CN103417556A - 茋类化合物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，公开了茋类化合物在制备治疗急性期缺血性脑卒中药物的新应用曲札茋苷及白皮杉醇作用时间窗可达到6小时，在大鼠脑缺血发生过程中可以使大鼠脑组织含水量减少，使大鼠神经功能评分改善，其作用机制主要与其较强的抗氧化，清除氧自由基作用，具有脑保护作用有关。而白皮杉醇在体外具有较强的抗氧化，清除氧自由基作用，并且作用强于曲札茋苷。因此本发明提供了曲札茋苷和白皮杉醇在制备治疗急性期缺血性脑卒中药物的应用。

Description

茋类化合物的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体的说是涉及茋类化合物在制备治疗急性期缺血性脑卒中药物的应用。

背景技术

脑卒中（Stroke），俗称脑中风，是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，又叫脑血管意外，是指脑血管疾病的病人因各种诱发因素引起脑内动脉狭窄，闭塞或破裂，而造成急性脑血液循环障碍，临床上表现为一过性或永久性脑功能障碍的症状和体征。脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中。脑卒中的发病率、致残率和死亡率均高，其治疗相当复杂，尤其是最常见的缺血性脑卒中，至今尚无一种公认、普遍适用的治疗方法。

缺血性脑卒中即为广义的脑梗塞，是指突然发生的脑组织局部供血动脉血流灌注减少或血流完全中断，停止供血、供氧、供糖等，使该局部脑组织崩解破坏。大量的临床病理研究显示，缺血性脑卒中不是独立的单一疾病，而是有不同的病因、发病机制、脑部损害程度、临床表现及转归等的一组疾病的总称。实施治疗时所用的方法应有针对性，但在临床上常不自觉地企图用一种模式甚至一种药物来治疗所有的脑梗塞患者。临床实践也证明，一种治疗措施对一部分病人效果明显，而对另一些患者则疗效不好，有的甚至加重病情。由此根据不同病情，研究和制定各种有效的治疗方案备受关注。

目前典型的缺血性脑卒中在临床上可按病程分为三期：急性期、恢复期和后遗症期，其中急性期的治疗对缺血性脑卒中的预后有着决定性的意义，正确的治疗将产生更好的预后。现代公认的缺血性脑损伤理论认为，缺血性脑损伤的病理生理机制主要包括以下环节：兴奋性毒性（数分钟至数小时）、梗死周围去极化（0～12h）、炎症（6～24h）和程序性细胞死亡（24h至数周），它们都由缺血引发，发生在4个不同的时间点，但又重叠并互相联系。此外，临床中缺血性脑卒中患者得到治疗距离发病有一定的时间，而治疗是否及时与疗效密切相关，可见足够的治疗时间窗是缺血性脑卒中药物的关键要求之一。如果能够防止或抑制上述情况的发生，就能为缺血性脑卒中的治疗及预后赢得先机。因此，提供茋类化合物在制备治疗急性期缺血性脑卒中药物的新应用，对缺血性脑卒中的治疗及预后具有重要意义。

发明内容

本发明提供了茋类化合物在制备治疗急性期缺血性脑卒中药物的新应用，即曲札茋苷和白皮杉醇在制备治疗急性期缺血性脑卒中药物的应用。

曲札茋苷，化学名为(E)-1-(3,5-二羟苯基)-2-（3-羟基-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苯基）乙烯或3,5,3',4'-四羟基茋-3'-O-β-葡萄糖苷，因其植物来源拉萨大黄根茎在藏药材中又名曲札（罗达尚主编。新修晶珠本草，四川科学技术出版社，2004），故称该化合物为曲札茋苷，结构如式II所示。

