CN101700249B - 一种防治类风湿关节炎的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治疗类风湿关节炎的药物组合物。其中制成活性成分的中药原料组成为下列重量配比：小檗碱5.5-6.0mg，巴马汀0.3-0.4mg，药根碱1.5-2.0mg，木兰花碱1.5-1.8mg，黄柏碱0.1-0.2mg，黄连碱0.2-0.3mg，黄芩苷55-60mg，黄芩素1.5-2.0mg，汉黄芩苷5.0-7.0mg，汉黄芩素0.03-0.05mg，栀子苷20-25mg，藏红花素0.1-0.2mg，绿原酸0.25-0.3mg。经药理学实验结果显示本发明所述药物组合物可明显减轻类风湿关节炎CIA小鼠的发病严重程度，病灶部位的炎症及免疫损伤情况与对照组相比有非常明显的改善，可用于制备防治疗类风湿关节炎药物。

Description

一种防治类风湿关节炎的药物组合物

技术领域

本发明涉及中药，具体涉及一种防治类风湿关节炎的药物组合物。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，甚至残废。它是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。常发于手、腕、足等小关节，易反复发作，呈对称分布。早期有关节红肿热痛和功能障碍，晚期关节可出现不同程度的僵硬畸形，并伴有骨和骨骼肌的萎缩，极易致残。从病理改变的角度来看，类风湿性关节炎是一种主要累及关节滑膜(以后可波及到关节软骨、骨组织、关节韧带和肌键)，其次为浆膜、心、肺及眼等结缔组织的广泛性炎症性疾病。类风湿性关节炎的全身性表现除关节病变外，还有发热、疲乏无力、心包炎、皮下结节、胸膜炎、动脉炎、周围神经病变等。目前，对于类风湿性关节炎的治疗的药物主要分两类：一类是非甾族抗炎药物(non-steroidalanti-inflammatory drugs，NSAIDs)；一类是病症缓解性抗风湿药(Disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs)。NSAIDs是治疗RA的首选药物，包括水杨酸类、传统非甾族抗炎药物及选择性环氧化酶-2(Cyclo-oxgenase-2，COX-2)抑制剂。病人出现症状的最初几个星期内用NSAIDs有非常好的疗效，但NSAIDs主要作用是缓解RA患者关节疼痛、肿胀及改善关节功能，难以阻止疾病的发展，也不能防止关节的破坏，另外对胃肠道的严重不良反应使其应用受到限制；DMARDs如甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)可快速并持久的抑制炎症，但由于毒性作用大，加之昂贵的价格限制了这些药物在RA中的应用。近年来研究者们从各个角度来寻找治疗契机，中草药以其低毒性、多靶点治疗及廉价的特点越来越受到重视，成为研发治疗RA药物的新热点。

目前RA的药物治疗除了化学治疗药物，近年来有多种生物类制剂在临床上用于治疗RA，其在疗效和毒副作用方面较化学类药物呈现出明显的优越性。有些针对TNF-α的生物类制剂(如infliximab，etanercept和adalimumab)及针对IL-1的生物类制剂(anakinra)已应用于临床来治疗RA。其中Infliximab是一种人-鼠嵌合IgG1型抗TNF-α单克隆抗体，它与表达TNF-α的关节组织细胞相互作用，破坏关节组织细胞并使其活性下降，从而减轻炎症反应和组织破坏，其临床效果显著。但生物类制剂这种疗法所针对的任意的一个调节途径在正常细胞中同样发挥着关键作用，干扰这些调节途径对机体的固有免疫和适应性免疫存在潜在的危害。

黄连解毒汤首载于葛洪《肘后备急方》，已有一千七百年的应用历史。本方由黄连、黄芩、黄柏、栀子4味中药组成，是清热解毒的经典方剂，具有清热、泻火、解毒之功，主治实热火毒、三焦热盛之证。本发明人在黄连解毒汤血清药物化学研究的基础上，经大量试验证实，该药物能较好的治疗类风湿性关节炎，可明显减轻CIA小鼠的发病严重程度，病灶部位的炎症及免疫损伤情况与对照组相比有非常明显的改善。进一步探索黄连解毒汤的新适应症是研究的方向。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究设计防治类风湿性关节炎药物的药物组合物。

