CN1437973A - 一种治疗缺血性脑中风的药物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种治疗缺血性脑中风药物组合物及其制备方法，该药物组合物主要包括小檗碱、巴马丁、药根碱、汉黄芩素、木犀草素、黄芩苷、藏红花酸、绿原酸、栀子苷、熊果酸、β－谷甾醇11个化合物。该药物组合物首先是由黄连解毒汤分离制成有效部位，进而再分离出各个化合物。该药物组合物具有良好的治疗缺血性脑中风作用。
Description
发明领域
本发明涉及一种药物组合物及其制备方法，特别是涉及一种治疗缺血性脑中风的药物组合物及其制备方法。
背景技术
缺血性脑中风是临床常见病，以其高发病率、高致残率、高死亡率而严重危害人类健康。目前用于心脑血管疾病治疗的中西药制剂虽较多，但尚无理想的治疗缺血性脑中风的药物，尤其是从纯中药制剂中分离出具有良好的治疗缺血性脑中风的药物有效部位及活性成分的方法及相关制剂并不多见。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗缺血性脑中风的药物组合物；本发明的目的还在于提供一种治疗缺血性脑中风药物组合物的制备方法。
本发明药物组合物主要包括如下化合物，各组份及配比如下(按重量份)：
小檗碱160-180重量份 巴马丁120-140重量份
药根碱18-30重量份 汉黄芩素9-18重量份
木犀草素15-35重量份 黄芩苷140-160重量份
藏红花酸15-30重量份 绿原酸3-9重量份
熊果酸4-9重量份 β-谷甾醇6-12重量份
栀子苷45-60重量份
按药剂学方法，可以将本发明药物组合物制备成多种临床药物剂型，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂当中的一种；所说的非肠道给药剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种。
本发明药物还可加入常规的药物赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂等。
本发明药物组合物的制备方法：按9∶6∶6∶9称取黄连、黄芩、黄柏、栀子15重量份混合均匀，加水煎煮2~3次，每次加水135~165体积份，煎煮50~70min后，趁热过滤，合并各次滤液，静置60-72h，4300-4500转/min离心，得沉淀I。上清液浓缩至175-185体积份，通过弱极性的AB-8型大孔吸附树脂进行吸附，待上清液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用40~70％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到乙醇洗脱物II。将沉淀I和乙醇洗脱物II混合均匀，即得到黄连解毒汤用于缺血性脑中风治疗的有效部位。
取本发明沉淀I，通过聚酰胺柱，用水、40-60％乙醇水溶液、90-95％乙醇水溶液依次进行洗脱，各部分洗脱液减压回收溶剂后，分别得到水洗脱物I-1，90-95％乙醇洗脱物I-2。
上述水洗脱物I-1，用硅胶柱层析分离，二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇(99∶1、98∶2、97∶3、96∶4、95∶5、94∶6、92∶8、90∶10、88∶12、86∶14、84∶16、82∶18、80∶20、78∶22、76∶24)混合溶剂洗脱，每份0.05体积份，共收集400份。其中97-99∶1-3二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第20-24～26-30份)合并后，经重结晶处理，得到小檗碱。96∶4~94∶6二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第51-55～103-107份)合并后，经硅胶薄层制备[5-8∶1∶1-3正丁醇-冰醋酸-水混合溶剂展开，365nm紫外灯下定位，90-95％乙醇洗脱]，并经重结晶处理，得到巴马丁、药根碱。
上述90-95％乙醇洗脱物I-2，用硅胶柱层析分离，二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇(99∶1、98∶2、97∶3、96∶4、95∶5、94∶6、92∶8、90∶10、88∶12、86∶14、84∶16、82∶18、80∶20、78∶22、76∶24、74∶26、72∶28、70∶30、68∶32)混合溶剂洗脱，每份0.04体积份，共收集434份。其中97-99∶1-3二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第56-60～94-98份)合并后，经重结晶处理，得到汉黄芩素。94-96∶4-6二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第135-140～170-175份)合并后，经重结晶处理，得到木犀草素。57-63∶27-33二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第370-380～417-425份)合并后，经Sephadex LH-20柱层析纯化，70-85％乙醇洗脱，得到黄芩苷。
取本发明乙醇洗脱物II，用硅胶柱层析分离，二氯甲烷-甲醇(35∶1、30∶1、25∶1、10∶1、5∶1、2∶1)混合溶剂洗脱，每份0.1体积份，共收集317份。其中23-27∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第27-34～42-48份)合并后，经重结晶处理，得到藏红花酸。4-6∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第168-174～180-189份)合并后，经重结晶处理，得到绿原酸。1-3∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第262-271～290-296份)合并后，经Sephadex LH-20柱层析纯化，75-85％乙醇洗脱，得到栀子苷。9-11∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第43-47～105-114份)合并后，用硅胶柱层析分离，二氯甲烷-甲醇(15∶1、14∶1、13∶1、12∶1、11∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1)混合溶剂洗脱，每份0.05体积份，共收集136份。其中11-15∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第40-47～53-60份)合并后，经重结晶处理，得到β-谷甾醇；8-12∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第86～106份)合并后，经重结晶处理，得到熊果酸。