从其结构式中可以看到，曲札茋苷的糖苷取代位于非间位羟基取代的苯环上，这与大黄降脂素、去氧土大黄苷、虎杖苷及何首乌中得到的系列二苯乙烯苷等茋苷类化合物的糖苷取代位置有结构上的差异，且与大黄降脂素、去氧土大黄苷、虎杖苷相比，曲札茋苷具有较多的酚羟基，这些结构上的特性使其具有一些特殊活性。前期研究表明，通过清除DPPH自由基试验发现曲札茋苷的自由基清除能力明显高于大黄降脂素、去氧土大黄苷和虎杖苷，而自由基是缺血再灌注时形成的，是缺血组织损伤的重要根源，抗氧化剂和自由基清除剂可减轻缺血组织的损伤，曲札茋苷强的自由基清除活性使其在保护缺血心脑组织损伤中更具优势。同时，曲札茋苷的药效学试验表明口服曲札茋苷可以明显减少MCAO大鼠脑梗塞范围，使其行为障碍程度得到明显改善，对缺血性心脑血管疾病的具有显著的保护作用。安全性研究表明曲札茋苷安全性良好，急性毒性试验中24小时内单次灌胃小鼠最大给药量为13.33g/kg.bw，比格犬为5g/kg.bw，未见动物出现毒副反应和死亡。遗传毒性试验中未见致染色体畸变、致突变作用。因此，曲札茋苷在预防和治疗心脑缺血方面疾病具有重要的临床应用价值。

随着研究的深入，进一步制备得到曲札茋苷的苷元-白皮杉醇，结构如式III所示，实验表明白皮杉醇具有较强的抗氧化活性，并且对神经细胞具有一定保护作用，作为脑缺血急性期的治疗用药具有很好的前景。

由于典型的缺血性脑卒中在临床上分为急性期、恢复期和后遗症期，其中急性期的治疗对缺血性脑卒中的预后有着决定性的意义，正确的治疗将产生更好的预后。而不同时期的脑部损害程度以及临床表现不同，需要根据不同时期病情研究和制定适合有效的治疗方案。虽然目前通过检测曲札茋苷和白皮杉醇抗氧化活性以及对神经细胞的保护作用证明曲札茋苷和白皮杉醇在预防和治疗心脑缺血方面疾病中的作用，但是无法确认曲札茋苷和白皮杉醇具体适合缺血性脑卒中的哪个时期。

在一个具体实施方式中本发明运用动脉线栓MCAO模型于拔出鱼线再灌注后于不同时间给予曲札茋苷或白皮杉醇，检测曲札茋苷和白皮杉醇对大脑中动脉线栓法（MCAO）致大鼠脑缺血时间窗的影响，然后用过量水合氯醛麻醉处死大鼠后切取右侧大脑组织，精确称量，计算脑组织含水量。结果显示曲札茋苷治疗组除0h给药组，大鼠与模型组比较，神经功能评分无显著性差异(P>0.05)；其余曲札茋苷和白皮杉醇给药组与模型组比较，神经功能评分有显著性差异(P<0.05)。而曲札茋苷和白皮杉醇各治疗组脑含水量较对照组均有不同程度的减轻。结果表明曲札茋苷及白皮杉醇的治疗时间窗可以达到6小时。此外，初步药代动力学研究也发现，大鼠静脉注射给予曲札茋苷或白皮杉醇，5min内即能达到最大血药浓度，也说明了其起效快的作用特点。结果表明在脑缺血发生的早期，通过使用曲札茋苷或白皮杉醇，能够阻断脑缺血病理过程的恶性循环，为后续的治疗占得先机。

在一个具体实施方式中本发明观察了曲札茋苷和白皮杉醇的体外抗氧化作用，结果显示，在清除O^2-、OH·和DPPH·、还原Fe³⁺、抑制邻苯三酚自氧化等方面，Vc、曲札茋苷、白皮杉醇及依达拉奉均表现出较强抗氧化作用，并且曲札茋苷和白皮杉醇的抗氧化活性强于依达拉奉。

H₂O₂是一种活性氧成分，它参与了许多神经系统疾病的发病机制，常用作神经细胞氧化损伤的诱导剂。在另一个具体实施方式中，本发明采用快捷、经济的MTT方法检测细胞存活率，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，从而反映细胞存活率。DMSO能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用微孔板检测仪测定490nm波长吸光度。结果显示，曲札茋苷和白皮杉醇在10μM及100μM浓度时对H₂O₂诱导的PC12细胞损伤有保护作用。