本发明提供了一种防治类风湿关节炎的药物组合物。其中制成活性成分的中药原料组成为下列重量配比：

小檗碱3.79-6.32mg，巴马汀0.24-0.39mg，药根碱1.17-1.95mg，木兰花碱1.07-1.79mg，黄柏碱0.08-0.13mg，黄连碱0.19-0.31mg，黄芩苷37.50-62.50mg，黄芩素1.03-1.72mg，汉黄芩素4.35-7.26mg，汉黄芩苷0.02-0.04mg，栀子苷14.25-23.75mg，藏红花素0.1-0.2mg，绿原酸0.18-0.31mg。

本发明所述防治类风湿关节炎的药物组合物，其中制成活性成分的中药原料组成为下列重量配比：小檗碱6.32mg，巴马汀0.39mg，药根碱1.95mg，木兰花碱1.79mg，黄柏碱0.13mg，黄连碱0.31mg，黄芩苷62.50mg，黄芩素1.72mg，汉黄芩素7.26mg，汉黄芩苷0.04mg，栀子苷23.75mg，藏红花素0.2mg，绿原酸0.31mg；

本发明所述防治类风湿关节炎的药物组合物，其中制成活性成分的中药原料组成为下列重量配比：小檗碱5.75mg，巴马汀0.35mg，药根碱1.75mg，木兰花碱1.65mg，黄柏碱0.15mg，黄连碱0.25mg，黄芩苷57.5mg，黄芩素1.75mg，汉黄芩苷6.0mg，汉黄芩素0.04mg，栀子苷22.5mg，藏红花素0.15mg，绿原酸0.2757mg；

本发明所述防治类风湿关节炎的药物组合物，其中制成活性成分的中药原料组成为下列重量配比：小檗碱3.79mg，巴马汀0.24mg，药根碱1.17mg，木兰花碱1.07mg，黄柏碱0.08mg，黄连碱0.19mg，黄芩苷37.50mg，黄芩素1.03mg，汉黄芩素4.35mg，汉黄芩苷0.02mg，栀子苷14.25mg，藏红花素0.1mg，绿原酸0.18mg。

在这个药物组合物中，小檗碱，巴马汀，药根碱，木兰花碱，黄柏碱，黄连碱等生物碱类成分和绿原酸有较好的抗菌、抗病毒及免疫调控作用，为药物组合物的主要成分；黄芩苷，黄芩素，汉黄芩苷和汉黄芩素等黄酮类成分有较好的抗炎、抗病毒、抗氧化、清除自由基、调节免疫系统等多方面的药理作用，可与生物碱类成分协同发挥抗炎及免疫调节功效；栀子苷，藏红花素具有保肝利胆及对中枢神经系统的等作用可保护机体免受生物碱毒性干扰。本发明提供的防治疗类风湿关节炎药物药物组合物，经大量试验证实，该药物有较好的治疗类风湿性关节炎疗效。本发明的药理学实验结果如下：

1、本发明所述中药黄连解毒汤可抑制类风湿性关节炎CIA的临床发病

在CIA的实验中，用鸡II型胶原(CII)诱导CIA模型，初次免疫为第0天，第21天加强免疫后小鼠随机分为6组：模型组、空白对照组、阳性对照组和三组本发明所述组份药物1、组份药物2、组份药物3。于第20天开始给，阳性对照组每两天给予甲氨喋呤药2mg/kg，本发明所述药物组合物组分别给予配好的药物50mg/kg，连续给药14天，直到实验结束。每天观察小鼠并依据评分标准给每只小鼠评分。

