CN1199682C - 一种四逆散的有效部位及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种抗抑郁药物组合物及其制备方法，该药物组合物主要包括异甘草素、甘草素、甘草苷、新橙皮苷、橙皮苷、异甘草苷、5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、5，7-二羟基香豆素、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、甘草酸11个化合物。该药物组合物首先是由四逆散水煎液通过大孔吸附树脂纯化分离制成抗抑郁活性部位，然后采用各种溶剂分离方法和色谱分离技术，分离出本药物组合物的各个组分。该药物组合物具有良好的抗抑郁作用。

Description

一种四逆散的有效部位及其制备方法

发明领域

本发明涉及一种药物组合物及其制备方法，特别是涉及一种抗抑郁的药物组合物及其制备方法。

背景技术

随着多种应急因素的加剧，抑郁症已成为现代社会的常见病和高发病，其发病率正在快速攀升。据不完全统计，目前全世界抑郁症患者已占世界人口的3～5％。WHO预测，到2005年，抑郁症发病率将达到总人口的10％，抑郁症在21世纪造成社会最沉重负担的疾病中居第2位。目前临床使用的抗抑郁药主要有三环类、5-HT再摄取抑制剂、5-HT-NE再摄取抑制剂和单胺氧化酶-A抑制剂等，但因为抑郁症发病机理比较复杂，诱发因素较多，上述仅针对某单一环节的药物往往难以取得满意疗效。同时这些药物存在抗抑郁谱窄、副作用大、易复发等缺陷。近年来，国内外在抗抑郁药的研制与开发方面越来越注重传统药物。但目前从纯中药制剂中分离出具有抗抑郁活性的药物有效部位及活性成分的方法及相关制剂并不多见。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗抑郁的药物组合物；本发明的目的还在于提供一种抗抑郁药物组合物的制备方法。

本发明药物组合物主要包括如下化合物，各组份及配比如下(按重量份)：

异甘草素8-12重量份       甘草素15--25重量份

甘草苷25--35重量份       新橙皮苷3200--3400重量份

橙皮苷70--90重量份       异甘草苷2--6重量份

5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷1-5重量份5，7-二羟基香豆素3-8重量份  柴胡皂苷c 8--16重量份  柴胡皂苷d12-18重量份  甘草酸20--40重量份

按药剂学方法，可以将本发明药物组合物制备成多种临床药物剂型，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂当中的一种；所说的非肠道给药剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种。

本发明药物还可加入常规的药物赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂等。

本发明药物组合物的制备方法：

按6∶6∶6∶9的比例称取柴胡、炙甘草、枳实、白芍，将4味药混合均匀，加水煎煮2～3次，合并各次水煎液，浓缩，通过弱极性的大孔吸附树脂进行吸附，待水煎液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用30～80％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，即得到复方中药抗抑郁活性部位；将抗抑郁活性部位，通过聚酰胺柱，用水、25～35％乙醇水溶液、45～55％乙醇水溶液和65～75％乙醇水溶液依次进行洗脱，各部分洗脱液减压回收溶剂后，分别得到水洗脱物A，25～35％乙醇洗脱物B，45～55％乙醇洗脱物C，65～75％乙醇洗脱物D；

甘草苷的制备可以采用以下的一种或几种方法：

C用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中80～85∶20～15的氯仿-甲醇洗脱部分，经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以6～8∶4～2混合溶剂洗脱，得到甘草苷；

B加水分散后，依次用氯仿萃取4～6次，醋酸乙酯萃取4～8次，正丁醇萃取6～10次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；乙酸乙酯部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中78～85∶22～15的氯仿-甲醇洗脱部分，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以7～9∶1混合溶剂洗脱，得到甘草苷；

异甘草素的制备方法：

C用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中85-95∶15-5的氯仿-甲醇洗脱部分，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以7-9∶1混合溶剂洗脱，得到异甘草素；

异甘草苷的制备方法：

B加水分散后，依次用氯仿萃取4～6次，醋酸乙酯萃取4～8次，正丁醇萃取6～10次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；乙酸乙酯部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中80-85∶20-15的氯仿-甲醇洗脱部分，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以7-9∶1混合溶剂洗脱，得到异甘草苷；

甘草素的制备方法：

D用硅胶柱层析分离，6-9∶1-3的氯仿-醋酸乙酯混合溶剂洗脱，共收集54份；其中第9～11份合并后，经聚酰胺柱层析分离，7-9∶1的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，得到甘草素；

新橙皮苷的制备可以采用以下的一种或几种方法：

C用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中75-85∶25-15的氯仿-甲醇洗脱部分，经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以80-90∶20-10混合溶剂洗脱，共收集45份；第22～34份合并后，经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以6-9∶1-3混合溶剂洗脱，得到新橙皮苷；

B加水分散后，依次氯仿萃取4～6次，醋酸乙酯萃取4～8次，正丁醇萃取6～10次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；乙酸乙酯部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中75-80∶15-20的氯仿-甲醇洗脱部分，经重结晶处理，得到新橙皮苷；

B加水分散后，依次用氯仿萃取4～6次，醋酸乙酯萃取4～8次，正丁醇萃取6～10次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；正丁醇部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以混合溶剂梯度洗脱，其中70-80∶30-20的氯仿-甲醇洗脱部分，经重结晶处理，得到新橙皮苷；

A加水分散后，用正丁醇萃取6-10次，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分，正丁醇部分用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水混合梯度洗脱，依次分为14个部分；其中部分4用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以7-9∶1混合溶剂洗脱得到新橙皮苷；

橙皮苷的制备方法：

A加水分散后，用正丁醇萃取6-10次，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分，正丁醇部分用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水混合梯度洗脱，依次分为14个部分，部分5用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以9-12∶1混合溶剂洗脱得到橙皮苷；

5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的制备方法：

B加水分散后，依次用氯仿萃取4～6次，醋酸乙酯萃取4～8次，正丁醇萃取6～10次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；乙酸乙酯部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合梯度洗脱，其中80-90∶20-10的氯仿-甲醇洗脱部分，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以7-9∶1混合溶剂洗脱，得到5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-葡萄糖苷；

5，7-二羟基香豆素的制备方法：

C用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合梯度洗脱，其中85-90∶15-10的氯仿-甲醇洗脱部分，经硅胶柱层析分离，氯仿-醋酸乙酯以6-9∶4-1混合溶剂洗脱，得到5，7-二羟基香豆素；

柴胡皂苷c、柴胡皂苷d的制备方法：

A加水分散后，用正丁醇萃取6-10次，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分，正丁醇部分用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水混合梯度洗脱，部分9～11合并，经Sephadex LH-20柱层析分离，90-95％乙醇洗脱，得到柴胡皂苷c，柴胡皂苷d；