综上所述，曲札茋苷和白皮杉醇在作用时间窗可达到6小时，在大鼠脑缺血发生过程中可以使大鼠脑组织含水量减少，使大鼠神经功能评分改善，其作用机制主要与其较强的抗氧化，清除氧自由基作用，具有脑保护作用有关。而白皮杉醇在体外具有较强的抗氧化，清除氧自由基作用，并且作用强于曲札茋苷。因此本发明提供了式I所示茋类化合物在制备治疗急性期缺血性脑卒中药物中的应用，其中，R为-O-Glu或-OH。即式II所示曲札茋苷和式III所示白皮杉醇在制备治疗急性期缺血性脑卒中药物中的应用。

本发明所述曲札茋苷和白皮杉醇可以通过商业渠道购买得到，也可按照现有制备方法制备得到。其中，所述曲札茋苷可按照实施例1提供的方法制备获得，所述白皮杉醇可按照实施例4提供的方法制备获得。

本发明还提供了一种治疗急性期缺血性脑卒中的药物制剂，由有效量的式I所示化合物即曲札茋苷或白皮杉醇和药学上可接受的辅料组成。本领域技术人员可将所述曲札茋苷或白皮杉醇直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，以常规药物制剂方法，制成常用剂型如口服剂、注射剂等剂型。所述制剂可以通过以下方式中的适合方式给药：局部给药、静脉、肌肉、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选肌注、腹膜内或静脉内用药方式。

本发明所述治疗急性期缺血性脑卒中的药物制剂的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、给药时间、代谢速率、病程严重程度以及诊治医师的主观判断。本领域的技术人员根据上述因素可以容易地决定使用剂量和使用方法。

具体实施方式

本发明实施例公开了茋类化合物在制备治疗急性期缺血性脑卒中药物中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：曲札茋苷的制备

材料：拉萨大黄药材（收购于西藏拉萨地区，批号20110308，含量4.8%），除去杂质，净制，粉碎为粗粉；D101大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料有限公司）按说明书进行预处理。

制备：取拉萨大黄药材粗粉1Kg，按Kg/L计，加8倍体积(W/V)乙醇提取3次，2小时/次，过滤，合并滤液，浓缩至无醇味，加水1L，混合均匀，放置24小时。取上清液约900mL，上D101型大孔吸附树脂（树脂装柱约2000mL），用3倍柱体积的水(V/V)洗脱，再用6倍柱体积的25%乙醇(V/V)洗脱，收集0.5-6倍的乙醇洗脱液，浓缩至干，加入100mL水，混匀，析晶12小时。取析晶溶液，抽滤，得曲札茋苷粗品约30g。

取曲扎茋苷粗品30g，加8倍量水(W/V)，加热搅拌至完全溶解，加入1.5g活性炭，搅拌10分钟，趁热抽滤。滤液自然冷却析晶12小时。取滤液，抽滤，滤饼于40℃减压干燥至干，得曲札茋苷精品26g，编号为20110401。

实施例2：曲札茋苷原料的检验

取实施例1制得的曲札茋苷（编号20110401）适量，按照《中国药典》一部附录I U注射剂项下规定进行检验。

性状：为类白色粉末，味苦。

干燥失重：照2010版《中国药典》一部附录IX G规定，取曲札茋苷，以五氧化二磷为干燥剂，在室温减压干燥至恒重，减失重量为1.2%。

炽灼残渣：照2010版《中国药典》一部附录IX J规定，取曲札茋苷适量，进行检查，炽灼残渣为0.1%。

有关物质：取曲札茋苷适量，按照2010版《中国药典》一部附录IX S规定，取曲札茋苷适量，分别进行检查，蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子均符合要求。

重金属：照2010版《中国药典》一部附录IX E第二法规定，取炽灼残渣项下遗留的残渣进行检查，重金属含量<20ppm。

树脂残留：照2010版《中国药典》二部附录VIII P第二法规定，去三七三醇皂苷进行测定，未检出正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯苯和苯。

含量测定：照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版一部附录VI D）测定。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相A：甲醇，流动相B：5%乙酸水，按表1进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；检测波长为306nm，理论板数按曲札茋苷峰计算，应不低于9000。