本药物组合物具有很好治疗缺血性脑中风作用。
实验例1：上述11个化合物的结构均经理化常数测定及波谱学方法(紫外光谱、红外光谱、氢核磁共振光谱、碳核磁共振光谱和质谱等)予以确定。其理化性质及波谱学数据如下：
小檗碱(berberine)橙黄色针晶，分子式为C20H18NO4，分子量为336。熔点145-148℃，溶于甲醇、热水中，与碘化铋钾试剂反应生成桔红色沉淀。点样于硅胶G薄层板上，用展开剂正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)展开，在紫外灯(365nm)下观察，有亮兰色荧光。1HNMR(DMSO)数据：δppm：4.08(3H，s，19-OCH3)，4.06(3H，s，20-OCH3)，6.16(2H，s，21-CH2-)，3.19(2H，t，H-17)，4.93(2H，t，H-16)，7.07(1H，s，H-1)，7.78(1H，s，H-4)，7.99(1H，d，J＝9Hz，H-10)，8.19(1H，d，J＝9Hz，H-9)，8.95(1H，s，H-14)，9.89(1H，s，H-7)。13CNMR(DMSO)数据：δppm：105.4(C-1)，149.8(C-2)，147.7(C-3)，108.4(C-4)，121.4(C-5)、137.5(C-6)，126.7(C-7)，133.0(C-8)，123.5(C-9)，120.4(C-10)，143.6(C-11)，150.4(C-12)，120.2(C-13)，145.5(C-14)，61.9(C-16)，26.3(C-17)，130.7(C-18)，57.1(C-19)，55.2(C-20)，102.1(C-21)。
巴马丁(palmatine)黄色针状结晶，分子式为C21H22NO4，分子量为352。熔点198-201℃，溶于热水，微溶于乙醇、氯仿，与碘化铋钾试剂反应生成桔红色沉淀。点样于硅胶G薄层板上，用展开剂正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)展开，在紫外灯(365nm)下观察，有亮兰色荧光。1HNMR(DMSO)数据：δppm：4.09(3H，s，19-OCH3)，4.06(3H，s，20-OCH3)，3.92(3H，s，21-OCH3)，3.86(3H，s，22-OCH3)，3.22(2H，t，H-17)，4.94(2H，t，H-16)，7.08(1H，s，H-1)，7.71(1H，s，H-4)，8.03(1H，d，J＝9Hz，H-10)，8.20(1H，d，.J＝9Hz，H-9)，9.07(1H，s，H-14)，9.89(1H，s，H-7)。13CNMR(DMSO)数据：δppm：108.8(C-1)，150.2(C-2)，148.7(C-3)，111.3(C-4)，121.3(C-5)，137.7(C-6)，126.8(C-7)，133.1(C-8)，123.4(C-9)，119.9(C-10)，143.6(C-11)，151.5(C-12)，118.9(C-13)，145.5(C-14)，61.9(C-16)，26.0(C-17)，128.6(C-18)，57.0(C-19)，56.2(C-20)，55.9(C-21)，55.4(C-22)。
药根碱(jatrorrhizine)橙色针状结晶，分子式为C20H20NO4，分子量为338。熔点198-200℃，微溶于乙醇、氯仿，与碘化铋钾试剂反应生成桔红色沉淀。点样于硅胶G薄层板上，用展开剂正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)展开，在紫外灯(365nm)下观察，有亮兰色荧光。1HNMR(DMSO)数据：δppm：4.08(3H，s，19-OCH3)，4.05(3H，s，20-OCH3)，3.93(3H，s，21-OCH3)，3.13(2H，t，H-17)，4.90(2H，t，H-16)，6.87(1H，s，H-1)，7.69(1H，s，H-4)，8.00(1H，d，J＝9Hz，H-10)，8.18(1H，d，J＝9Hz，H-9)，8.99(1H，s，H-14)，9.85(1H，s，H-7)。13CNMR(DMSO)数据：δppm：109.5(C-1)，150.0(C-2)，147.9(C-3)，114.9(C-4)，121.2(C-5)，138.2(C-6)，126.8(C-7)，133.2(C-8)，123.3(C-9)，119.4(C-10)，143.5(C-11)，150.1(C-12)，117.6(C-13)，145.2(C-14)，61.9(C-16)，25.8(C-17)，128.8(C-18)，57.0(C-19)，56.2(C-20)，55.4(C-21)。
汉黄芩素(wogonin) 黄色粉末，分子式为C16H12O5，分子量为284。熔点203-205℃，盐酸-镁粉反应阳性。点样于聚酰胺-6薄膜上，用展开剂醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶7∶5∶3)展开，1％三氯化铁乙醇溶液显色，显墨绿色斑点。1HNMR(DMSO)数据：δppm：12.50(s，7-OH)，10.82(s，5-OH)，7.00(1H，s，H-6)，6.30(1H，s，H-3)，8.08-8.05(2H，m，H-2’，6’)，7.62-7.56(3H，m，H-3’，4’，5’)。13CNMR(DMSO)数据：δppm：157.4(C-2)，103.8(C-3)，182.1(C-4)，149.6(C-5)，99.1(C-6)，163.0(C-7)，156.2(C-8)，132.1(C-9)，61.1(C-10)，130.8(C-11)，129.3(C-1’)，126.3(C-2’)，105.1(C-3’)，127.8(C-4’)，105.1(C-5’)，126.3(C-6’)。