甘草酸的制备方法：

A加水分散后，用正丁醇萃取6-10次，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分，正丁醇部用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水混合梯度洗脱，依次分为14个部分；部分14经Sephadex LH-20柱层析分离，90-95％乙醇洗脱，得到甘草酸；

本药物组合物具有很好的抗抑郁作用，效果明显，抗抑郁谱宽、副作用小、不易复发。

实验例1：对上述11个化合物的理化常数进行了测定，并采用波谱学方法确定了结构。

甘草苷 白色结晶粉末，mp257～258℃，分子式C₂₁H₂₂O₉。UVλ_maxnm：276nm。¹HNMR(DMSO-d₆)δppm：10.58(1H，S，7-OH)，7.60(1H，d，J＝8.7Hz，5-H)，7.43(2H，d，J＝8.7Hz，2′6′-H)，7.05(2H，d，J＝8.7Hz，3′5′-H)，6.50(1H，dd，J＝8.7，2.1Hz，6-H)，6.34(1H，d，J＝2.1Hz，8-H)，5.52(1H，d，d，J＝2.7，12.8Hz，2-H)，4.87(1H，d，J＝6.9Hz，1″-H)，3.47～3.08(sugarH)，2.66(1H，dd，J＝2.7，19.8Hz，3-Hcis)。¹³CNMR(DMSO-d₆)δppm：78.7(2-C)，43.2(3-C)，190.0(4-C)，128.4(5-C)，110.6(6-C)，164.6(7-C)，102.6(8-C)，163.1(9-C)，113.5(10-C)，132.3(1′-C)，128.0(2′-C)，116.1(3′-C)，157.4(4′-C)，116.1(5′-C)，128.0(6′-C)，100.3(1″-C)，73.2(2″-C)，76.6(3″-C)，69.7(4″-C)，77.1(5″-C)，60.7(6″-C)。

异甘草素 橙黄色颗粒状物质，mp188～190℃(MeOH)，分子式C₁₅H₁₂O₄。UVλ_maxnm：368nm。¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δppm：13.60(1H，S，2′-OH)，10.67(1H，S，4′-OH)，10.12(1H，S，4-OH)，8.15(1H，d，J＝8.7Hz，6′-H)，7.74(4H，m，2，6，α，β-H)，6.82(2H，d，J＝9Hz，3，5-H)，6.39(1H，dd，J＝2.1，8.7Hz，5′-H)，6.26(1H，d，J＝2.1Hz，3′-H)。¹³CNMR(75MHzDMSO-d₆)δppm：191.5(C＝O)，117.4(α-C)，144.3(β-C)，125.7(1-C)，131.2(2-C)，115.8(3-C)，160.3(4-C)，115.8(5-C)，131.2(6-C)，113.0(1′-C)，165.8(2′-C)，102.6(3′-C)，164.9(4′-C)，108.1(5′-C)，132.9(6′-C)。

异甘草苷 黄绿色丝状结晶，mp187～189℃(MeOH)，分子式C₂₁H₂₂O₉。UVλ_maxnm：359nm。¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δppm：13.53(1H，S，2′-OH)，10.72(1H，S，4′-OH)，8.20(1H，d，J＝9.3Hz，6′-C)，7.80(4H，m，2，6，α，β-H)，7.09(2H，d，J＝9Hz，3，5-H)，6.39(1H，dd，J＝2.4，9.3Hz，5′-H)，6.26(1H，d，J＝2.4Hz，3′-H)，4.97(1H，d，6.9Hz，1″-H)，5.37(1H，d，J＝4.2Hz)，5.14(1H，S)，5.07(1H，d，J＝5.7Hz)，4.61(1H，S，葡萄糖上的OH峰)，3.34(m)为糖上的H。¹³CNMR(75MHz，DMSO-d₆)δppm：191.6(C＝O)，119.1(α-C)，143.6(β-C)，128.4(1-C)，130.9(2-C)，116.5(3-C)，159.5(4-C)，116.5(5-C)，130.9(6-C)，113.0(1′-C)，165.2(2′-C)，102.6(3′-C)，165.9(4′-C)，108.2(5′-C)，133.1(6′-C)，99.9(1″-C)，73.2(2″-C)，76.6(3″-C)，69.7(4″-C)，77.2(5″-C)，60.7(6″-C)。

甘草素 白色针状簇晶，mp207～208℃(MeOH)，分子式C₁₅H₁₂O₄。UVλ_maxnm：231nm，275nm，310nm。¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δppm：10.56(1H，S，7-OH)，9.56(1H，S，4′-OH)，7.63(1H，d，J＝8.7Hz，5-H)，7.30(2H，d，J＝8.4Hz，2′，6′-H)，6.78(2H，d，J＝8.4Hz，3′，5′-H)，6.50(1H，dd，J＝8.7，2.4Hz，6-H)，6.31(1H，d，J＝2.4Hz，8-H)，5.42(1H，dd，J＝2.7，12.0Hz，2-H)，3.10(1H，dd，J＝12.0，17.0Hz，3-Htrans)，2.60(1H，dd，J＝17.0，2.7Hz，3-Hcis)。¹³CNMR(DMSO-d₆)δppm：79.0(2-C)，43.1(3-C)，190.1(4-C)，128.4(5-C)，110.5(6-C)，164.6(7-C)，102.5(8-C)，163.2(9-C)，113.5(10-C)，129.3(1′-C)，128.3(2′-C)，115.1(3′-C)，157.6(4′-C)，115.1(5′-C)，128.3(6′-C)。

新橙皮苷(Neohesperidin)白色针状结晶，mp240～242℃(MeOH)，分子式C₂₈H₃₄O₁₅，HCl-Mg反应阳性。UVλ_maxnm：284nm。¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δppm：12.03(1H，S，5-OH)，9.13(1H，S，3′-OH)，6.91(3H，m，2′，5′，6′-H)，6.09(1H，d，J＝2Hz，8-H)，6.07(1H，d，J＝2Hz，6-H)，5.50(1H，dd，J＝2.7，12.3Hz，2-H)，4.49(1H，d，J＝5.7Hz，1-H)，3.76(3H，S，OCH₃)，3.72～3.14(sugar H)，2.77(1H，dd，J＝17.4，2.7Hz，3-Hcis)，1.14(3H，d，J＝6Hz，Rha-6-CH₃)。¹³CNMR(DMSO-d₆)δppm：78.4(2-C)，42.2(3-C)，197.1(4-C)，162.6(5-C)，96.3(6-C)，164.8(7-C)，95.1(8-C)，162.6(9-C)，103.3(10-C)，130.9(1′-C)，114.1(2′-C)，146.5(3′-C)，148.0(4′-C)，112.0(5′-C)，117.8(6′-C)，100.4(1″-C)，76.9(2″-C)，76.1(3″-C)，69.6(4″-C)，77.1(5″-C)，60.4(6″-C)，97.3(1′″-C)，70.4(2-C)，70.5(3-C)，71.8(4-C)，68.3(5-C)，18.1(6-C)，55.7(OCH₃)。