表1梯度洗脱条件

对照品溶液的制备：精密称取曲札茋苷对照品适量置于棕色容量瓶中用流动相溶解并稀释配制成每1mL含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取实施例1制得的曲札茋苷约10mg，精密称定，置100mL棕色容量瓶中，用流动相溶解并稀释刻度，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算，即得。

结果显示，按干燥品计算，实施例1制得的曲札茋苷（C₂₀H₂₂O₉）含量为99.2%。

实施例3：曲札茋苷的急性毒性试验

1、实验动物

SPF级ICR小鼠50只(由昆明制药集团实验动物中心提供)，体重18-22g，雌雄各半。实验前置动物于室内适应环境一周，室温18-25℃。采用架式笼养，标准饲料喂养。

2、受试药的制备

实施例1制得的曲札茋苷（编号20110401），用相关辅料配制成40mg/mL的曲札茋苷受试药液。0.45um微孔滤膜过滤备用。

3、实验方法及结果

将50只小鼠称重标记，随机分为曲札茋苷5个不同剂量组（每组10只）。根据预试实验所得结果，曲札茋苷受试药的0%(Dn)和100%(Dm)死亡剂量分别为0.51g和1.13g。由此确定组间比为0.85，5个不同剂量组分别为0.96g/kg，0.80g/kg，0.68g/kg，0.60g/kg，0.51g/kg剂量组。

按不同剂量组分别静脉注射不同剂量的曲札茋苷受试药液。即分别给予曲札茋苷受试药液0.24mL/10g，0.20mL/10g，0.17mL/10g，0.15mL/10g，0.13mL/10g。给药后逐日观察14天，并详细记录其死亡数目、死亡时间及主要毒性反应，按照Bliss法统计LD50值以及95%可信区间，结果见表2~5。

表2各组小鼠的死亡时间与死亡数目

死亡时间	15min	30min	60min	120min	240min	480min
							0.96g/kg剂量组	7	0	0	0	0	0
0.80g/kg剂量组	6	0	0	0	0	0
							0.68g/kg剂量组	3	1	0	0	0	0
0.60g/kg剂量组	1	0	0	0	0	1
							0.51g/kg剂量组	0	0	0	0	0	0

表3各组小鼠主要毒性反应发生率（％）

毒性反应	呼吸困难	紫绀	抽搐	烦躁	昏睡
						0.96g/kg剂量组	70	0	70	70	20
0.80g/kg剂量组	60	0	60	60	20
						0.68g/kg剂量组	40	0	40	40	10
0.60g/kg剂量组	10	0	10	10	10
						0.51g/kg剂量组	0	0	0	0	0

表4各组小鼠给药及死亡数目(n=10)

组别	鼠数（n）	剂量（g/kg）	死亡数(只)	死亡率(%)
					0.96g/kg剂量组	10	0.96	7	70
0.80g/kg剂量组	10	0.80	6	60
					0.68g/kg剂量组	10	0.68	4	40
0.60g/kg剂量组	10	0.60	2	20
					0.51g/kg剂量组	10	0.51	0	0

表5曲札茋苷LD50以及95%可信限

Prob(概率)	Dose(剂量)	Lower	Upper
				0.01	408.61141	196.22383	511.01990
0.05	493.07046	296.51025	581.46189
				0.10	545.01549	368.12882	625.22564
0.15	583.12007	424.62808	658.69702
				0.20	615.29553	474.08214	688.84919
0.25	644.31048	519.08757	718.55537
				0.30	671.53103	560.56752	749.73896
0.35	697.78043	598.72825	784.04880
				0.40	723.63668	633.53924	822.96183
0.45	749.56446	665.09725	867.69599
				0.50	775.98801	693.81755	919.19534
0.55	803.34303	720.39272	978.32719
				0.60	832.12667	745.64113	1046.22024
0.65	862.96112	770.40403	1124.64328
				0.70	896.69332	795.54544	1216.47500

从试验结果看，曲札茋苷注射受试药液的LD50为775.99mg/kg，其95%可信区间为693.82-919.20mg/kg(P=0.95)，表明实施例1制得的曲札茋苷的安全性较高。

