CN105769838A

CN105769838A - 橙黄胡椒酰胺在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用

Info

Publication number: CN105769838A
Application number: CN201610164824.1A
Authority: CN
Inventors: 单磊; 乔志平
Original assignee: Guangdong Xtem Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Xtem Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-03-22
Filing date: 2016-03-22
Publication date: 2016-07-20

Abstract

本发明提供了橙黄胡椒酰胺在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用。所述橙黄胡椒酰胺的结构式如下：本发明将橙黄胡椒酰胺进行动物药效试验，结果显示橙黄胡椒酰胺明显抑制了CIA的发病严重程度和发病率。并能下调脾细胞上清液中TNF‑α(肿瘤坏死因子α)、IL‑17(白介素17)、IFN‑γ(干扰素γ)，抑制促炎细胞因子TNF‑α、IFN‑γ和IL‑17的分泌，从而对CIA疾病具有保护作用。因此，可用于制备治疗类风湿关节炎的药物。本发明所述为以橙黄胡椒酰胺作为活性成分与常规药用载体制成的药物组合物。包括片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等。有较大的临床应用价值。

Description

橙黄胡椒酰胺在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药，具体涉及橙黄胡椒酰胺在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。该病好发于手、腕、足等小关节，易反复发作，并呈对称性分布。患病早期有关节红肿热痛和功能障碍表现，到达晚期时，关节可出现不同程度的僵硬畸形，并伴有骨和骨骼肌的萎缩，极易致残。从病理改变的角度来看，类风湿性关节炎是一种主要累及关节滑膜(以后可波及到关节软骨、骨组织、关节韧带和肌键)，其次为浆膜、心、肺及眼等结缔组织的广泛性炎症性疾病。类风湿性关节炎的全身性表现除关节病变外，还有发热、疲乏无力、心包炎、皮下结节、胸膜炎、动脉炎、周围神经病变等。但是，类风湿性关节炎至今尚无特效疗法，仍处于对炎症及后遗症的治疗阶段。

胡椒，又名昧履支、披垒、坡洼热等，拉丁名：Piper nigrum L。胡椒目胡椒科胡椒属木质攀援藤本植物。茎、枝无毛，节显著膨大，常生小根。花杂性，通常雌雄同株；浆果球形，无柄，花期6～10月。生长在年降水量2500毫米的热带地区，印度尼西亚、印度、马来西亚、斯里兰卡以及巴西等是胡椒的主要产地。胡椒种子含有挥发油、胡椒碱、粗脂肪、粗蛋白等。

中医记载胡椒温中，下气，消痰，解毒。治寒痰食积，脘腹冷痛，反胃，呕吐清水，泄泻，冷痢。并解食物毒。《本草纲目》：“胡椒。大辛热，纯阳之物，肠胃寒湿者宜之。……暖肠胃，除寒湿反胃、虚胀冷积，阴毒，牙齿浮热痛。”

本发明人发现胡椒中的化学成分橙黄胡椒酰胺具有治疗类风湿性关节炎的良好活性，宜进一步研究开发新药。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究设计橙黄胡椒酰胺在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

本发明提供了橙黄胡椒酰胺在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用。

橙黄胡椒酰胺的结构式如下：

本发明所述橙黄胡椒酰胺是通过下列方法制备得到的：

将干燥的胡椒种子粉碎，用8倍量75％乙醇，以24，12小时冷浸提取2次，将所得粗提物加适量水稀释后，依次用石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取，将乙酸乙酯萃取物用200-300目的薄层硅胶分离，用二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，薄层色谱对照检测，收集其中含有橙黄胡椒酰胺的组分，然后用Sephadex LH-20进行分离，用二氯甲烷-甲醇进行洗脱，得到富集橙黄胡椒酰胺的组分，最后采用HPLC分离得到橙黄胡椒酰胺。

本发明将提取的橙黄胡椒酰胺进行动物药效试验，结果显示橙黄胡椒酰胺可抑制CIA(Collagen-Induced Arthritis，胶原诱导的关节炎)的临床发病，明显抑制CIA的发病严重程度和发病率。并能下调脾细胞上清液中TNF-α(肿瘤坏死因子α)、IL-17(白介素17)、IFN-γ(干扰素γ)，抑制促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17的分泌，从而对CIA疾病具有保护作用。TNF-α和IFN-γ在RA发病机制中起着重要作用。本发明实验结果表明，橙黄胡椒酰胺可较大程度降低体内TNF-α和IFN-γ水平。因此，橙黄胡椒酰胺可用于制备治疗类风湿关节炎的药物。

本发明所述橙黄胡椒酰胺在制备防治类风湿性关节炎的药物为由橙黄胡椒酰胺作为活性成分与常规药用载体制成的药物组合物。所述药物组合物可以是片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等。有较大的临床应用价值。