木犀草素(luteolin)淡黄色粉末，分子式为C15H10O6，分子量为286。熔点328-330℃，盐酸-镁粉反应阳性。点样于聚酰胺薄膜上，用展开剂醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶7∶5∶3)展开，1％三氯化铁乙醇溶液显色，显墨绿色斑点。1HNMR(DMSO)数据：δppm：12.97(s，7-OH)，10.82(s，5-OH)，9.92(s，3’-OH)，9.40(s，4’-OH)，6.66(1H，d，J＝1.8，H-8)，6.43(1H，d，J＝1.8，H-6)，6.18(1H，s，H-3)，7.40(1H，dd，J＝8.1，1.5，H-6’)，7.42(1H，d，J＝1.5，H-2’)，6.87(1H，d，J＝8.1，H-5’)。13CNMR(DMSO)数据：δppm：163.9(C-2)，102.9(C-3)，181.6(C-4)，157.3(C-5)，98.8(C-6)，164.1(C-7)，93.8(C-8)，161.5(C-9)，102.9(C-10)，119.0(C-1’)，113.4(C-2’)，145.7(C-3’)，149.7(C-4’)，116.0(C-5’)，121.5(C-6’)。
黄芩苷(baicalin) 淡黄色粉末，分子式为C21H18O11，分子量为446。熔点222-224℃，盐酸-镁粉反应阳性，Molish反应阳性。点样于聚酰胺薄膜上，用展开剂醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶7∶5∶3)展开，1％三氯化铁乙醇溶液显色，有墨绿色斑点。1HNMR(DMSO)数据：δppm：7.04(1H，s，H-8)，7.00(1H，s，H-3)，8.13-8.00(2H，m，H-2’，6’)，7.60-7.56(3H，m，H-3’，4’，5’)。13CNMR(DMSO)数据：δppm：151.3(C-2)，104.7(C-3)，170.1(C-4)，146.7(C-5)，132.0(C-6)，163.5(C-7)，93.7(C-8)，149.2(C-9)，106.1(C-10)，130.8(C-1’)，129.2(C-2’)，126.4(C-3’)，130.6(C-4’)，126.4(C-5’)，129.2(C-6’)，99.9(C-1″)，72.8(C-2″)，75.4(C-3″)，7 1.3(C-4″)，75.2(C-5″)，182.6(C-6″)。
藏红花酸(crocetin)红色粉末，分子式为C20H24O4，分子量为328。熔点大于300℃。微溶于甲醇、二氯甲烷，易溶于碳酸氢钠溶液中。紫外光谱在424.0nm和449.5nm处有两吸收峰。EI-MS谱可见m/z分别为279(M-COOH)、149(1/2M-CH3)、84(1/2M-COOH-CH3)等碎片离子峰。13CNMR(DMSO)数据：δppm：169.1(C-1，C-16)，143.4(C-2，C-15)，136.7(C-3，C-14)，131.6(C-4，C-13)，135.3(C-5，C-12)，138.1(C-6，C-11)，126.9(C-7，C-10)，124.1(C-8，C-9)，12.6(C-17，C-20)，12.8(C-18，C-19)。
绿原酸(chlorogenic acid)灰白色粉末，分子式为C16H18O9，分子量为354。熔点206-209C，易溶于碳酸氢钠溶液中。1HNMR(DMSO)数据：δppm：7.41(1H，d，J＝16Hz，H-9)，6.13(1H，d，J＝16Hz，H-8)，7.02(1H，d，J＝2Hz，H-2’)，6.97(1H，dd，J＝2，8Hz，H-6’)，6.13(1H，d，J＝8Hz，H-5’)，5.05(1H，m，H-3)，4.9(1H，m，H-5)，4.7(1H，m，H-4)，2.00-1.73(4H，m，H-2，6)。13CNMR(DMSO)数据：δppm：174.9(C-10)，165.7(C-7)，148.3(C-4’)，145.5(C-3’)，144.9(C-8)，125.6(C-6’)，121.3(C-2’)，115.7(C-5’)，1 14.8(C-1’)，1 14.3(C-9)，73.4(C-1)，70.9(C-3)，70.3(C-4)，68.0(C-5)，37.2(C-6)，36.2(C-2)。
熊果酸(ursolic acid) 白色结晶性粉末，分子式为C30H48O3，分子量为456。熔点279-282℃。Liebermann-Burchard反应产生黄-红-紫-蓝等颜色，最后褪色。点样于硅胶G薄层板上，用展开剂正丁醇-氯仿-醋酸乙酯(20∶5∶8)展开，醋酐-浓硫酸(9∶1)显色，110℃烘5分钟，呈褐色斑点。1HNMR(DMSO)数据：δppm：1.07、1.04、0.85、0.74、0.66(23，24，25，26，27-CH3)，0.89(3H，d，29-CH3)、0.80(3H，d，30-CH3)。13CNMR(DMSO)数据：δppm：40.5(C-1)，27.5(C-2)，76.8(C-3)，40.3(C-4)，54.8(C-5)，18.0(C-6)，32.7(C-7)，38.4(C-8)，38.4(C-9)，38.2(C-10)，17.0(C-11)，124.6(C-12)，138.2(C-13)，36.3(C-14)，27.0(C-15)，23.9(C-16)，47.0(C-17)，52.4(C-18)，41.6(C-19)，39.8(C-20)，30.2(C-21)，36.5(C-22)，28.2(C-23)，15.2(C-24)，16.1(C-25)，16.9(C-26)，22.8(C-27)，178.3(C--28)，23.3(C-29)，21.1(C-30)。