实施例4：白皮杉醇的制备

在氮气保护下，将3,5-二甲氧基苄基磷酸二乙酯245g（0.85mol）加入到2.5L二甲基甲酰胺溶液中，再分次加入叔丁基醇钾95.4g（0.85mol），控制温度在0℃，搅拌1小时，然后逐滴加入3,5-二甲氧基苯甲醛(CASNo:120-14-9)120g（0.72mol），加完后在室温下搅拌1小时。TLC（石油醚V:乙酸乙酯V=1:4）监测反应进度。反应完毕时，保持搅拌，缓慢加入4L冰水，产生大量沉淀。加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥。将有机层减压浓缩至干，得到淡黄色固体粗品。固体粗品用石油醚洗涤，抽滤，滤饼干燥后为白色固体，减压干燥至干，得到白色干燥固体，即3,4,3',5'-四甲氧基二苯乙烯175g。

在氮气保护下，取3,4,3',5'-四甲氧基二苯乙烯120.4g（0.4mol）溶解于无水二氯甲烷溶液中，逐滴加入三溴化硼601.4g（0.85mol）的无水二氯甲烷溶液，保持温度恒定为-30℃，滴加完毕后，在室温下搅拌2小时，HPLC监测反应进度。当反应到达终点，继续搅拌，缓慢加入4L冰水，大量沉淀析出。抽滤，用水洗涤滤饼。将滤饼溶解于乙酸乙酯中，并以水洗涤。有机层减压浓缩至干，得到粉红色固体粗品，粗品加入乙酸乙酯和石油醚搅拌，大量沉淀析出，过滤，滤饼再以乙酸乙酯V:石油醚V(1:3)的混合液洗涤滤饼，抽滤，干燥，得白皮杉醇固体61g，编号为20110601。

实施例5：白皮杉醇的检测

取实施例4制备的白皮杉醇（20110601）进行高效液相色谱鉴别：色谱条件，乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长254nm，柱温30℃。洗脱条件如表6所示。

表6实施例3制备的白皮杉醇的洗脱条件

结果以面积归一法计算，白皮杉醇纯度为99%。

实施例6：曲札茋苷及白皮杉醇对大脑中动脉线栓法（MCAO）致大鼠脑缺血时间窗的影响

1、实验动物

SD大鼠(由昆明制药集团实验动物中心提供)，体重236±10g，雌雄各半。实验前置动物于室内适应环境一周，室温18-25℃。标准饲料喂养，正常饮水，普通光照。

2、动物分组：将大鼠称重标记，随机分为曲札茋苷组、白皮杉醇组、模型组及假手术组四个大组，每大组又分为0、1、2、3、4、6小时不同给药组，每组10只。

3、实验方法：实验动物腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉，颈部正中切口，分离皮下组织，游离左侧颈动脉及分支，确认颈总动脉、颈外动脉并予以结扎，在颈内动脉近端夹一动脉夹，在颈总动脉近心端端作血管切口，将直径为0.234mm鱼线自颈总动脉切口插入，松开动脉夹，直视下鱼线自动脉分支处插入颈内动脉约18±0.5mm阻塞大脑中动脉入口。鱼线保留180分钟，缺血结束后拔出鱼线，沿全层缝合切口。手术过程中予以照射灯保持动物体温在37±0.5℃，并监测肛温、呼吸及心率，分别于0、1、2、3、4、6小时给药。假手术组：假手术组鱼线插入深度为8-10mm，其余操作同模型组。模型组及假手术组于相同时间点给予相同体积的生理盐水。曲札茋苷组及白皮杉醇组：手术步骤同模型组，于拔出鱼线再灌注后于0、1、2、3、4、6小时经尾静脉给予30mg/kg实施例1制备的曲札茋苷或实施例4制备的白皮杉醇。

参照Zea Longa的5分法对神经功能缺损进行评分，评分标准如下:

0分：无神经功能缺损症状；

1分：轻度局灶性神经功能缺损，即提尾悬空不能伸展左侧前爪

2分：中度局灶性神经功能缺损，即行走向左侧转圈；

3分：中度局灶性神经功能缺损，即行走困难，向左侧倾倒；

4分：不能自发行走，意识水平下降。

造模成功标准：动物第一次评分为1~3分者，视为造模成功，可用于实验。统计各组实验结果见表7。

然后用过量水合氯醛麻醉处死大鼠后切取右侧大脑组织，精确称量，120℃恒温干燥箱烘烤48h至恒重，称干重，计算脑组织含水量。计算公式为：含水量(%)=[(湿重-干重)／湿重]×100%。统计结果见表8。

表7不同时间大鼠神经功能缺损评分

组别	例数	假手术组	模型组	曲札茋苷组	白皮杉醇组
						0小时	10	-	2.4±1.17	2.3±1.05	1.5±1.160*
1小时	10	-	2.2±1.03	1.3±0.95*	1.2±0.91*
						2小时	10	-	2.1±1.29	1.2±1.23*	1.1±0.74*
3小时	10	-	2.2±1.75	1.2±0.88*	1.0±0.92*
						4小时	10	-	1.9±0.94	1.1±1.01*	0.9±1.24*
6小时	10	-	1.8±1.07	1.1±0.74*	0.9±0.84*

注：与空白对照组相比，*P<0.05

由表7结果可见，曲札茋苷0h给药组，大鼠与对照组比较，神经功能评分无显著性差异(P>0.05)；其余曲札茋苷和白皮杉醇给药组与对照组比较，神经功能评分均有显著性差异(P<0.05)。

表8大鼠脑组织含水量测定结果

组别	假手术组	模型组	曲札茋苷组	白皮杉醇组
					0小时	78.74±0.13	84.36±0.66##	84.14±0.06	81.62±0.02*
1小时	78.56±0.62	84.57±0.36##	81.22±0.26*	80.38±0.32**
					2小时	78.52±0.80	85.02±0.18##	81.54±0.37*	80.15±0.56**
3小时	79.08±0.74	84.18±0.54##	82.22±0.56*	80.64±0.22**
					4小时	79.24±0.22	84.16±0.44##	81.88±0.84*	79.68±0.16**
6小时	78.88±0.56	85.36±0.28##	81.20±0.18*	80.28±0.78**

注：与模型组比较:*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较:#P<0.05，##P<0.01

由表8结果可见，各治疗组脑含水量较对照组均有不同程度的减轻。结果表明，曲札茋苷及白皮杉醇治疗组均能显著缓解脑水肿，时间窗可以达到6小时。

实施例7：曲札茋苷和白皮杉醇体外抗氧化作用研究

一、试剂与设备

1、供试品：实施例1制备的曲札茋苷（批号20110401）；实施例4制备的白皮杉醇白皮杉醇（批号20110601）；依达拉奉，国药集团化学试剂有限公司，批号：20110307；L-抗坏血酸（Vc），石药集团维生药业（石家庄）有限公司，批号：1110652095。

2、试剂：吩嗪硫酸甲酯（PMS），北京鼎国生物技术有限责任公司，Gneview分装，MW306.3，Lot：7B310210；还原型辅酶Ⅰ（NADH），BIO BASICINC.Lot:MC0112B5011M，CAS#606-68-8，MW763.40，Exp：12/12；硝基四唑氮蓝（NBT），FeSO4，国药集团化学试剂有限公司，批号：20110223，MW278.02；水杨酸，天津市北方天医化学试剂厂，MV138.12，批号：2006903B；铁氰化钾（K3Fe（CN）6），成都市联合化工试剂研究所，MV329.25；Fecl3，天津化学试剂三厂，MV270.3，批号：0011218；三氯乙酸（TCA），上海山浦化工有限公司，AR，MV163.39；FeCl3，天津市化学试剂三厂，MV270.30，批号：0011218；焦性没食子酸（邻苯三酚），天津市博迪化工有限公司，MV126.11，批号：20071115；二苯代苦味肼自由基（DPPH），ALDRICH，Lot＃MKBG6146V，257621-100mg，MW619.75；苯酚，AR，生工生物工程（上海）有限公司，Lot：LJ0607S10010J；4－氨基安替比林（4-AA），生工生物，Lot：LJ0422B1011Z；过氧化物酶（辣根），上海源叶生物科技有限公司，BR，Activity≥300U/mg，Exp：2013/12；DMSO，GC，99.5%，Sigma，083K0135；其他试剂均为国产AR。