附图说明

图1橙黄胡椒酰胺临床评分图

图中模型组对照组橙黄胡椒酰胺1mg/kg橙黄胡椒酰胺5mg/kg橙黄胡椒酰胺10mg/kg

图2脾细胞上清细胞因子TNF-α检测结果图；柱1：空白组柱2：模型组柱3：甲氨喋呤组柱4：橙黄胡椒酰胺0.2mg/kg 柱5：橙黄胡椒酰胺1mg/kg 柱6：橙黄胡椒酰胺2mg/kg*P<0.05**P<0.01

图3脾细胞上清细胞因子IL-17检测结果图；柱1：空白组柱2：模型组柱3：甲氨喋呤组柱4：橙黄胡椒酰胺0.2mg/kg 柱5：橙黄胡椒酰胺1mg/kg 柱6：橙黄胡椒酰胺2mg/kg*P<0.05**P<0.01

图4脾细胞上清细胞因子IFN-γ检测结果图；柱1：空白组柱2：模型组柱3：甲氨喋呤组柱4：橙黄胡椒酰胺0.2mg/kg 柱5：橙黄胡椒酰胺1mg/kg 柱6：橙黄胡椒酰胺2mg/kg*P<0.05**P<0.01

具体实施方式

实施例1 橙黄胡椒酰胺的制备

实施例2 橙黄胡椒酰胺动物药效试验

一、实验材料

药物与试剂

橙黄胡椒酰胺：实施例1制得，以3‰的CMC-Na(羧甲基纤维素钠)溶液溶解成1mg/ml的溶液。给药时按照动物体重腹腔注射不同的体积。

鸡II型胶原(CⅡ)：Chondrex，Redmond，WA 98052，USA；

不完全弗氏完全佐剂(IFA)Difco Laboratories，Detroit，MI；

磷酸缓冲盐溶液(PBS)：由本实验室自行配制：在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄。用盐酸调PH至7.4，加水定容至1L，过滤除菌后使用；

DMSO二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)：为sigma公司产品；

1640培养基：吉诺生物医药技术有限公司；

小牛血清：赛默飞世尔公司(Thermo Fisher Scientific Inc.)；

96孔平底板，CORNING公司；70μm细胞研磨滤网，BD Falcon公司；15ml、50ml离心管，BD Falcon公司；0.22μm滤器，Millipore公司；1ml旋口注射器，BD公司；贝朗三通，德国贝朗公司；

甲氨喋呤片：上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂(080605)

动物

DBI/I型小鼠，雄性，6-8周，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2007-0005，饲养于第二军医大学实验动物中心清洁级环境中。

仪器与设备

高速台式离心机，Eppendorf；高速台式低温离心机，HITACHI公司；倒置显微镜，Nikon公司；超净台，苏净集团安泰公司制造；电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；湿度CO₂培养箱，Heraus公司；恒温水浴锅，上海国华电器有限公司。

二、实验方法

模型的建立

实验准备

完全弗氏佐剂(CFA)的制备：在不完全弗氏佐剂中加入热灭活的结核分支杆菌至终浓度4mg/ml，使用之前充分混匀。

0.01M冰乙酸制备：11.43μl冰乙酸溶于20ml去离子水中，过滤，4℃备用。

CⅡ制备：将CⅡ溶解于0.01M冰乙酸至终浓度4mg/ml，4℃保存。

抗原的乳化：用三通管连接两支玻璃针管，将PBS、完全弗氏佐剂和抗原CⅡ分别加入一支针管中(每100μl乳化液含200μg CⅡ和50μl完全弗氏佐剂)，排除针管内气泡后，来回推动针管约500次，将针管内各成分充分混匀成乳化状态。

CIA模型的诱导

第0天，小鼠尾根部2-3厘米处给予100μl/只乳化好的CⅡ抗原皮下注射免疫；第21天，加强免疫：50μl CⅡ和150μl PBS充分混匀，150ul/只腹腔注射；正常组用生理盐水同法注射。

三、实验分组和给药方案

小鼠随机分为6组，每组12只，分别为正常组、CIA模型组、阳性对照组(甲氨喋呤2mg/kg)；橙黄胡椒酰胺组分为高、中、低三个剂量组，其给药量分别为10mg/kg、5mg/kg、1mg/kg。于二次免疫前一天(第20天)至第34天橙黄胡椒酰胺组分别按10mg/kg、5mg/kg、1mg/kg连续灌胃给药，甲氨喋呤组每两天按2mg/kg给药，正常组和模型组按10ml/kg给予饮用水。

1、多发性关节炎指数(arthritis index，AI)评分

二次免疫后，定期记录小鼠全身关节病变情况，按3级评分法评价，计算发病率及平均发病指数。具体评分标准为：0分-关节正常；1分-关节轻微红肿；2分-关节红肿严重，累及整个关节，活动受限；3分-爪子或关节功能障碍，关节僵硬。四肢的总和为小鼠的评分，最高为12分。