β-谷甾醇(β-sitosterol) 白色结晶，分子式为C29H50O，分子量为414。熔点206-209℃，Liebermann-Burchard反应产生红-紫-蓝-绿-污绿等颜色，最后褪色。13CNMR数据：δppm：140.7(C-5)，121.7(C-6)，71.8(C-3)，56.8(C-14)，56.0(C-17)，50.1(C-9)，45.8(C-24)，42.3(C-13)，39.8(C-4)，38.8(C-12)，37.2(C-10)，36.5(C-20)，36.1(C-1)，33.9(C-22)，33.7(C-7)，31.9(C-8)，31.7(C-2)，29.1(C-23)，28.2(C-16)，26.0(C-28)，24.3(C-15)，23.1(C-26)，21.1(C-11)，19.8(C-19)，19.4(C-21)，19.0(C-25)，18.8(C-27)，12.0(C-29)，11.9(C-18)。
栀子苷(geniposide) 白色粉末，分子式为C17H24O10，分子量为388。熔点159-161℃，点样于硅胶G薄层板上，用展开剂醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)展开，10％硫酸乙醇液显色，105℃烘10分钟，有斑点出现。高效液相色谱中，采用YWG-C18色谱柱(250mm×4.6mm，10μm)，以乙腈-水(15∶85)为流动相，在238nm波长下检测，保留时间为8.9min。高分辨质谱显示分子离子峰m/z为389.1434(M+1)，苷元离子峰为227.1462(M-Glu+1)、209.0809(M-Glu-OH)、185.1020、93.0546。1HNMR(DMSO)数据：δppm：3.63(3H，s，12-CH3)，5.10(1H，d，J＝6.9Hz，H-1)，4.51(1H，d，J＝7.8Hz，H-1’)。13CNMR(DMSO)数据：δppm：98.5(C-1)，155.1(C-3)，110.9(C-4)，37.9(C-5)，34.4(C-6)，125.7(C-7)，144.1(C-8)，45.8(C-9)，59.3(C-10)，166.9(C-11)，51.1(C-12)，99.3(C-1’)，73.3(C-2’)，77.3(C-3’)，69.9(C-4’)，76.6(C-5’)，60.9(C-6’)。实验例2：对缺血性脑中风治疗的药理作用
1 材料与方法：1.1 药品与试剂：黄连解毒汤有效部位，黄连解毒汤流浸膏(每毫升相当于原药材1g)，由中药学院中药化学系提供；牛黄清心丸，同仁堂集团公司产品；红四氮唑(2，3，5，三苯基氯化四氮唑，TTC)分析纯，中国医药(集团)上海化学试剂公司生产，批号：990930；硫酸庆大霉素，烟台只楚药业有限公司产品，批号000208；伊文思兰：上海化学试剂采购供应站经销，批号：821102；甲酰胺，苏州正兴化工研究所出品，分析纯，批号：960630；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S-转移酶(GSH-ST)和还原型谷胱胺态(GSH)测试试剂盒由南京建成生物工程公司提供。1.2 实验动物：SD大鼠，体重200~230g(多发脑梗塞用6~8月龄，体重350~450g)由维通利华提供。1.3实验仪器：AEG-220型电子分析天平，日本岛津产品；400R低温离心机，德国Heraeus产品；XTT实体显微镜，北京电光科学仪器厂生产。DS型电热三用水箱，北京医疗仪器厂产品；HZQ-C空气浴振荡器，哈尔滨市东明医疗仪器厂；722型紫外分光光度计，上海第三分析仪器厂产品。1.4 FeCl3化学诱导大脑中动脉血栓闭塞模型的建立及神经行为与梗塞范围的测定：实验动物分七组，即对照组、MCAO模型组、黄连解毒汤有效部位大剂量(0.610g/kg)组；中剂量(0.305g/kg)组、小剂量(0.158g/kg)组；黄连解毒汤流浸膏4g/kg组；牛黄清心丸1.6g/kg。预先灌胃给药2天，2次/天。对照组与模型组给与等体积CMC。第三天晨给药后30分钟造模，大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(350mml/kg)麻醉。按Tamura等的方法，稍加改进。大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切去，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。置一小片塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有50％FeCl3溶液10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，常规皮肤消毒并腹腔注射硫酸庆大霉素防止感染，大鼠回笼饲养。假手术组，除不滴加FeCl3溶液外，其余操作同其余各组，术后当日继续给药，次日晨在给药一次后取材。造模后6h、24h按bederson等的方法加以改进，对动物进行评分。满分为4分，得分越高，动物行为障碍越严重，神经症状越明显。将各组动物评分进行组间t检验。动物经24h行为评分后，断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分在4℃冰盘上冠状切5片。迅速将脑片置于TTC染液中(每5mlTTC染液中含4％TTC1.5ml，1MK2HPO40.1m1)，37℃避光温孵30分，取出后置于10％甲醛溶液中避光保存。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区位白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占全脑重量百分比为脑梗塞范围，分别计算每只动物全脑和半脑，将各组动物脑梗塞范围进行组间t检验。