3、试验设备：PowerWave XS2全波长酶标仪，BioTek；UB-7型pH计，丹佛仪器（北京）有限公司；AC211S电子分析天平，Sartorius；CHA-S气浴恒温振荡器，金坛市精达仪器制造厂；电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；200～1000μL单道微量移液器，Finnpipette；10～100μL单道微量移液器，0.5～10μL、10～50μL 8道微量移液器，Eppendorf；50～300μL 8道微量移液器，BioScience；其它玻璃仪器及耗材。

二、方法

1、对O^2-·清除能力测定

将供试品分别用10%DMSO对倍稀释至适宜浓度，采用PMS-NADH-NBT体系加入各试剂，混匀后置室温避光反应5min，于酶标仪测定各孔560nm处OD值；

2、总还原能力（TOC）测定

将供试品分别用10%DMSO对倍稀释至适宜浓度，采用FeCl₃还原法依次加入试剂，混匀后于酶标仪测定各孔700nm处OD值。

3、对邻苯三酚自氧化的抑制作用测定

将供试品分别用10%DMSO对倍稀释至适宜浓度，按邻苯三酚自氧化反应体系依次加入各种试剂，混匀后室温反应10min，ddH₂O调零，于酶标仪测定各孔325nm处OD值。

4、对DPPH·的清除能力测定

将供试品分别用10%DMSO对倍稀释至适宜浓度，按DPPH反应体系加入试剂，混匀后室温避光反应15min，50%EtOH调零，于酶标仪测定各孔555nm处OD值。

5、对OH·的清除能力测定

将供试品分别用10%DMSO对倍稀释至适宜浓度，采用POD-AA-Phenol显色体系加入各种试剂，混匀后37℃反应15min，H₂O调零，于酶标仪测定各孔505nm处OD值。

三、结果

1、对O^2-·清除作用

统计不同浓度供试品对O^2-·的清除能力，结果见表9。

表9对O^2-·的清除作用

名称	IC50（μM）	与Vc相比
			Vc	94.33
依达拉奉	3381.59	1/35
			曲札茋苷	372.36	1/4
白皮杉醇	5.91	16

表9结果显示，与Vc相比，白皮杉醇对O^2-·的清除作用最强，约为Vc的16倍，曲札茋苷及依达拉奉消除作用均比Vc弱，强度依次为曲札茋苷和依达拉奉。

2、总还原能力（TOC）

以FeSO₄溶液在体系中与K₃Fe(CN)₆的呈色反应制作标准曲线，见表10，各供试品的还原能力见表11。

表10不同浓度FeSO₄与K₃Fe(CN)₆的呈色反应

表11各供试品对Fe^3＋的还原作用（TOC）

名称	EC50（μM）	与Vc相比
			Vc	8.16
依达拉奉	20.56	1/2.5
			曲札茋苷	3.17	2.6
白皮杉醇	1.73	4.7

表11结果显示，与Vc相比，白皮杉醇还原能力较强，约为Vc的4～5倍，曲札茋苷约为Vc的2～3倍，依达拉奉仅为Vc的1/2～1/3。

3、对邻苯三酚自氧化的抑制作用

在弱碱性条件下，邻苯三酚迅速发生自氧化，在325nm处有最大吸收，若供试品具有抗氧化作用，即可抑制邻苯三酚发生自氧化，反应体系吸收降低。统计结果见表12。

表12对邻苯三酚自氧化的抑制作用

名称	IC50（μM）	与Vc相比
			Vc	45.26
依达拉奉	1472.84	1/32.5
			曲札茋苷	139.78	1/3.1
白皮杉醇	151.57	1/3.35