橙皮苷(Hesperidin)白色结晶性粉末，mp258～260℃(MeOH)，分子式C₂₈H₃₄O₁₅，HCl-Mg反应阳性。UVλ_maxnm：284nm。¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δppm：12.02(1H，S，5-OH)，9.11(1H，S，3′-OH)，6.94(3H，m，2′，5，′6′-H)，6.13(2H，m，6，8-H)，5.56(1H，dd，J＝3.3，12.3Hz，2-H)，4.98(1H，d，J＝7.5Hz，1″-H)，  4.52(1H，S，1-H)，3.78(3H，S，OCH₃)，3.63～3.27(sugar H)，2.75(1H，dd，J＝17.1，3.3Hz，3-Hcis)，1.08(3H，d，J＝6.2Hz，Rha-6-CH₃)。¹³CNMR(DMSO-d₆)δppm：79.2(2-C)，42.9(3-C)，197.9(4-C)，163.9(5-C)，97.2(6-C)，166.0(7-C)，96.4(8-C)，163.4(9-C)，104.2(10-C)，131.7(1′-C)，115.0(2′-C)，147.3(3′-C)，148.7(4′-C)，112.9(5′-C)，118.8(6′-C)，101.5(1″-C)，73.8(2″-C)，76.3(3″-C)，70.4(4″-C)，77.0(5″-C)，66.9(6″-C)，100.3(1-C)，71.1(2-C)，71.5(3-C)，72.9(4-C)，69.2(5-C)，18.7(6-C)，56.5(OCH₃)。

5，3′-二羟基-4′-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖  白色块状固体，分子式C₂₂H₂₄O₁₁。¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δppm：12.04(1H，S，5-OH)，9.13(1H，S，3′-OH)，6.91(3H，m，2′，5′，6′-H)，6.12(2H，m，6，8-H)，5.49(1H，dd，J＝3.3，12Hz，2-H)，4.95(1H，d，J＝7.2Hz，1″-H)，3.76(3H，S，OCH₃)，3.72～3.12(sugar H)，2.75(1H，dd，J＝17.1，3.3Hz，3-Hcis)。¹³CNMR(DMSO-d₆)δppm：78.5(2-C)，42.2(3-C)，197.1(4-C)，162.9(5-C)，96.5(6-C)，165.3(7-C)，95.5(8-C)，162.6(9-C)，103.3(10-C)，130.9(1′-C)，114.2(2′-C)，146.5(3′-C)，148.0(4′-C)，112.0(5′-C)，118.0(6′-C)，99.5(1″-C)，73.0(2″-C)，76.3(3″-C)，69.5(4″-C)，77.1(5″-C)，60.5(6″-C)，55.7(OCH₃)。

5，7-二羟基香豆素  白色针状结晶，分子式C₉H₆O₄，365nm紫外灯下呈强天蓝色荧光。UVλ_maxnm：331nm。¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δppm：10.6(1H，S，5-OH)，10.4(1H，S，7-OH)，7.93(1H，d，J＝9.6Hz，4-H)，6.24(1H，d，J＝2.1Hz，8-H)，6.16(1H，d，J＝2.1Hz，6-H)，6.02(1H，d，J＝9.6Hz，3-H)。¹³CNMR(DMSO-d₆)δppm：162.0(2-C)，108.6(3-C)，139.6(4-C)，156.4(5-C)，98.2(6-C)，160.7(7-C)，94.0(8-C)，155.9(9-C)，101.6(10-C)。

柴胡皂苷c  白色无定形粉末，mp204～209℃，分子式C₄₈H₇₈O₁₈。FAB-MS(m/z)：965(M⁺+K)，439，421。¹HNMR(300MHz，C₅D₅N)δppm：5.96(1H，d，J＝11Hz，H-12)，5.63(1H，dd，J＝11Hz，3Hz，H-11)，4.81(1H，d，J＝9Hz，1‘″-H)，4.62(1H，d，J＝9Hz，1‘′-H)，4.39(1H，d，J＝8Hz，1′-H)，1.65(3H，d，6“-H)，1.35(3H，s)，1.28(3H，s)，1.14(3H，s)，0.96(3H，s)，0.95(3H，s)，0.91(3H，s)，0.85(3H，s)。¹³CNMR(C₅D₅N)δppm：38.5(1-C)，26.5(2-C)，89.1(3-C)，39.7(4-C)，55.3(5-C)，18.5(6-C)，31.9(7-C)，42.2(8-C)，  52.9(9-C)，36.3(10-C)，132.1(11-C)，131.2(12-C)，84.0(13-C)，45.7(14-C)，36.1(15-C)，64.1(16-C)，47.0(17-C)，52.2(18-C)，37.8(19-C)，31.7(20-C)，34.7(21-C)，25.8(22-C)，27.9(23-C)，16.4(24-C)，17.9(25-C)，20.0(26-C)，20.9(27-C)，73.0(28-C)，33.8(29-C)，23.9(30-C)，106.7(1′-C)，75.6(2′-C)，76.8(3′-C)，79.9(4′-C)，75.2(5′-C)，69.1(6′-C)，103.0(1″-C)，72.7(2″-C)，72.6(3″-C)，73.9(4″-C)，70.6(5″-C)，18.2(6″-C)，105.2(1‘″-C)，74.8(2‘″-C)，78.5(3‘″-C)，71.4(4‘″-C)，78.4(5‘′′-C)，62.6(6‘″-C)。