1.5 双侧颈总动脉结扎大鼠脑缺血模型的建立及脑毛细血管通透性的测定：大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉，仰位固定，常规皮肤消毒。切开颈正中皮肤，分离双侧颈总动脉并埋线。舌下静脉注射2.5％伊文思兰生理盐水溶液50mg/kg，5分钟后结扎双侧颈总动脉，缝合肌肉与皮肤，其中假手术组只埋线不结扎。实验动物64只分六组，即假手术组、缺血模型组、实验动物分七组，即对照组、MCAO模型组、黄连解毒汤有效部位大剂量(0.610g/kg)组；中剂量(0.305g/kg)组、小剂量(0.158g/kg)组；黄连解毒汤流浸膏4g/kg组；牛黄清心丸1.6g/kg。预先灌胃给药三天，假手术组与模型组给与等体积CMC。第四日上午给药后1h进行造模。结扎6小时后，断头取全脑，去除嗅球小脑及脑干，将脑组织称重后置于4ml甲酰胺中，37度温孵浸泡24h，取上清液，用722型分光光度计620nm比色，根据标准曲线回归方程计算脑内EB含量，以每克脑组织湿重所含EB量进行标识，进行组间t检验。1.6 同源血粉所致大鼠多发性脑梗塞模型的制备及该模型脑生化指标测定实验动物随机分7组：假手术组；模型对照组；黄连解毒汤有效部位大剂量(0.610g/kg)组；中剂量(0.305g/kg)组、小剂量(0.158g/kg)组；黄连解毒汤流浸膏4g/kg组；牛黄清心丸1.6g/kg。黄连解毒汤有效部位研细后用0.5％CMC配制。动物给药2天，每日剂量分上下午两次给与，假手术组和模型组给与同体积CMC。第三日晨再给药一次后进行造模。同源血块制备：在该批大鼠中取一只，水合氯醛麻醉后分离颈总动脉放血，血液37度放置48h至完全干燥，将干燥血块置研钵中研细，过75目筛，所得干燥细小血块备用，造模时用生理盐水配成3％混悬液。同源血块法脑梗塞模型造模：将大鼠水合氯醛麻醉，常规消毒后颈正中切口，分离暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉、翼腭动脉。首先在颈外动脉近端有医用缝合线打一活结暂时阻断，然后手术线打结阻断翼腭动脉。之后暂时夹闭颈总动脉，用1ml玻璃注射器吸取3％血块生理盐水混悬液0.5ml由颈总动脉穿刺缓慢注射使血块进入颈内动脉，抽出针头在穿刺处涂抹少量医用胶堵住伤口，立即打开颈总动脉恢复血流供应使血块完全被冲入颈内动脉，打开颈外动脉活结恢复颈外动脉血流供应。逐层缝合肌肉与皮肤，腹腔注射庆大霉素。大鼠回笼饲养并与实验当晚和次日晨各给药一次。取材：造模后次日末次给药后1h，将大鼠断头处死，于冰盘上迅速分离大鼠右侧脑，去除溴球与低位脑干，称重后，以生理盐水1∶9在冰水浴中匀浆制成10％脑匀浆，每个标本分装几份后，低温冰箱冻存备用。生化指标测定：取出匀浆化冻后4000rpm15min得到匀浆上清液，按照试剂盒说明书所示方法，采用发色底物法分别测定SOD活性、GSH-PX活性、CAT活性、GSH-ST活性和GSH含量。
2.结果
2.1 黄连解毒汤有效部位对MCAO大鼠神经症状的影响：结果显示，除假手术组未见行为异常改变，MCA0模型组大鼠在术后6h，24h均出现偏瘫样症状，主要表现为手术对侧前肢内收，肩内旋，前肢肌张力降低，肩抗力下降。黄连解毒汤有效部位大、中、小剂量组和黄连解毒汤组对大鼠在术后6h，24h神经症状均有明显的改善作用(P＜0.01，P＜0.05)，结果见表1。
表1 黄连解毒汤有效部位对MCAO脑梗塞大鼠神经症状的影响(
X±SD)
剂量 动物 神经症状评分
组别
(g/kg) 数 6h 24h
假手术 - 10 0±0** 0±0**
MCAO模型 - 11 3.58±0.67 3.42±0.67
黄连解毒汤有效部位 0.610 12 2.58±1.00* 2.17±0.83**
0.305 11 2.73±1.01* 2.73±0.65*
0.158 11 2.73±0.79* 2.63±0.50**
黄连解毒汤 4.0 12 2.42±1.00** 2.17±0.83**
牛黄清心丸 1.6 12 2.83±1.03* 2.67±0.89*
注：与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01
2.2 黄连解毒汤有效部位对MCAO大鼠脑梗塞范围的影响：结果显示，术后24h，除假手术组未见脑组织异常改变外，血栓模型组、给药组大鼠均有不同程度梗塞灶，黄连解毒汤有效部位大、中、小剂量组可明显减少MCAO大鼠脑梗塞范围(P＜0.01＝。结果见表2。
表2 黄连解毒汤有效部位对MCAO大鼠脑梗塞范围的影响(
X±SD)
组别 剂量(g/kg) 动物数 半脑脑梗塞范围(％) 全脑脑梗塞范围(％)
假手术 - 10 0±0** 0±0**
MCAO模型 - 12 6.06±2.27 2.92±1.37
黄连解毒汤有效部位 0.610 12 3.05±2.39** 1.50±1.11*
0.305 11 1.82±0.92** 0.88±0.40**
0.158 10 3.57±2.72* 1.73±1.28*
黄连解毒汤 4.0 12 3.47±1.64* 1.75±0.82*
牛黄清心丸 1.6 12 3.57±2.10* 1.79±1.07*
注：与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01
2.3 黄连解毒汤有效部位对CCAO大鼠脑毛细血管通透性的影响：结果显示：模型组大鼠脑组织EB含量明显高于假手术组(p＜0.01)，黄连解毒汤有效部位中、小剂量组EB含量明显低于模型组p＜0.05；p＜0.01)。结果见表3。
表3 黄连解毒汤有效部位对双侧颈总动脉结扎大鼠脑毛细血管通透性的影响(
X±SD)
组别 n 剂量(g/kg) EB含量(μg/g wet.wt)
假手术组 12 - 10.04±1.27**
模型 12 - 12.12±1.78
黄连解毒汤有效部位 10 0.610 11.64±1.94
10 0.305 10.64±1.74*
10 0.158 9.97±2.39**
黄连解毒汤 10 4.0 11.67±1.46
牛黄清心丸 10 1.6 10.06±2.11**
注：与模型组比：*p＜0.05 **p＜0.01
2.4 黄连解毒汤有效部位对同源血粉颈内静脉注射所致脑梗塞大鼠过氧化损伤的保护作用：结果显示造模后模型组大鼠脑匀浆中CAT活性、GSH-ST活性与Cu-ZnSOD活性显著下降著，表明清除自由基的主要活性酶类活性显著下降，抗氧化活力下降。黄连解毒汤有效部位大、中、小剂量均可提高模型动物脑匀浆CAT和GSH-PX活性；黄连解毒汤有效部位中剂量可提高模型大鼠GSH-ST活性；黄连解毒汤有效部位大、中、小剂量均能提高还原型谷胱甘肽含量；黄连解毒汤有效部位小剂量还可显著提高模型动物脑匀浆Cu-ZnSOD活性，表明黄连解毒汤有效部位对脑梗塞过氧化损伤具有明显的保护作用。结果见表4。
表4 黄连解毒汤有效部位对同源血粉颈内静脉注射所致脑梗塞大鼠过氧化损伤的保护作用(
X±SD)