CII诱导CIA，加强免疫后小鼠陆续出现发病，对照组与用药组在发病时间上没有明显差异。发病后，模型组组小鼠疾病严重程度加重较快，在免疫后第37天达到高峰，而给药组小鼠发病后疾病发展较对照组小鼠缓和(图1)。从发病率来看，模型组为95％，对照组为66％，本发明组份药物1、2、3三个剂量组分别为62％，65％和65％。由此可见，本发明所述药物组合物对CIA发病时间没有明显影响，但明显抑制了CIA的发病严重程度和发病率，说明本发明所述药物组合物对CIA具有明显的保护作用。

2、本发明所述药物组合物能下调脾细胞上清液中TNF-α、IL-17、IFN-γ及NO指标在体内给予药物治疗CIA的实验中，疾病达到平台期后处死小鼠，取出脾脏细胞，制成单细胞悬液，每孔1.5×10⁶个细胞铺板，在体外用20μg/ml的抗原CII刺激，培养48小时后收集上清，用ELISA方法测量细胞因子TNF-α、IFN-γ的浓度。

如图2所示，鸡II型胶原(CII)刺激后，模型组细胞上清中TNF-α、IFN-γ，IL-17及NO均高于各个药物处理组，与阳性对照组及本发明所述药物组相比，存在统计学差异(p＜0.05)。说明体内给予药物治疗后，能够抑制促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ、NO和IL-17的分泌，并能从而对CIA疾病具有保护作用。

本发明所述药物组合物的有效成分可抑制炎性细胞因子如TNF-α、IFN-γ分泌。TNF-α和IFN-γ在RA发病机制中起着重要作用。TNF-α可直接诱导蛋白水解酶的合成，如基质金属蛋白酶(MMPs)，造成基质结构的破坏。实验结果也表明，本发明所述药物组合物可大降低脾脏细胞分泌TNF-α。用抗-TNF-α疗法在治疗RA上取得了良好的效果，不但阻止了骨组织破坏而且也抑制了IL-17的产生。本发明所述药物组合物对炎症的控制及对关节组织的保护可能与其降低TNF-α含量有关。

IFN-γ主要由浸润在病灶局部的CD4+T细胞分泌，它可以激活巨噬细胞，活化的巨噬细胞随后表达多种炎症因子，参与并加重炎症反应；IFN-γ还可诱导MIP-1α、MIP-1β和IP-10的表达，这些趋化因子参与淋巴细胞向病灶迁移的过程。实验中，本发明所述药物组合物在体内明显降低了IFN-γ的蛋白水平，有可能与阻断了淋巴细胞的后继迁移有关。有研究报道，TNF-α与IFN-γ在体外共同刺激纤维原细胞和人微血管内皮细胞可协同诱导趋化因子CXCL10的产生，RA病人滑液中大量CXCL10的表达导致活化Th1细胞及自然杀伤细胞的浸润，对组织造成损伤。本研究中，本发明所述组份药物同时降低了IFN-γ及TNF-α的表达。综上所述，本发明所述组份药物对CIA有明显的疗效，可明显抑制CIA临床发病，降低炎性细胞因子TNF-α及IFN-γ的分泌，是本发明所述药物组合物治疗类风湿关节炎的机制。

因此，本发明所述药物组合物可以用于制备防治类风湿关节炎的药物。所述药物可以是由权利要求1-4任一项所述活性成分的中药原料与药用辅料组成的片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等。