柴胡皂苷d  白色无定形粉末，mp212~216℃，分子式C₄₂H₆₈O₁₃。FAB-MS(m/z)：819(M⁺+K)，455。¹HNMR(300MHz，C₅D₅N)δppm：6.27(1H，br.s，OH)，6.03(1H，d，J＝11Hz，H-12)，5.69(1H，dd，J＝11Hz，3Hz，H-11)，5.33(1H，d，J＝8Hz，1″-H)，4.97(1H，d，J＝8Hz，1′-H)，1.62(3H，s)，1.43(3H，s)，1.42(3H，s)，1.35(3H，s)，1.02(3H，s)，0.95(3H，s)，0.93(3H，s)。¹³CNMR(C₅D₅N)δppm：38.7(1-C)，26.1(2-C)，81.7(3-C)，43.8(4-C)，47.4(5-C)，18.1(6-C)，31.9(7-C)，41.9(8-C)，53.1(9-C)，36.3(10-C)，132.0(11-C)，132.0(12-C)，85.3(13-C)，43.6(14-C)，35.5(15-C)，77.2(16-C)，45.4(17-C)，51.4(18-C)，38.4(19-C)，31.6(20-C)，36.8(21-C)，31.3(22-C)，64.1(23-C)，13.1(24-C)，18.9(25-C)，19.6(26-C)，18.1(27-C)，77.8(28-C)，33.8(29-C)，24.4(30-C)，106.9(1′-C)，71.6(2′-C)，84.9(3′-C)，72.2(4′-C)，71.1(5′-C)，17.3(6′-C)，106.8(1″-C)，75.9(2″-C)，78.8(3″-C)，71.9(4′′-C)，78.5(5″-C)，62.8(6″-C)。

甘草酸 白色结晶性粉末，mp170～173℃(EeOH-H₂O)，分子式C₄₂H₆₂O₁₆。EI-MS(m/z)：470(M-糖)，438，409，372，303，262，217，175，136，95。¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δppm：5.36(1H，S，12-H)，4.48(1H，1′-H)，4.22(1H，1″-H)，1.13(3H，s)，1.12(3H，s)，1.02(3H，s)，0.94(3H，s)，0.86(3H，s)，0.67(3H，s)，0.63(3H，s)。¹³CNMR(DMSO-d₆)δppm：38.4(1-C)，26.9(2-C)，89.7(3-C)，37.3(4-C)，55.4(5-C)，17.8(6-C)，33.1(7-C)，44.0(8-C)，62.3(9-C)，37.3(10-C)，201.8(11-C)，128.0(12-C)，171.4(13-C)，46.1(14-C)，26.7(15-C)，26.5(16-C)，32.5(17-C)，49.2(18-C)，41.6(19-C)，44.0(20-C)，31.4(21-C)，38.4(22-C)，28.8(23-C)，16.8(24-C)，17.1(25-C)，21.0(26-C)，23.8(27-C)，28.1(28-C)，29.3(29-C)，179.9(30-C)，104.2(1′-C)，82.8(2′-C)，75.7(3′-C)，72.3(4′-C)，76.3(5′-C)，171.8(6′-C)，105.1(1″-C)，75.5(2″-C)，76.7(3″-C)，72.1(4″-C)，76.7(5″-C)，172.5(6″-C)。

以下实验例采用小鼠强迫游泳模型、小鼠悬尾模型、大鼠强迫游泳模型、大鼠慢性应激抑郁模型药物筛选方法，考察了主要含本发明药物组合物的四逆散有效部位抗抑郁活性。

实验例2：小鼠强迫游泳、悬尾模型药物筛选实验

1.动物及分组：雄性昆明种三级小鼠45只，重量20～25g，15只1组饲养。分对照组、四逆散提取物大小剂量组，共6组。每天8:00～10:00am给药，共3周。强迫游泳、悬尾实验前24h、5h、1h给药。

2.行为学测试方法：强迫游泳实验：量筒内装21～23℃水10cm，量筒之间放置一个不透明板，防止小鼠彼此看到。末次灌药后1小时，小鼠被投入量量筒，并滞留6min，计算后4min的不动时间，四只小鼠同时测量。判断不动的标准：停止挣扎，垂直体位，不动漂浮，仅做一些必要的活动使它的头露出水面。

悬尾实验：末次灌药后1小时，水平放置一棒状物，用胶带在距离小鼠尾尖30mm处将之固定于其上，中间用板隔开，防止彼此看到对方。小鼠距离最近的物体大约100mm。悬挂6min，记录后4min的不动时间，每次测量5只。

3.结果：大剂量四逆散有效部位明显减少了小鼠强迫游泳的不动时间。

        表1  药物对小鼠强迫游泳模型不动时间的影响

组别                 例数     不动时间      与空白组相比变化

                      (n)       (s)                (％)

对照                  15    158.35±32.84           -

四逆散有效部位大剂量  15    79.58±38.94^**        -50

四逆散有效部位小剂量  15    132.78±46.85          -16

^*p＜0.05与对照组相比，^**p＜0.01与对照组相比

          表2  药物对小鼠悬尾模型不动时间的影响

组别                  例数    不动时间      与空白组相比变化

                                (s)                (％)

空白                  15    113.08±24.15           -

四逆散有效部位大剂量  15    75.80±37.85            -32

四逆散有效部位小剂量  15    91.71±30.07            -19

^**p＜0.01，与对照组相比

4.结论：

四逆散有效部位具有抗抑郁作用。

实验例3：四逆散有效部位对大鼠强迫游泳模型作用

1.动物及分组：雄性SD大鼠30只，体重180g。随机分为2组：对照组15只，四逆散有效部位(抗抑郁活性部位)组15只。每组动物分3笼饲养，每笼5只。每天上午8-9h进行灌胃，以使动物适应给药时的抓摸刺激。

2.实验方法：灌胃12天，实验第13天大鼠被投入40cm高，直径18cm的容器中，内含25℃水20cm，强迫游泳15min，取出后烘干。于第14天第二次强迫游泳前23.5h、5h、1h分别给药。实验第14天第二次强迫游泳，观察大鼠不动时间。强迫游泳结束60min后，同笼中5只动物在5min内，迅速给与1％戊巴比妥钠(80mg/kg)腹腔内注射，麻醉后腹主动脉取血，离心取血清，测定皮质醇。开胸经心脏灌注固定，先用生理盐水100ml冲净血液，然后用预冷(4℃)的4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液(PB，0.1mol/L，PH7.4)灌注，先快灌，继之慢灌。取脑，用4％多聚甲醛后固定2h，再将脑组织块放入含20％蔗糖磷缓液(PB，0.1mol/L，PH7.4)，4℃过夜。组织块完全沉底后用冰冻切片机行40μm连续冠状切片，免疫组化检测C-FOS阳性神经元表达。

3.结果：

3.1与对照组比较，四逆散有效部位可以显著缩短大鼠强迫游泳不动时间。

  表3  四逆散有效部位对强迫游泳大鼠模型的影响

组别                  例数              不动时间(s)

对照组                14              138.77±32.90

四逆散有效部位组      14              109.42±32.60^*

^*p＜0.005，与对照组相比

3.2对血清皮质醇的影响，FST对大鼠血清皮质醇含量有明显的影响，对照组FST1小时后皮质醇仍保留在较高水平，四逆散有效部位组预防能明显降低其含量。

表4  四逆散有效部位对大鼠强迫游泳模型血清皮质醇的影响

组别                  例数              血清皮质醇浓度

                                            (ng/ml)