| 组别 | 动物数 | 剂量(g/kg) | CAT活性(U/mgprot) | GSH-ST活性(U/mgprot) | GSH-PX活性(U/mgprot) | GSH含量(mg/mgprot) | CU-ZnSOD活性(NU/mgprot) |
| 假手术 | 10 | - | 3.60±1.05* | 95.99±13.93* | 10.37±2.46 | 109.97±16.37 | 345.72±75.23* |
| 模型 | 9 | - | 2.58±0.97 | 84.93±7.59 | 9.83±2.09 | 112.38±9.05 | 278.13±36.55 |
| 有效部位(大) | 10 | 0.610 | 3.66±0.82* | 89.13±7.80 | 11.65±1.43* | 125.13±13.98* | 292.02±30.52 |
| 有效部位(中) | 9 | 0.305 | 3.75±0.43** | 93.60±9.09* | 12.09±2.30* | 139.29±19.70** | 290.84±45.06 |
| 有效部位(小) | 9 | 0.158 | 3.90±0.81** | 91.55±11.09 | 12.48±2.73* | 143.41±19.88** | 324.60±35.35* |
| 黄连解毒汤 | 9 | 4.0 | 3.30±1.74 | 92.91±22.66 | 14.50±4.78* | 128.32±18.11* | 287.30±71.10 |
| 牛黄清心丸 | 10 | 1.6 | 3.42±0.66* | 90.59±6.12 | 12.32±1.31** | 130.92±13.63** | 268.54±21.98 |
注：与模型组比较：*p＜0.05；**p＜0.01实施例1
称取黄连4.5kg、黄芩3kg、黄柏3kg、栀子4.5kg，混合均匀，加水煎煮2次，每次加水150L，煎煮1h后，趁热过滤，合并2次滤液，静置72h，离心(4500转/min)，得沉淀I。上清液浓缩至180L，通过弱极性的AB-8型大孔吸附树脂(树脂体积为15L)进行吸附，吸附流速为2L/h；待上清液全部通过树脂柱后，用8倍树脂体积(约120L)的水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用10倍树脂体积(约150L)的50％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，洗脱流速为2L/h；收集50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到乙醇洗脱物II。将沉淀I和乙醇洗脱物II混合均匀，即得到源于黄连解毒汤的治疗缺血性脑中风的有效部位1141g。计算本发明治疗缺血性脑中风有效部位的得率为7.61％。实施例2
按9∶6∶6∶9称取黄连、黄芩、黄柏、栀子15kg，混合均匀，加水煎煮2次，每次加水150L，煎煮60min后，趁热过滤，合并2次滤液，静置72h，4500转/min离心，得沉淀I 447g。上清液浓缩至180L，通过弱极性的AB-8型大孔吸附树脂进行吸附，待上清液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用50％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到乙醇洗脱物II 694g。将沉淀I 447g和乙醇洗脱物II 694g混合均匀，即得到治疗缺血性脑中风的有效部位。
取本发明沉淀I 30g，通过聚酰胺柱，用水、50％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液依次进行洗脱，各部分洗脱液减压回收溶剂后，分别得到水洗脱物I-115g，90％乙醇洗脱物I-2 13g。
上述水洗脱物I-1 3g，用硅胶柱层析分离，以二氯甲烷、不同比例二氯甲烷-甲醇混合溶剂(比例依次为99∶1、98∶2、97∶3、96∶4、95∶5、94∶6、92∶8、90∶10、88∶12、86∶14、84∶16、82∶18、80∶20、78∶22、76∶24)进行梯度洗脱，每份50mL，共收集400份。其中98∶2二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第22～28份)合并后，经重结晶处理，得到小檗碱245 mg。95∶5二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第53～105份)合并后，经硅胶薄层制备[7∶1∶2正丁醇-冰醋酸-水混合溶剂展开，365nm紫外灯下定位，95％乙醇洗脱]，并经重结晶处理，得到巴马丁190mg、药根碱34mg。
上述90％乙醇洗脱物I-2 3g，用硅胶柱层析分离，以二氯甲烷、不同比例二氯甲烷-甲醇混合溶剂(比例依次为99∶1、98∶2、97∶3、96∶4、95∶5、94∶6、92∶8、90∶10、88∶12、86∶14、84∶16、82∶18、80∶20、78∶22、76∶24、74∶26、72∶28、70∶30、68∶32)进行梯度洗脱，每份40mL，共收集434份。其中98∶2二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第58～96份)合并后，经重结晶处理，得到汉黄芩素24mg。95∶5二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第138～172份)合并后，经重结晶处理，得到木犀草素35mg。70∶30二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第375～422份)合并后，经Sephadex LH-20柱层析纯化，80％乙醇洗脱，得到黄芩苷264mg。
