CN103142630A - 橙皮苷或其衍生物作为抗抑郁药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了橙皮苷或其衍生物作为抗抑郁药物的应用。所述的药物剂型为片剂、胶囊、溶液、悬浮液、注射液、滴注液等药学上可接受的剂型。该药物是由橙皮苷或其药学上可接受的经水解或酶解生成的苷元和次生苷组成的,包括与药用载体组合制备成各种药物剂型。该药物毒性小,无常规抗抑郁药的兴奋不安、便秘、尿闭、眩晕、嗜睡、震颤等缺点。
Description
技术领域:
本发明涉及医药技术领域,确切地说它是橙皮苷或其衍生物作为抗抑郁药物的应用。
背景技术:
橙皮苷(Hesperidin)为二氢黄酮苷类化合物,为芸香科柑橘属植物次生代谢产物,广泛分布于很多植物中。研究表明,橙皮苷在促进胃动力方面具有较强的生物活性。中国专利号:CN1704065A公开了名称为“橙皮苷和/或柚皮苷的制药用途”的发明专利,公开了橙皮苷在制备治疗胃胀、消化不良和小儿厌食药物的用途。另外,中国专利号:CN1861074A公开了名称为“橙皮素衍生物作为抗炎免疫药物的应用”的发明专利,公开了一种橙皮素衍生物在制备抗炎免疫药物中的应用,特别是在治疗风湿性、类风湿性关节炎和骨关节炎等自身免疫性疾病中的应用。未见橙皮苷或其衍生物在制备抗抑郁方面药物中的新用途。
发明内容:
本发明提供了橙皮苷或其衍生物抗抑郁的新用途。橙皮苷或其衍生物可用于预防或治疗焦虑状态或抑郁状态。
含橙皮苷或其经水解或酶解生成的苷元和次生苷等衍生物,包括与药用载体组合,用于预防或治疗抑郁状态。其中所述病体为哺乳动物。含橙皮苷或其经水解或酶解生成的苷元和次生苷等衍生物可通过口服、非肠道或局部途径给药,给药剂型可以是片剂、胶囊、溶液、悬浮液、注射液、滴注液、冻干粉等药学上可接受的剂型。
本发明的优点是:本发明揭示了橙皮苷或其衍生物具有抗抑郁的作用,为其应用提供了新的途径。且毒性小,无常规抗抑郁药的兴奋不安、便秘、尿闭、眩晕、嗜睡、震颤等缺点。
具体实施方式:
下面的动物实验是对本发明的进一步详细说明,但并不意味着对本发明的任何限制。
实例1.自主活动兴奋性实验
1.实验动物
Wistar大鼠,雄性,体重200~220g,SPF级标准,将动物称重,编号,选择健康大鼠50只。按体重大小排序,用随机分组法分成5组,每组10只。设空白对照组、阳性对照组、橙皮苷给药组、橙皮素给药组。
2.样品来源和处理
(1)空白对照组:生理盐水,NaCl含量0.9%。
(2)阳性对照组:取盐酸氟西汀用生理盐水定容于容量瓶中,盐酸氟西汀浓度为1.8mg/ml。给药剂量为7.2mg/kg。
(3)橙皮苷给药组:取橙皮苷适量,用生理盐水定容于容量瓶中,橙皮苷浓度为1.6mg/ml。所用橙皮苷样品纯度为95%以上,给药剂量为8mg/kg。
(4)橙皮素给药组:橙皮素为橙皮苷经水解之后的苷元。取橙皮素适量,用生理盐水定容于容量瓶中,橙皮苷浓度为1.6mg/ml。所用橙皮苷样品纯度为95%以上,给药剂量为8mg/kg。
3.实验方法(开场实验)
采用底面为正方形的敞箱,长100cm,宽100cm,高50cm,底面用黑线分为100个面积相近的扇形。实验时将大鼠放在敞箱正中心,以大鼠5min内水平运动越格数(至少3爪跨过边界)评价其运动性;以垂直运动直立次数(两前爪离开地面)评价其探究性。通过比较各给药组给药前后自主运动变化情况来考察橙皮苷或橙皮素是否有自主兴奋作用,同时以给予生理盐水的空白组和给予阳性对照药盐酸氟西汀的阳性对照组来进行随行对照。
4.实验过程