附图说明

图1本发明所述组份药物临床评分图

模型组

对照组

组份药物150mg/kg

组份药物250mg/kg

组份药物350mg/kg

图2脾细胞上清细胞因子结果图

图中(1)TNF-α检测结果(2)IL-17检测结果(3)NO检测结果(4)IFN-γ检测结果(5)增殖检测结果；□空白组■模型组甲氨喋呤组

组份药物150mg/kg组份药物250mg/kg

组份药物350mg/kg；*P＜0.05**P＜0.01

具体实施方式

实施例1 本发明的药理学实验

实验材料

药物与试剂

鸡II型胶原(CII)：Chondrex，Redmond，WA 98052，USA；不完全弗氏完全佐剂(IFA)Difco Laboratories，Detroit，MI；磷酸缓冲盐溶液(PBS)：由本实验室自行配制，在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl，0.2g KCl，1.44gNa₂HPO₄和0.24gKH₂PO₄。用盐酸调PH至7.4，加水定容至1L，过滤除菌后使用；二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)，为sigma公司产品；1640培养基：吉诺生物医药技术有限公司；小牛血清：民海生物有限公司；96孔平底板，CORNING公司；70μm细胞研磨滤网，BD Falcon公司；15ml、50ml离心管，BD Falcon公司；0.22μm滤器，Millipore公司；1ml旋口注射器，BD公司；贝朗三通，德国贝朗公司；甲氨喋呤片：上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂(080605)；本发明所述药物组合物1：小檗碱6.32mg，巴马汀0.39mg，药根碱1.95mg，木兰花碱1.79mg，黄柏碱0.13mg，黄连碱0.31mg，黄芩苷62.50mg，黄芩素1.72mg，汉黄芩素7.26mg，汉黄芩苷0.04mg，栀子苷23.75mg，藏红花素0.2mg，绿原酸0.31mg；本发明所述药物组合物2：小檗碱5.75mg，巴马汀0.35mg，药根碱1.75mg，木兰花碱1.65mg，黄柏碱0.15mg，黄连碱0.25mg，黄芩苷57.5mg，黄芩素1.75mg，汉黄芩苷6.0mg，汉黄芩素0.04mg，栀子苷22.5mg，藏红花素0.15mg，绿原酸0.2757mg；本发明所述药物组合物3：小檗碱3.79mg，巴马汀0.24mg，药根碱1.17mg，木兰花碱1.07mg，黄柏碱0.08mg，黄连碱0.19mg，黄芩苷37.50mg，黄芩素1.03mg，汉黄芩素4.35mg，汉黄芩苷0.02mg，栀子苷14.25mg，藏红花素0.1mg，绿原酸0.18mg。

实验动物

DBI/I型小鼠，雄性，6-8周，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2007-0005，饲养于第二军医大学实验动物中心清洁级环境中。

仪器与设备

高速台式离心机，Eppendorf；高速台式低温离心机，HITACHI公司；倒置显微镜，Nikon公司；超净台，苏净集团安泰公司制造；电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；湿度CO2培养箱，Heraus公司；恒温水浴锅，上海国华电器有限公司。

实验方法

模型的建立

实验准备

完全弗氏佐剂(CFA)的制备：在不完全弗氏佐剂中加入热灭活的结核分支杆菌至终浓度4mg/ml，使用之前充分混匀。

0.01M冰乙酸制备：11.43μl冰乙酸溶于20ml去离子水中，过滤，4℃备用。

CII制备：将CII溶解于0.01M冰乙酸至终浓度4mg/ml，4℃保存。

抗原的乳化：用三通管连接两支玻璃针管，将PBS、完全弗氏佐剂和抗原CII分别加入一支针管中(每100μl乳化液含200μg CII和50μl完全弗氏佐剂)，排除针管内气泡后，来回推动针管约500次，将针管内各成分充分混匀成乳化状态。

CIA模型的诱导

第0天，小鼠尾根部2-3厘米处给予100μl/只乳化好的C II抗原皮下注射免疫；第21天，加强免疫：50μl C II和150μl PBS充分混匀，150ul/只腹腔注射；正常组用生理盐水同法注射。

实验分组和给药方案

大鼠随机分为6组，每组12只，分别为正常组、CIA模型组、阳性对照组(甲氨喋呤2mg/kg)、给药组(药物组合物1、药物组合物2、药物组合物3，其给药剂量均为50mg/kg)。于二次免疫前一天(第20天)至第34天给药组分别连续灌胃给药，甲氨喋呤组每两天给药一次，正常组和模型组给予等量的饮用水。

多发性关节炎指数(arthritis index，AI)评分

二次免疫后，定期记录小鼠全身关节病变情况，按3级评分法评价，计算发病率及平均发病指数。具体评分标准为：0分-关节正常；1分-关节轻微红肿；2分-关节红肿严重，累及整个关节，活动受限；3分-爪子或关节功能障碍，关节僵硬。四肢的总和为小鼠的评分，最高为12分。