2、淋巴及脾脏单个核细胞(MNC)悬液的制备

小鼠处死，固定，剪开腹部皮肤，取两侧腹股沟淋巴结；后打开腹腔，取出脾脏，立即放入装有1640的15ml离心管中，置于冰上；将脾脏倒入70μm的细胞研磨滤网中，用1ml注射器针芯充分研磨，使之成细胞悬液；收集细胞悬液，4℃，1000rpm，离心8min，离心后弃去上清；打散细胞，加入0.83％氯化铵水(约1.0ml/脾脏)，裂解5min；加入3倍体积的PBS终止裂解反应，并用玻璃吸管去除细胞悬液中的絮状物；4℃，1000rpm，离心8min，离心后弃去上清；打散细胞，加入1ml 1640(含小牛血清)，混匀后计数，以1640完全培养基(含小牛血清)在96孔板中培养，5×10⁶/ml每孔100ul，贴壁2小时。

3、脾细胞NO测定

在96孔平圆底板中每孔加入5×106/ml脾脏MNC100ul，每组4复孔；贴壁2小时后，换液DMEM培养基(市售，补充生产商，购自上海丽臣生物科技有限公司)，每孔加LPS(脂多糖)(终浓度1ug/ml)，将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养18小时后取出上清液检测NO。

4、脾、淋巴细胞增值测定

在96孔平圆底板中分别加入5×10⁶/ml脾脏及淋巴MNC100ul，每组4复孔；贴壁2小时后，加CⅡ(100ug/ml)，将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时后取出加MTS(四甲基偶氮唑盐)测增值。

5、脾细胞细胞因子测定

在96孔平圆底板中加入5×10⁶/ml脾脏MNC100ul，每组4复孔；贴壁2小时后，加CⅡ(100ug/ml)，将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时后取上清液检测细胞因子。

四、结果

1、橙黄胡椒酰胺可抑制CIA的临床发病

在此CIA(类风湿性关节炎)的实验中，用CⅡ诱导CIA模型，初次免疫为第0天，第21天加强免疫后小鼠随机分为6组：对照组和三组橙黄胡椒酰胺组。于第20天开始给，阳性对照组每两天给予甲氨喋呤药2mg/kg，橙黄胡椒酰胺高剂量组给予10mg/kg，中剂量组为5mg/kg，低剂量组为1mg/kg，连续给药14天，直到实验结束。每天观察小鼠并依据评分标准给每只小鼠评分。

CⅡ诱导CIA，加强免疫后小鼠陆续出现发病，对照组与用药组在发病时间上没有明显差异。发病后，模型组组小鼠疾病严重程度加重较快，在免疫后第37天达到高峰，而给药组小鼠发病后疾病发展较对照组小鼠缓和(图1)。从发病率来看，模型组为90％，对照组为73％，橙黄胡椒酰胺高、中、低三个剂量组分别为68％，70％和71％。由此可见，橙黄胡椒酰胺对CIA发病时间没有明显影响，但明显抑制了CIA的发病严重程度和发病率，说明橙黄胡椒酰胺对CIA具有明显的保护作用。

2、橙黄胡椒酰胺能下调脾细胞上清液中TNF-α、IL-17、IFN-γ

在体内给予药物治疗CIA的实验中，疾病达到平台期后处死小鼠，取出脾脏细胞，制成单细胞悬液，每孔1.5×10⁶个细胞铺板，在体外用20μg/ml的抗原CⅡ刺激，培养48小时后收集上清，用ELISA方法酶联免疫吸附试验法测量细胞因子TNF-α、IFN-γ的浓度。

如图2、3、4所示，CⅡ刺激后，模型组细胞上清中TNF-α、IFN-γ及IL-17均高于各个药物处理组，与阳性对照组及橙黄胡椒酰胺组相比，存在统计学差异(p<0.05)。说明体内给予药物治疗后，能够抑制促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17的分泌，并能从而对CIA疾病具有保护作用。

实施例3

制备方法：将橙黄胡椒酰胺、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重300mg，橙黄胡椒酰胺含量为25mg。

实施例4：

注射液：橙黄胡椒酰胺 5g

葡萄糖 50g

制备方法：将橙黄胡椒酰胺和葡萄糖溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入输液瓶中，每瓶含橙黄胡椒酰胺5mg。

实施例5：

注射用冻干粉针剂：橙黄胡椒酰胺 10g

甘露醇 30g

制备方法：将橙黄胡椒酰胺和甘露醇溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入西林瓶中，冻干，每支含橙黄胡椒酰胺10mg。

Claims

1.橙黄胡椒酰胺在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于，所述橙黄胡椒酰胺的结构式如下：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述橙黄胡椒酰胺通过下列方法制备得到：

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为由橙黄胡椒酰胺作为活性成分与药用载体制成的药物组合物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述药物组合物为片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述药物组合物的单剂量含橙黄胡椒酰胺为5mg-25mg。