对照组                 8                 7.185±2.607

四逆散有效部位         8                 4.287±0.987

3.3对脑神经元C-FOS蛋白表达的影响

强迫游泳可使大鼠脑内C-FOS阳性神经元表达增加，而四逆散有效部位可以降低大鼠前额叶皮层、海马CA 3区C-FOS阳性神经元表达。

4.结论：

证实四逆散有效部位对强迫游泳模型具有抗抑郁作用。

实验例4：四逆散有效部位对大鼠慢性应激抑郁模型的影响

1.动物及方法：SD大鼠18只，重量180～200g。分组：适应性饲养一周，期间进行蔗糖水消耗和旷场实验，根据结果，半随机分3组。对照组每笼6只，模型组孤养。第21天动物断头处死，取大鼠大脑，于冰皿分离海马，称重。用高效液相电化学检测法测定单胺类神经递质及其代谢产物的变化。

2.结果：模型组大鼠海马多巴胺递质及其代谢产物含量比值下降，四逆散有效部位对多巴胺代谢有影响，能显著增加抑郁模型大鼠的水平运动和垂直运动。

              表5  海马多巴胺递质含量比值

分组                      例数              DA/DOPAC

对照组                     6               6.65±1.73

模型组                     6               2.49±4.62

四逆散有效部位组           6               26.62±5.67

    表6  四逆散及其有效部位对大鼠抑郁模型行为学作用

分组               例数          水平运动       垂直运动

模型组              10         11.47±10.33    3.65±3.99

四逆散有效部位组    10         39.11±33.10    6.28±5.03

下列实施例均能实现上述实验例的效果。

实施例1

异甘草素10mg    甘草素20mg    甘草苷30mg

新橙皮苷3305mg  橙皮苷80mg    异甘草苷10mg

甘草酸30mg      柴胡皂苷d 13mg

5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷2mg

5，7-二羟基香豆素5mg  柴胡皂苷c 12mg  制成胶囊360粒，每粒含9.4mg(相当有效部位0.33g)每天服用2次，每次3粒。

实施例2

异甘草素10mg    甘草素20mg    甘草苷30mg

新橙皮苷3305mg  橙皮苷80mg    异甘草苷10mg

甘草酸30mg      柴胡皂苷d 13mg

5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷2mg

5，7-二羟基香豆素5mg  柴胡皂苷c 12mg  制成片剂360片，每片含9.4mg(相当有效部位0.33g)每天服用2次，每次3片。

实施例3

异甘草素10mg    甘草素20mg    甘草苷30mg

新橙皮苷3305mg  橙皮苷80mg    异甘草苷10mg

甘草酸30mg      柴胡皂苷d 13mg

5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷2mg

5，7-二羟基香豆素5mg  柴胡皂苷c 12mg  制成滴丸360粒，每粒含9.4mg(相当有效部位0.33g)每天服用2次，每次3粒。

实施例4

异甘草素10mg    甘草素20mg    甘草苷30mg

新橙皮苷3305mg  橙皮苷80mg    异甘草苷10mg

甘草酸30mg      柴胡皂苷d 13mg

5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷2mg

5，7-二羟基香豆素5mg  柴胡皂苷c 12mg  制成拴剂360粒，每粒含9.4mg(相当有效部位0.33g)每天使用2次，每次3粒

实施例5

按比例称取柴胡2.4kg、炙甘草2.4kg、枳实2.4kg、白芍3.6kg，混合均匀，加水煎煮2次，其中第一次加水100L，煎煮2小时；第二次加水80L，煎煮1.5小时；合并2次水煎液，浓缩至60L；通过弱极性的AB-8大孔吸附树脂，树脂体积为15L，进行吸附，吸附流速为2L/h；待水煎液全部通过树脂柱后，用8倍树脂体积，约120L的水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用8倍树脂体积，约120L的50％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，洗脱流速为2L/h；收集50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，即得到本发明抗抑郁有效部位707.4g。

实施例6

按比例称取柴胡2.4kg、炙甘草2.4kg、枳实2.4kg、白芍3.6kg，4味药共10.8kg，混合均匀，加水煎煮2～3次，合并各次水煎液，浓缩，通过弱极性的AB-8型大孔吸附树脂进行吸附，待水煎液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用40～70％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，即得到复方中药抗抑郁活性部位。取本发明抗抑郁活性部位120g，通过聚酰胺柱，用水、30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液和70％乙醇水溶液依次进行洗脱，各部分洗脱液减压回收溶剂后，分别得到水洗脱物E55g，30％乙醇洗脱物F40g，50％乙醇洗脱物H10g，70％乙醇洗脱物K5g。

甘草苷的制备：

H用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇分别以90∶10，88∶12，85∶15，83∶17，80∶20，75∶25，70∶30混合梯度洗脱，每份100mL，共收集100份，其中：83∶17的氯仿-甲醇洗脱部分第55～63份，经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以7∶3混合溶剂洗脱，得到甘草苷5mg；

F加水500mL分散后，依次用氯仿萃取5次，每次用氯仿200mL，共计1000mL；醋酸乙酯萃取6次，每次用醋酸乙酯250mL，共计1500mL；正丁醇萃取8次，每次用正丁醇250mL，共计2000mL；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分0.5g，醋酸乙酯萃取部分3.65g，正丁醇萃取部分7.0g；正丁醇萃取后的水溶液减压干燥后得水部分0.55g；乙酸乙酯部分3.65g经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以100∶0，98∶2，95∶5，90∶10，87∶13，85∶15，82∶18，80∶20，78∶22，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，50∶50混合梯度洗脱，每份100mL，共收集240份，其中：82∶18的氯仿-甲醇洗脱部分第98～126份，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以9∶1混合溶剂洗脱，得到草苷15mg；

F加水500mL分散后，依次用氯仿萃取5次，每次用氯仿200mL，共计1000mL；醋酸乙酯萃取6次，每次用醋酸乙酯250mL，共计1500mL；正丁醇萃取8次，每次用正丁醇250mL，共计2000mL；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分0.5g，醋酸乙酯萃取部分3.65g，正丁醇萃取部分7.0g；正丁醇萃取后的水溶液减压干燥后得水部分0.55g；正丁醇部分7.0g经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以90∶10，87∶13，85∶15，83∶17，80∶20，78∶22，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，50∶50混合溶剂梯度洗脱，每份100mL，共收集160份，其中：87∶13的氯仿-甲醇洗脱部分第62～82份，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以9∶1混合溶剂洗脱，得到甘草苷10mg；

异甘草素的制备方法：

H用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇分别以90∶10，88∶12，85∶15，83∶17，80∶20，75∶25，70∶30混合梯度洗脱，每份100mL，共收集100份，其中：