淋巴及脾脏单个核细胞(MNC)悬液的制备

小鼠处死，固定，剪开腹部皮肤，取两侧腹股沟淋巴结；后打开腹腔，取出脾脏，立即放入装有1640培养基的15ml离心管中，置于冰上；将脾脏倒入70μm的细胞研磨滤网中，用1ml注射器针芯充分研磨，使之成细胞悬液；收集细胞悬液，4℃，1000rpm，离心8min，离心后弃去上清；打散细胞，加入0.83％氯化铵水(约1.0ml/脾脏)，裂解5min；加入3倍体积的PBS终止裂解反应，并用玻璃吸管去除细胞悬液中的絮状物；4℃，1000rpm，离心8min，离心后弃去上清；打散细胞，加入1ml 1640培养基(含小牛血清)，混匀后计数，以1640完全培养基(含小牛血清)在96孔板中培养，5×10⁶/ml每孔100ul，贴壁2小时。

脾细胞NO测定

在96孔平圆底板中每孔加入5×10⁶/ml脾脏MNC100ul，每组4复孔；贴壁2小时后，换液DMEM培养基，每孔加LPS(终浓度1ug/ml)，将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养18小时后取出上清液检测NO。

脾细胞增值测定

在96孔平圆底板中分别加入5×10⁶/ml脾脏及淋巴MNC100ul，每组4复孔；贴壁2小时后，加CII(100ug/ml)，将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时后取出加MTS测增值。

脾细胞细胞因子测定

在96孔平圆底板中加入5×10⁶/ml脾脏MNC100ul，每组4复孔；贴壁2小时后，加CII(100ug/ml)，将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时后取上清液检测细胞因子。

Claims (6)

1.一种防治类风湿关节炎的药物组合物，其特征在于其中制成活性成分的中药原料组成为下列重量配比：小檗碱3.79-6.32mg，巴马汀0.24-0.39mg，药根碱1.17-1.95mg，木兰花碱1.07-1.79mg，黄柏碱0.08-0.13mg，黄连碱0.19-0.31mg，黄芩苷37.50-62.50mg，黄芩素1.03-1.72mg，汉黄芩素4.35-7.26mg，汉黄芩苷0.02-0.04mg，栀子苷14.25-23.75mg，藏红花素0.1-0.2mg，绿原酸0.18-0.31mg。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于其中制成活性成分的中药原料组成为下列重量配比：小檗碱6.32mg，巴马汀0.39mg，药根碱1.95mg，木兰花碱1.79mg，黄柏碱0.13mg，黄连碱0.31mg，黄芩苷62.50mg，黄芩素1.72mg，汉黄芩素7.26mg，汉黄芩苷0.04mg，栀子苷23.75mg，藏红花素0.2mg，绿原酸0.31mg。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于其中制成活性成分的中药原料组成为下列重量配比：小檗碱5.05mg，巴马汀0.32mg，药根碱1.56mg，木兰花碱1.43mg，黄柏碱0.10mg，黄连碱0.25mg，黄芩苷50.00mg，黄芩素1.38mg，汉黄芩素5.81mg，汉黄芩苷0.03mg，栀子苷19.0mg，藏红花素0.13mg，绿原酸0.25mg。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于其中制成活性成分的中药原料组成为下列重量配比：小檗碱3.79mg，巴马汀0.24mg，药根碱1.17mg，木兰花碱1.07mg，黄柏碱0.08mg，黄连碱0.19mg，黄芩苷37.50mg，黄芩素1.03mg，汉黄芩素4.35mg，汉黄芩苷0.02mg，栀子苷14.25mg，藏红花素0.1mg，绿原酸0.18mg。

5.根据权利要求1-4任一项所述药物组合物，其特征在于所述药物组合物为由权利要求1-4任一项所述活性成分的中药原料与药用辅料组成的片剂、胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂。

6.根据权利要求5所述药物组合物，其特征在于所述药物组合物为分散片、含片、口崩片、缓释片或软胶囊剂。

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