取本发明乙醇洗脱物II 30g，用硅胶柱层析分离，以不同比例二氯甲烷-甲醇混合溶剂(比例依次为35∶1、30∶1、25∶1、10∶1、5∶1、2∶1)进行梯度洗脱，每份100mL，共收集317份。其中25∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第31～45份)合并后，经重结晶处理，得到藏红花酸99mg。5∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第173～185份)合并后，经重结晶处理，得到绿原酸29mg。2∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第268～293份)合并后，经Sephadex LH-20柱层析纯化，80％乙醇洗脱，得到栀子苷239mg。10∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第46～109份)合并后，用硅胶柱层析分离，以不同比例二氯甲烷-甲醇混合溶剂(比例依次为15∶1、14∶1、13∶1、12∶1、11∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1)进行梯度洗脱，每份50mL，共收集136份。其中13∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第44～56份)合并后，经重结晶处理，得到β-谷甾醇40mg；10∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分(第90～102份)合并后，经重结晶处理，得到熊果酸22mg。实施例3
小檗碱170mg 巴马丁132mg 药根碱24mg 汉黄芩素14mg
木犀草素20mg 黄芩苷153mg 藏红花酸23mg 绿原酸6mg
熊果酸5mg β-谷甾醇9mg 栀子苷55mg
制成胶囊50粒，每粒含12.22mg(相当有效部位228.2mg)，每天服用2次，每次2粒。实施例4
小檗碱172mg 巴马丁130mg 药根碱20mg 汉黄芩素18mg
木犀草素25mg 黄芩苷157mg 藏红花酸20mg 绿原酸5mg
熊果酸6mg β-谷甾醇8mg 栀子苷50mg
制成片剂75片，每片含8.15mg(相当有效部位152.1mg)，每天服用2次，每次3片。实施例5
小檗碱165mg 巴马丁137mg 药根碱28mg 汉黄芩素17mg
木犀草素28mg 黄芩苷145mg 藏红花酸21mg 绿原酸8mg
熊果酸8mg β-谷甾醇6mg 栀子苷48mg
制成滴丸250粒，每粒含2.44mg(相当有效部位45.64mg)，每天服用2次，每次5粒。
Claims (9)
1、一种药物组合物，其特征在于该药物组合物主要由下述化合物构成：
小檗碱160-180重量份 巴马丁120-140重量份
药根碱18-30重量份 汉黄芩素9-18重量份
木犀草素15-35重量份 黄芩苷140-160重量份
藏红花酸15-30重量份 绿原酸3-9重量份
熊果酸4-9重量份 β-谷甾醇6-12重量份
栀子苷45-60重量份。
2、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物主要是由下述化合物构成：
小檗碱170重量份 巴马丁132重量份
药根碱24重量份 汉黄芩素14重量份
木犀草素20重量份 黄芩苷153重量份
藏红花酸23重量份 绿原酸6重量份
熊果酸5重量份 β-谷甾醇9重量份
栀子苷55重量份。
3、权利要求1或2的药物组合物中的各化合物的制备方法，其特征在于该方法为：
按9∶6∶6：称取黄连、黄芩、黄柏、栀子15重量份混合均匀，加水煎煮2～3次，每次加水135～165体积份，煎煮50～70min后，趁热过滤，合并各次滤液，静置60-72h，4300-4500转/min离心，得沉淀I；上清液浓缩至175-185体积份，通过弱极性的AB-8型大孔吸附树脂进行吸附，待上清液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用40～70％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到乙醇洗脱物II；将沉淀I和乙醇洗脱物II混合均匀，即得到黄连解毒汤用于缺血性脑中风治疗的有效部位；
取本发明沉淀I，通过聚酰胺柱，用水、40-60％乙醇水溶液、90-95％乙醇水溶液依次进行洗脱，各部分洗脱液减压回收溶剂后，分别得到水洗脱物I-1，90-95％乙醇洗脱物I-2；
上述水洗脱物I-1，用硅胶柱层析分离，以二氯甲烷、不同比例二氯甲烷-甲醇混合溶剂，比例依次为99∶1、98∶2、97∶3、96∶4、95∶5、94∶6、92∶8、90∶10、88∶12、86∶14、84∶16、82∶18、80∶20、78∶22、76∶24，进行梯度洗脱，每份0.05体积份，共收集400份；其中97-99∶1-3二氯甲烷-甲醇洗脱部分第20-24～26-30份合并后，经重结晶处理，得到小檗碱；94-96∶4-6二氯甲烷-甲醇洗脱部分第51-55～103-107份合并后，经硅胶薄层制备以5-8∶1∶1-3正丁醇-冰醋酸-水混合溶剂展开，365nm紫外灯下定位，90-95％乙醇洗脱，并经重结晶处理，得到巴马丁、药根碱；
上述90-95％乙醇洗脱物I-2，用硅胶柱层析分离，以二氯甲烷、不同比例二氯甲烷-甲醇混合溶剂，比例依次为99∶1、98∶2、97∶3、96∶4、95∶5、94∶6、92∶8、90∶10、88∶12、86∶14、84∶16、82∶18、80∶20、78∶22、76∶24、74∶26、72∶28、70∶30、68∶32，进行梯度洗脱，每份0.04体积份，共收集434份；其中97-99∶1-3二氯甲烷-甲醇洗脱部分第56-60～94-98份合并后，经重结晶处理，得到汉黄芩素；94-96∶4-6二氯甲烷-甲醇洗脱部分第135-140～170-175份合并后，经重结晶处理，得到木犀草素；57-63∶27-33二氯甲烷-甲醇洗脱部分第370-380～417-425份合并后，经Sephadex LH-20柱层析纯化，70-85％乙醇洗脱，得到黄芩苷；