90∶10的氯仿-甲醇洗脱部分第9～14份，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以9∶1混合溶剂洗脱，得到异甘草素10mg；

异甘草苷的制备：

F加水500mL分散后，依次用氯仿萃取5次，每次用氯仿200mL，共计1000mL；醋酸乙酯萃取6次，每次用醋酸乙酯250mL，共计1500mL；正丁醇萃取8次，每次用正丁醇250mL，共计2000mL；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分0.5g，醋酸乙酯萃取部分3.65g，正丁醇萃取部分7.0g；正丁醇萃取后的水溶液减压干燥后得水部分0.55g；乙酸乙酯部分3.65g经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以100∶0，98∶2，95∶5，90∶10，87∶13，85∶15，82∶18，80∶20，78∶22，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，50∶50混合梯度洗脱，每份100mL，共收集240份，其中：82∶18的氯仿-甲醇洗脱部分第98～126份，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以9∶1混合溶剂洗脱，得到异甘草苷3mg；

甘草素的制备：

K用硅胶柱层析分离，8∶2的氯仿-醋酸乙酯混合溶剂洗脱，每份40mL，共收集54份；其中第9～11份合并后，经聚酰胺柱层析分离，9∶1的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，得到甘草素15mg；

新橙皮苷的制备：

H用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇分别以90∶10，88∶12，85∶15，83：17，80∶20，75∶25，70∶30混合梯度洗脱，每份100mL，共收集100份，其中：80∶20的氯仿-甲醇洗脱部分第75～85份，经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以85∶15混合溶剂洗脱，每份10mL，共收集45份；第22～34份合并后，经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以8∶2混合溶剂洗脱，得到新橙皮苷5mg；

F加水500mL分散后，依次用氯仿萃取5次，每次用氯仿200mL，共计1000mL；醋酸乙酯萃取6次，每次用醋酸乙酯250mL，共计1500mL；正丁醇萃取8次，每次用正丁醇250mL，共计2000mL；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分0.5g，醋酸乙酯萃取部分3.65g，正丁醇萃取部分7.0g；正丁醇萃取后的水溶液减压干燥后得水部分0.55g；乙酸乙酯部分3.65g经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以100∶0，98∶2，95∶5，90∶10，87∶13，85∶15，82∶18，80∶20，78∶22，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，50∶50混合梯度洗脱，每份100mL，共收集240份，其中：78∶22的氯仿-甲醇洗脱部分第183～205份，经重结晶处理，得到新橙皮苷400mg；

F加水500mL分散后，依次用氯仿萃取5次，每次用氯仿200mL，共计1000mL；醋酸乙酯萃取6次，每次用醋酸乙酯250mL，共计1500mL；正丁醇萃取8次，每次用正丁醇250mL，共计2000mL；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分0.5g，醋酸乙酯萃取部分3.65g，正丁醇萃取部分7.0g；正丁醇萃取后的水溶液减压干燥后得水部分0.55g；正丁醇部分7.0g经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇(90∶10，87∶13，85∶15，83∶17，80∶20，78∶22，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，50∶50)混合溶剂梯度洗脱，每份100mL，共收集160份。其中：氯仿-甲醇(75∶25)洗脱部分(第115～135份)，经重结晶处理，得到新橙皮苷900mg；

F加水500mL分散后，依次用氯仿萃取5次，每次用氯仿200mL，共计1000mL；醋酸乙酯萃取6次，每次用醋酸乙酯250mL，共计1500mL；正丁醇萃取8次，每次用正丁醇250mL，共计2000mL；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分0.5g，醋酸乙酯萃取部分3.65g，正丁醇萃取部分7.0g；正丁醇萃取后的水溶液减压干燥后得水部分0.55g；正丁醇部分7.0g经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以90∶10，87∶13，85∶15，83∶17，80∶20，78∶22，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，50∶50混合溶剂梯度洗脱，每份100mL，共收集160份，其中：E加水600mL分散后，用正丁醇萃取8次每次用正丁醇300mL，共计2400mL，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分7.55g，正丁醇萃取后的水溶液减压干燥后得水部分6.45g；正丁醇部分7.55g用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水以98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1混合梯度洗脱，依次分为14个部分；其中部分4用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以9∶1混合溶剂洗脱得到新橙皮苷2g；

橙皮苷的制备：

E加水600mL分散后，用正丁醇萃取8次每次用正丁醇300mL，共计2400mL，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分7.55g，正丁醇萃取后的水溶液减压干燥后得水部分6.45g；正丁醇部分7.55g用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水以98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1混合梯度洗脱，依次分为14个部分；其中部分4用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以9∶1混合溶剂洗脱得到新橙皮苷2g；部分5用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以11∶1混合溶剂洗脱得到橙皮苷80mg；

5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的制备：

F加水500mL分散后，依次用氯仿萃取5次，每次用氯仿200mL，共计1000mL；醋酸乙酯萃取6次，每次用醋酸乙酯250mL，共计1500mL；正丁醇萃取8次，每次用正丁醇250mL，共计2000mL；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分0.5g，醋酸乙酯萃取部分3.65g，正丁醇萃取部分7.0g；正丁醇萃取后的水溶液减压干燥后得水部分0.55g；乙酸乙酯部分3.65g经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以100∶0，98∶2，95∶5，90∶10，87∶13，85∶15，82∶18，80∶20，78∶22，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，50∶50混合梯度洗脱，每份100mL，共收集240份，其中：85∶15的氯仿-甲醇洗脱部分第92～97份，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以9∶1混合溶剂洗脱，得到5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-葡萄糖苷2mg；

5，7-二羟基香豆素的制备：

H用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇分别以90∶10，88∶12，85∶15，83∶17，80∶20，75∶25，70∶30混合梯度洗脱，每份100mL，共收集100份，其中：88∶12的氯仿-甲醇洗脱部分第19～22份，经硅胶柱层析分离，氯仿-醋酸乙酯以8∶2混合溶剂洗脱，得到5，7-二羟基香豆素5mg；

柴胡皂苷c的制备：

E加水600mL分散后，用正丁醇萃取8次每次用正丁醇300mL，共计2400mL，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分7.55g，正丁醇萃取后的水溶液减压干燥后得水部分6.45g；正丁醇部分7.55g用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水以98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1混合梯度洗脱，部分9～11合并，经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到柴胡皂苷c 12mg；

柴胡皂苷d的制备：

E加水600mL分散后，用正丁醇萃取8次每次用正丁醇300mL，共计2400mL，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分7.55g，正丁醇萃取后的水溶液减压干燥后得水部分6.45g；正丁醇部分7.55g用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水以98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1混合梯度洗脱，部分9～11合并，经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到柴胡皂苷d 15mg；