给药前通过观察大鼠在敞箱内的活动,记录5min内水平运动越格数以及垂直运动直立的次数;在给药7天后,观察大鼠在敞箱内的活动,记录5min内水平运动越格数以及垂直运动直立的次数。将各组实验数据用SPSS统计软件进行处理,水平运动变化率和垂直运动变化率计算方法如下:
水平运动变化率=(给药7天后水平运动越格数-给药前水平运动越格数)/给药前水平运动越格数×100%
垂直运动变化率=(给药7天后垂直运动越格数-给药前垂直运动越格数)/给药前垂直运动越格数×100%
将各组实验数据进行t检验,考察其是否存在显著性差异。
5.实验结果
经统计,各给药组大鼠自主运动情况见表1。
表1.给药前与给药7天后各给药组大鼠开场实验自主运动变化情况
运用SPSS软件,进行t检验,分别比较空白组、橙皮苷组、橙皮素组和盐酸氟西汀组给药前后自主运动情况,与空白组和阳性对照药盐酸氟西汀组一样,橙皮苷和橙皮素给药组大鼠水平运动和垂直运动在给药前后均无显著性差异(P>0.05),表明在给予橙皮苷或橙皮素后,大鼠中枢神经系统无自主兴奋作用。
实例2.慢性应激大鼠开场实验
1.实验动物
Wistar大鼠,雄性,体重200~220g,SPF级标准,将动物称重,编号,选择健康的大鼠共40只。按体重大小排序,用随机分组法分成4组,每组10只。设空白对照组、病理模型组、阳性对照组、橙皮苷给药组。
2.样品来源和处理
(1)空白对照组:同实施例1。
(2)病理模型组:生理盐水,NaCl含量0.9%。
(3)阳性对照组:同实施例1。
(4)橙皮苷给药组:同实施例1。
3.实验方法
(1)大鼠慢性应激模型的制备:慢性应激作为一种非损伤性刺激,与人类心身性疾病的过程有相似性,慢性应激模型现实验的模拟了人们日常生活中遇到的“应激状态”,对于筛选特异性的临床抗抑郁药有很好的适用性,本实验正是以慢性应激模型为基础,给予阳性对照药及橙皮苷,考察橙皮苷的抗抑郁作用。
在大鼠慢性应激模型的制备中,尽量使应激刺激符合不可预测性的特点,连续28d按每天1或2种刺激的强度,交替给予大鼠以下刺激:禁食24h、禁水24h、限制摄食2h、配对饲养12h、倾笼45°2h、通宵照明12h、潮湿饲养(200ml水加到100g垫料)12h、频闪(100min/s)1h、白噪声(110dB)1h、强迫游泳(水温4℃)5min、制动1h,制备慢性应激模型。各给药组应激及给药情况如下:
A.空白对照组:不给予刺激,给予生理盐水。
B.病理模型组:给予刺激同时给予生理盐水。
C.阳性对照组:给予刺激同时给予阳性药物,剂量同实施例1。
D.橙皮苷给药组:给予刺激同时给予橙皮苷,剂量同实施例1。
(2)开场实验:采用底面为正方形的敞箱,长100cm,宽100cm,高50cm,底面用黑线分为100个面积相近的扇形。实验时将大鼠放在敞箱正中心,以大鼠5min内水平运动越格数(至少3爪跨过边界)评价其运动性;以垂直运动直立次数(两前爪离开地面)评价其探究性。通过比较给药前后橙皮苷给药组与病理模型组自主运动变化率(包括水平运动变化率和垂直运动变化率)来考察橙皮苷是否具有抗抑郁作用,同时以给予生理盐水的空白组和给予阳性对照药盐酸氟西汀的阳性对照组进行随行对照。
4.实验过程
给药前通过观察大鼠在敞箱内的活动,记录5min内水平运动越格数以及垂直运动直立的次数;在慢性应激28天后,观察大鼠在敞箱内的活动,记录5min内水平运动越格数以及垂直运动直立的次数。水平运动变化率和垂直运动变化率计算方法如下:
水平运动变化率=(应激28天后水平运动越格数-应激前水平运动越格数)/应激前水平运动越格数×100%
垂直运动变化率=(应激28天后垂直运动越格数-应激前垂直运动越格数)/应激前垂直运动越格数×100%