取本发明乙醇洗脱物II，用硅胶柱层析分离，以不同比例二氯甲烷-甲醇混合溶剂比例依次为35∶1、30∶1、25∶1、10∶1、5∶1、2∶1进行梯度洗脱，每份0.1体积份，共收集317份；其中23-27∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分第27-34～42-48份合并后，经重结晶处理，得到藏红花酸；4-6∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分第168-174～180-189份合并后，经重结晶处理，得到绿原酸；1-3∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分第262-271～290-296份合并后，经Sephadex LH-20柱层析纯化，75-85％乙醇洗脱，得到栀子苷；9-11∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分第43-47～105-114份合并后，用硅胶柱层析分离，以不同比例二氯甲烷-甲醇混合溶剂比例依次为15∶1、14∶1、13∶1、12∶1、11∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1进行梯度洗脱，每份0.05体积份，共收集136份；其中11-15∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分第40-47～53-60份合并后，经重结晶处理，得到β-谷甾醇；8-12∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分第86～106份合并后，经重结晶处理，得到熊果酸。
4、如权利要求3所述的药物组合物中的各化合物的制备方法，其特征在于该方法为：
按9∶6∶6∶9称取黄连、黄芩、黄柏、栀子15重量份，混合均匀，加水煎煮2～3次，每次加水150体积份，煎煮50～70min后，趁热过滤，合并各次滤液，静置72h，4500转/min离心，得沉淀I；上清液浓缩至180体积份，通过弱极性的AB-8型大孔吸附树脂进行吸附，待上清液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用40~70％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到乙醇洗脱物II；将沉淀I和乙醇洗脱物II混合均匀，即得到黄连解毒汤用于缺血性脑中风治疗的有效部位；
取本发明沉淀I，通过聚酰胺柱，用水、50％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液依次进行洗脱，各部分洗脱液减压回收溶剂后，分别得到水洗脱物I-1，90％乙醇洗脱物I-2；
上述水洗脱物I-1，用硅胶柱层析分离，二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇其以99∶1、98∶2、97∶3、96∶4、95∶5、94∶6、92∶8、90∶10、88∶12、86∶14、84∶16、82∶18、80∶20、78∶22、76∶24混合溶剂洗脱，每份0.05体积份，共收集400份；其中二98∶2氯甲烷-甲醇洗脱部分第22～28份合并后，经重结晶处理，得到小檗碱；95∶5二氯甲烷-甲醇洗脱部分第53～105份合并后，经硅胶薄层制备7∶1∶2正丁醇-冰醋酸-水混合溶剂展开，365nm紫外灯下定位，95％乙醇洗脱，并经重结晶处理，得到巴马丁、药根碱；
上述90％乙醇洗脱物I-23g，用硅胶柱层析分离，二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇其以99∶1、98∶2、97∶3、96∶4、95∶5、94∶6、92∶8、90∶10、88∶12、86∶14、84∶16、82∶18、80∶20、78∶22、76∶24、74∶26、72∶28、70∶30、68∶32混合溶剂洗脱，每份0.04体积份，共收集434份；其中98∶2二氯甲烷-甲醇洗脱部分第58～96份合并后，经重结晶处理，得到汉黄芩素；95∶5二氯甲烷-甲醇洗脱部分第138～172份合并后，经重结晶处理，得到木犀草素；70∶30二氯甲烷-甲醇洗脱部分第375～422份合并后，经Sephadex LH-20柱层析纯化，80％乙醇洗脱，得到黄芩苷；
取本发明乙醇洗脱物II，用硅胶柱层析分离，二氯甲烷-甲醇其以35∶1、30∶1、25∶1、10∶1、5∶1、2∶1混合溶剂洗脱，每份0.1体积份mL，共收集317份；其中25∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分第31～45份合并后，经重结晶处理，得到藏红花酸；5∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分第173～185份合并后，经重结晶处理，得到绿原酸；2∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分第268～293份合并后，经Sephadex LH-20柱层析纯化，80％乙醇洗脱，得到栀子苷；10∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分第46～109份合并后，用硅胶柱层析分离，二氯甲烷-甲醇其以15∶1、14∶1、13∶1、12∶1、11∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1混合溶剂洗脱，每份0.05体积份，共收集136份；其中13∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分第44～56份合并后，经重结晶处理，得到β-谷甾醇；10∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部分第90～102份合并后，经重结晶处理，得到熊果酸。
5、权利要求1或2所述的药物组合物在制备治疗缺血性脑中风的药物中的应用。
6、如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于还可加入药学上可接受的敷料或赋形剂。
7、如权利要求6所述的的药物组合物，其特征在于敷料或赋形剂是指溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂等。
8、如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于可制成临床可接受的剂型。
9、如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂、注射剂、气雾剂、栓剂。
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