甘草酸的制备：

E加水600mL分散后，用正丁醇萃取8次每次用正丁醇300mL，共计2400mL，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分7.55g，正丁醇萃取后的水溶液减压干燥后得水部分6.45g；正丁醇部分7.55g用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水以98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1混合梯度洗脱，依次分为14个部分；部分14经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到甘草酸30mg；

Claims (12)

1、一种四逆散的有效部位，其特征在于该有效部位主要由下述化合物构成：

异甘草素8--12重量份            甘草素15--25重量份

甘草苷25--35重量份             新橙皮苷3200--3400重量份

橙皮苷70--90重量份             异甘草苷2--6重量份

5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷1--5重量份

5，7-二羟基香豆素3--8重量份    柴胡皂苷c8--16重量份

柴胡皂苷d12--18重量份          甘草酸20--40重量份。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该有效部位主要是由下述化合物构成：

异甘草素10重量份    甘草素20重量份    甘草苷30重量份

新橙皮苷3305重量份  橙皮苷80重量份    异甘草苷10重量份

甘草酸30重量份      柴胡皂苷d 13重量份

5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷2重量份

5，7-二羟基香豆素5重量份    柴胡皂苷c 12重量份。

3、权利要求1或2所述的有效部位中的各化合物的制备方法，其特征在于该方法为：

按6∶6∶6∶9的比例称取柴胡、炙甘草、枳实、白芍，将4味药混合均匀，加水煎煮2～3次，合并各次水煎液，浓缩，通过弱极性的大孔吸附树脂进行吸附，待水煎液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用30～80％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，即得到复方中药抗抑郁活性部位；将抗抑郁活性部位，通过聚酰胺柱，用水、25～35％乙醇水溶液、45～55％乙醇水溶液和65～75％乙醇水溶液依次进行洗脱，各部分洗脱液减压回收溶剂后，分别得到水洗脱物A，25～35％乙醇洗脱物B，45～55％乙醇洗脱物C，65～75％乙醇洗脱物D，然后分别从洗脱物A、B、C、D中经过纯化获得各化合物的纯品。

4、如权利要求3所述的有效部位中的各化合物的制备方法，其特征在于该方法为：

按6∶6∶6∶9的比例称取柴胡、炙甘草、枳实、白芍，将4味药混合均匀，加水煎煮2～3次，合并各次水煎液，浓缩，通过弱极性的大孔吸附树脂进行吸附，待水煎液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用40～70％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，即得到复方中药抗抑郁活性部位；将抗抑郁活性部位，通过聚酰胺柱，用水、30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液和70％乙醇水溶液依次进行洗脱，各部分洗脱液减压回收溶剂后，分别得到水洗脱物A，30％乙醇洗脱物B，50％乙醇洗脱物C，70％乙醇洗脱物D，然后分别从洗脱物A、B、C、D中经过纯化获得各化合物的纯品。

5、权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于各化合物的纯化过程包括如下方法：

甘草苷可用以下一种或几种方法：

C用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中80～85∶20～15的氯仿-甲醇洗脱部分，经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以6～8∶4～2混合溶剂洗脱，得到甘草苷；

B加水分散后，依次用氯仿萃取4～6次，醋酸乙酯萃取4～8次，正丁醇萃取6～10次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；乙酸乙酯部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中78～85∶22～15的氯仿-甲醇洗脱部分，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以7～9∶1混合溶剂洗脱，得到甘草苷；

异甘草素的制备方法：

C用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中85-95∶15-5的氯仿-甲醇洗脱部分，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以7-9∶1混合溶剂洗脱，得到异甘草素；

异甘草苷的制备方法：

B加水分散后，依次用氯仿萃取4～6次，醋酸乙酯萃取4～8次，正丁醇萃取6～10次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；乙酸乙酯部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中80-85∶20-15的氯仿-甲醇洗脱部分，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以7-9∶1混合溶剂洗脱，得到异甘草苷；

甘草素的制备方法：

D用硅胶柱层析分离，6-9∶1-3的氯仿-醋酸乙酯混合溶剂洗脱，共收集54份；其中第9～11份合并后，经聚酰胺柱层析分离，7-9∶1的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，得到甘草素；

新橙皮苷的制备可以采用以下的一种或几种方法：

C用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中75-85∶25-15的氯仿-甲醇洗脱部分，经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以80-90∶20-10混合溶剂洗脱，共收集45份；第22～34份合并后，经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以6-9∶1-3混合溶剂洗脱，得到新橙皮苷；

B加水分散后，依次氯仿萃取4～6次，醋酸乙酯萃取4～8次，正丁醇萃取6～10次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；乙酸乙酯部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中75-80∶15-20的氯仿-甲醇洗脱部分，经重结晶处理，得到新橙皮苷；

B加水分散后，依次用氯仿萃取4～6次，醋酸乙酯萃取4～8次，正丁醇萃取6～10次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；正丁醇部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以混合溶剂梯度洗脱，其中70-80∶30-20的氯仿-甲醇洗脱部分，经重结晶处理，得到新橙皮苷；

A加水分散后，用正丁醇萃取6-10次，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分，正丁醇部分用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水混合梯度洗脱，依次分为14个部分；其中部分4用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以7-9∶1混合溶剂洗脱得到新橙皮苷；

橙皮苷的制备方法：

A加水分散后，用正丁醇萃取6-10次，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分，正丁醇部分用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水混合梯度洗脱，依次分为14个部分，部分5用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以9-12∶1混合溶剂洗脱得到橙皮苷；

5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的制备方法：

B加水分散后，依次用氯仿萃取4～6次，醋酸乙酯萃取4～8次，正丁醇萃取6～10次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；乙酸乙酯部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合梯度洗脱，其中80-90∶20-10的氯仿-甲醇洗脱部分，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以7-9∶1混合溶剂洗脱，得到5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-葡萄糖苷；

5，7-二羟基香豆素的制备方法：

C用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇混合梯度洗脱，其中85-90∶15-10的氯仿-甲醇洗脱部分，经硅胶柱层析分离，氯仿-醋酸乙酯以6-9∶4-1混合溶剂洗脱，得到5，7-二羟基香豆素；

柴胡皂苷c、柴胡皂苷d的制备方法：

A加水分散后，用正丁醇萃取6-10次，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分，正丁醇部分用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水混合梯度洗脱，部分9～11合并，经Sephadex LH-20柱层析分离，90-95％乙醇洗脱，得到柴胡皂苷c，柴胡皂苷d；

甘草酸的制备方法：

A加水分散后，用正丁醇萃取6-10次，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分，正丁醇部用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水混合梯度洗脱，依次分为14个部分；部分14经Sephadex LH-20柱层析分离，90-95％乙醇洗脱，得到甘草酸；

