H-2′″-6′″),6.76(1H,d,J=7.5Hz,H-8),6.09(1H,d,J=8.0Hz,H-5),4.79(1H,m,H-7),4.38(1H,m,H-4),3.97(1H,dd,J=11.4,4.0Hz,H-3a),3.84(1H,dd,J=11.4,4.0Hz,H-3b),3.26(1H,dd,J=13.5,5.8Hz,H-10a),3.09(1H,dd,J=13.5,5.8Hz,H-10b),2.78(1H,dd,J=13.8,7.0Hz,H-11a),2.74(1H,dd,J=13.8,7.0Hz,H-11b),2.06(3H,s,H-1);13C-NMR(100MHz,acetone-d6)δ:170.7(C-2),170.2(C-6),167.1(C-9),136.7(C-1″),136.6(C-1′″),133.7(C-1'),131.9(C-4′),129.3(C-3″,5″),129.1(C-3′″,5′″),128.8(C-2″,6'″),128.7(C-4″),128.6(C-2',6'),127.1(2′″,6′″),127.0(C-3',5'),125.8(C-4′″),64.6(C-3),55.0(C-7),49.5(C-4),38.4(C-10),37.5(C-11),20.7(C-1)。
实施例2.体外抗补体经典途径试验
取补体（豚鼠血清）0.1ml，加入巴比妥缓冲液(BBS)配制成1:5的溶液，用BBS对倍稀释成1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640的溶液。取1:1000溶血素、各浓度补体及2%羊红细胞（SRBC）各0.1ml溶于0.3ml BBS中，混匀，37°C水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4°C条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定其吸光度。实验同时设置全溶血组（0.1ml 2% SRBC溶于0.5ml三蒸水）。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。取临界浓度的补体与供试品混匀，于37°C预水浴10min后，加入适量BBS、溶血素和2% SRBC。将每管37°C水浴30min后放入低温高速离心机，5000rpm、4°C条件下离心10min后分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定吸光度。实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组。将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率。以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算50%抑制溶血所需供试品的浓度(CH50)。
实施例3.体外抗补体旁路途径试验
取补体（人血清）0.2ml，加入AP稀释(巴比妥缓冲液，pH=7.4,含5mM Mg2+,8mM EGTA)液配制成1:5的溶液，并对倍稀释成1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640的溶液。取各浓度补体0.15ml、AP稀释液0.15ml及0.5%兔红细胞（RE）0.20ml，混匀，37°C水浴30min后置于低温高速离心机，在5000rpm、4°C条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组（0.20ml 0.5%RE溶于0.3ml三蒸水）。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。取确定的临界浓度的补体与供试品混匀，于37°C预水浴10min后，加入0.2ml 0.5%RE。将每管37°C水浴30min后置于低温高速离心机，5000rpm、4°C条件下离心10min后，分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定其吸光度。实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组。将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率。以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算50%抑制溶血所需供试品的浓度(AP50)。
本发明中实验采用的试剂均为本领域公知技术，可市购。
表1.化合物1-2对补体系统经典途径和旁路途径的抑制作用(Mean±SD,n=3)
Claims (4)
1.式I结构的活性二肽类化合物在制备抗补体药物中的用途：
其中，当R＝H，化合物为金色酰胺醇(1)；
当R＝COCH3时化合物为金色酰胺醇酯(2)。
2.按权利要求1的用途，其特征在于，所述的抗补体药物是治疗因补体系统的过度激活引发的系统性红斑狼疮的药物。
3.按权利要求1的用途，其特征在于，所述的抗补体药物是治疗因补体系统的过度激活引发的类风湿性关节炎的药物。
4.按权利要求1的用途，其特征在于，所述的抗补体药物是治疗因补体系统的过度激活引发的急性呼吸窘迫综合征的药物。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20150617 Termination date: 20190625 |