由表12结果可见，曲札茋苷及白皮杉醇的活性较强，约为Vc的1/3；依达拉奉活性仅为Vc的1/30。

4、对DPPH·的清除作用

各供试品对DPPH·的清除能力见表13。与Vc相比，白皮杉醇约为Vc的1/4；依达拉奉约为Vc的1/8；曲札茋苷约为Vc的1/40。

表13对DPPH·的清除作用

名称	IC50（μM）	与Vc相比
			Vc	29.05
依达拉奉	240.32	1/8.3
			曲札茋苷	1252.32	1/43
白皮杉醇	129.83	1/4.5

5、对OH·的清除作用

各供试品对OH·清除能力见表14。与Vc相比，白皮杉醇表现出较强的OH·清除能力，作用约为Vc的1.3倍；曲札茋苷约为Vc的1/3.5；依达拉奉仅为Vc的1/10。

表14对OH·的清除作用

名称	IC50（μM）	与Vc相比
			Vc	41.53
依达拉奉	409.40	1/10
			曲札茋苷	149.08	1/3.5
白皮杉醇	31.51	1.3

综上所述，在清除O^2－、OH·和DPPH·、还原Fe^3＋、抑制邻苯三酚自氧化等方面，Vc、曲札茋苷、白皮杉醇及依达拉奉均表现出较强抗氧化作用，并且曲札茋苷和白皮杉醇的抗氧化活性强于依达拉奉。

实施例8：曲札茋苷和白皮杉醇对过氧化氢诱导的PC12细胞损伤模型的神经保护作用研究

H₂O₂是一种活性氧成分，它参与了许多神经系统疾病的发病机制，常用作神经细胞氧化损伤的诱导剂。本实验采用快捷、经济的MTT方法检测细胞存活率，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，从而反映细胞存活率。DMSO能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用微孔板检测仪测定490nm波长吸光度。

1、样品处理

取曲札茋苷、白皮杉醇及依达拉奉，分别用DMSO配成浓度为100mM贮备液。临用前稀释至100μM及1mM。

2、试验方法

PC12细胞经消化后，悬于含10%新生牛血清的DMEM培养液中。以8×10⁴cells/mL的密度将PC12细胞接种于96孔培养板上，接种体积为100μL/孔，置于含5%CO₂的37℃恒温培养箱内培养。PC12细胞培养24小时后，将各组的培养液均换成新鲜DMEM培养液。在给药组中加入相应浓度的待测化合物(10μL/well)，正常对照组和H₂O₂损伤组加入化合物溶剂对照(10μL/well)。孵育2小时后，在给药组与H₂O₂损伤组中分别加入3mM H₂O₂(10μL/well)，终浓度为300μM。继续培养24小时后，加入5mg/mL MTT(10μL/well)，进行活细胞染色。孵育3小时后，弃去培养液，加入100%DMSO(100μL/well)，并在摇板机上振摇使之充分溶解。490nm的波长下测定各组的OD值，结果见表15。其中，表中细胞存活率=平均值(Mean）±标准差(SEM），正常对照组存活率设为100%，其余各组为与正常组相比的百分值。

表15对H₂O₂诱导的PC12细胞损伤的保护作用

注：##p<0.01相比于正常对照组；*p<0.05，**p<0.01相比于H₂O₂损伤组。

由表15结果可见，曲札茋苷和白皮杉醇在10μM及100μM浓度时对H₂O₂诱导的PC12细胞损伤有保护作用。

从上述实施例看，曲札茋苷及白皮杉醇作用时间窗可达到6小时，在大鼠脑缺血发生过程中可以使大鼠脑组织含水量减少，使大鼠神经功能评分改善，其作用机制主要与其较强的抗氧化，清除氧自由基作用，具有脑保护作用有关。而白皮杉醇在体外具有较强的抗氧化，清除氧自由基作用，并且作用强于曲札茋苷。因此该类化合物作为新型脑缺血急性期治疗用药，具有较高的应用价值和开发前景。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的应用及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.式I所示化合物在制备治疗急性期缺血性脑卒药物中的应用，

其中，R为-O-Glu或-OH。

2.一种治疗急性期缺血性脑卒中的药物制剂，其特征在于，由有效量的式I所示化合物和药学上可接受的辅料组成，

其中，R为-OH或-O-Glu。

3.根据权利要求2所述药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为口服剂和注射剂。