6、如权利要求5所述的制备方法，其特征在于各化合物的纯化过程包括如下方法：

甘草苷可用以下一种或几种方法：

C用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇分别以90∶10，88∶12，85∶15，83∶17，80∶20，75∶25，70∶30混合梯度洗脱，共收集100份，其中：83∶17的氯仿-甲醇洗脱部分第55～63份，经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以7∶3混合溶剂洗脱，得到甘草苷；

B加水分散后，依次用氯仿萃取5次，醋酸乙酯萃取6次，正丁醇萃取8次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；乙酸乙酯部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以100∶0，98∶2，95∶5，90∶10，87∶13，85∶15，82∶18，80∶20，78∶22，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，50∶50混合梯度洗脱，共收集240份，其中：82∶18的氯仿-甲醇洗脱部分第98～126份，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以9∶1混合溶剂洗脱，得到甘草苷；

B加水分散后，依次用氯仿萃取5次，醋酸乙酯萃取6次，正丁醇萃取8次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；正丁醇部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以90∶10，87∶13，85∶15，83∶17，80∶20，78∶22，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，50∶50混合溶剂梯度洗脱，共收集160份，其中：87∶13的氯仿-甲醇洗脱部分第62～82份，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以9∶1混合溶剂洗脱，得到甘草苷。

异甘草素可用以下方法：

C用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇分别以90∶10，88∶12，85∶15，83∶17，80∶20，75∶25，70∶30混合梯度洗脱，共收集100份，其中：90∶10的氯仿-甲醇洗脱部分第9～14份，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以9∶1混合溶剂洗脱，得到异甘草素。

异甘草苷可用以下方法：B加水分散后，依次用氯仿萃取5次，醋酸乙酯萃取6次，正丁醇萃取8次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；乙酸乙酯部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以100∶0，98∶2，95∶5，90∶10，87∶13，85∶15，82∶18，80∶20，78∶22，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，50∶50混合梯度洗脱，共收集240份，其中：82∶18的氯仿-甲醇洗脱部分第98～126份，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以9∶1混合溶剂洗脱，得到异甘草苷。

甘草素可用以下方法：D用硅胶柱层析分离，8∶2的氯仿-醋酸乙酯混合溶剂洗脱，共收集54份；其中第9～11份合并后，经聚酰胺柱层析分离，9∶1的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，得到甘草素。

新橙皮苷可用以下一种或几种方法：

C用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇分别以90∶10，88∶12，85∶15，83∶17，80∶20，75∶25，70∶30混合梯度洗脱，共收集100份，其中：80∶20的氯仿-甲醇洗脱部分第75～85份，经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以85∶15混合溶剂洗脱，共收集45份；第22～34份合并后，经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以8∶2混合溶剂洗脱，得到新橙皮苷；

B加水分散后，依次用氯仿萃取5次，醋酸乙酯萃取6次，正丁醇萃取8次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；乙酸乙酯部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以100∶0，98∶2，95∶5，90∶10，87∶13，85∶15，82∶18，80∶20，78∶22，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，50∶50混合梯度洗脱，共收集240份，其中：78∶22的氯仿-甲醇洗脱部分第183～205份，经重结晶处理，得到新橙皮苷；

B加水分散后，依次用氯仿萃取5次，醋酸乙酯萃取6次，正丁醇萃取8次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；正丁醇部分7.0g经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以90∶10，87∶13，85∶15，83∶17，80∶20，78∶22，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，50∶50混合溶剂梯度洗脱，共收集160份，其中：75∶25的氯仿-甲醇洗脱部分第115～135份，经重结晶处理，得到新橙皮苷；

A加水分散后，用正丁醇萃取8次每次，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分，正丁醇部分用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水以98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1混合梯度洗脱，依次分为14个部分；其中部分4用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以9∶1混合溶剂洗脱得到新橙皮苷。

橙皮苷可用以下方法：A加水分散后，用正丁醇萃取8次每次，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分，正丁醇部分用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水以98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1混合梯度洗脱，依次分为14个部分，部分5用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以11∶1混合溶剂洗脱得到橙皮苷。

5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷可用以下方法：B加水分散后，依次用氯仿萃取5次，醋酸乙酯萃取6次，正丁醇萃取8次；氯仿萃取液、醋酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液分别减压回收溶剂后得到氯仿萃取部分，醋酸乙酯萃取部分，正丁醇萃取部分；乙酸乙酯部分经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇以100∶0，98∶2，95∶5，90∶10，87∶13，85∶15，82∶18，80∶20，78∶22，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，50∶50混合梯度洗脱，共收集240份，其中：85∶15的氯仿-甲醇洗脱部分第92～97份，经聚酰胺柱层析分离，氯仿-甲醇以9∶1混合溶剂洗脱，得到5，3’-二羟基-4’-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-葡萄糖苷。

5，7-二羟基香豆素可用以下方法：C用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇分别以90∶10，88∶12，85∶15，83∶17，80∶20，75∶25，70∶30混合梯度洗脱，共收集100份，其中：88∶12的氯仿-甲醇洗脱部分第19～22份，经硅胶柱层析分离，氯仿-醋酸乙酯以8∶2混合溶剂洗脱，得到5，7-二羟基香豆素。

柴胡皂苷c可用以下方法：A加水分散后，用正丁醇萃取8次，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分，正丁醇部分用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水以98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1混合梯度洗脱，部分9～11合并，经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到柴胡皂苷c。

柴胡皂苷d可用以下方法：A加水分散后，用正丁醇萃取8次，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分，正丁醇部分用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水以98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1混合梯度洗脱，部分9～11合并，经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到柴胡皂苷d。

甘草酸可用以下方法：A加水分散后，用正丁醇萃取8次，正丁醇萃取液减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分，正丁醇部用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇-水以98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1混合梯度洗脱，依次分为14个部分；部分14经Sephadex LH-20柱层析分离，95％乙醇洗脱，得到甘草酸。

7、权利要求1或2所述的有效部位在制备抗抑郁的药物中的应用。

8、如权利要求7所述的应用，其特征在于抗抑郁是指提高多巴胺递质及其代谢产物含量比值或降低脑神经元C-FOS阳性神经元表达。

9、如权利要求1或2所述的有效部位，其特征在于还可加入药学上可接受的敷料或赋形剂。

10、如权利要求9所述的的药物组合物，其特征在于敷料或赋形剂是指溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂等。

11.如权利要求1或2所述的有效部位，其特征在于可制成临床可接受的剂型。

12、如权利要求11所述的有效部位，其特征在于剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂注射剂、气雾剂、栓剂。