结果得到正数为增加,负数为下降,将各组实验数据用SPSS统计软件处理,进行t检验,考察橙皮苷给药组与病理模型组自主运动情况是否存在显著性差异。
5.实验结果
经统计,各给药组自主运动情况见表2。
表2慢性应激模型大鼠各给药组开场实验自主运动变化情况
运用SPSS软件,进行t检验,病理模型组与空白组在给药前后自主运动情况(水平运动变化率和垂直运动变化率)比较存在极其显著的差异(P<0.01),表明在慢性应激的状态下,大鼠在没有药物干预下其自主运动情况受到了影响,水平运动变化率和垂直运动变化率均明显下降,提示慢性应激模型制备成功;各给药组与病理模型组在给药前后自主运动情况比较(水平运动变化率和垂直运动变化率)均存在极其显著的差异(P<0.01),表明橙皮苷和阳性对照药盐酸氟西汀均能对由于慢性应激导致的大鼠水平运动变化率和垂直运动变化率下降有显著的抵抗作用,提示橙皮苷具有抵抗由于抑郁引起的自主活动减少的药理活性。
实例3.慢性应激大鼠蔗糖偏嗜度测定实验
1.实验动物
同实施例2。
2.样品来源和处理
(1)空白对照组:同实施例1。
(2)病理模型组:同实施例2。
(3)阳性对照组:同实施例1。
(4)橙皮苷给药组:同实施例1。
3.实验方法
(1)大鼠慢性应激模型的制备:大鼠慢性应激模型的制备和各给药组应激及给药情况均同实例2。
(2)蔗糖水偏嗜度实验:大鼠在遭受慢性应激刺激后,将出现兴趣减退的表现,本实验在进行慢性应激前首先给大鼠进行蔗糖水偏嗜训练,建立其对糖水的偏好,在进行慢性应激刺激后,未给抗抑郁药物的大鼠会因兴趣的缺失导致对蔗糖水偏嗜度的下降,因此,通过比较各给药组与病理模型组在给药前后蔗糖水偏嗜度变化情况,可以考察橙皮苷对抗由于大鼠慢性应激刺激导致的兴趣缺失;考察橙皮苷、组与病理模型组给药前后各组大鼠蔗糖水偏嗜度变化率之间是否具有显著性,同时以给予生理盐水的空白组和给予阳性对照药盐酸氟西汀的阳性对照组进行随行对照。
4.实验过程
在给药前先对大鼠进行学习训练:禁食禁水,只给予1%蔗糖水48h;蔗糖偏嗜度测量:训练结束后正常食水饲养3d,再禁食禁水23h,然后让大鼠自由饮用2瓶不同的水,其中一瓶为1%蔗糖水,一瓶为自来水。进行1h的饮水量(g)测量,按公式计算蔗糖偏嗜度。大鼠适应环境1周后按蔗糖偏嗜度把40只大鼠均衡分为4组:慢性应激刺激28天后,再次测量大鼠蔗糖水偏嗜度。同时计算蔗糖偏嗜度变化率
蔗糖偏嗜度=蔗糖水饮用量/(蔗糖水饮用量+自来水饮用量)×100%
蔗糖偏嗜度变化率=(应激28天后蔗糖偏嗜度-应激前蔗糖偏嗜度)/应激前蔗糖偏嗜度×100%
将各组实验数据用SPSS统计软件处理,进行t检验,考察橙皮苷组与病理模型组大鼠蔗糖偏嗜度变化率是否存在显著性差异。
5.实验结果
经统计,各样品组大鼠蔗糖偏嗜度变化率情况见表3。
运用SPSS软件,进行t检验,病理模型组与空白组在给药前后蔗糖偏嗜度变化率比较存在极其显著的差异(P<0.01),表明在慢性应激的状态下,大鼠在没有药物干预下导致了其对原有建立的兴趣的缺失,蔗糖偏嗜度变化率明显低于空白组,同时提示慢性应激模型制备成功;橙皮苷组、阳性对照药组与病理模型组在给药前后蔗糖偏嗜度变化率比较均存在极其显著的差异(P<0.01),表明橙皮苷和阳性对照药盐酸氟西汀均能对由于慢性应激导致的大鼠体重兴趣缺失症状有显著的抵抗作用,提示橙皮苷具有抵抗由于抑郁引起与兴趣缺失相关的脑部功能失常的药理活性。
表3.慢性应激模型大鼠各样品组大鼠蔗糖偏嗜度变化率
实例4.单胺氧化酶A抑制活性测试
1.样品与试剂
橙皮素:橙皮苷经水解之后的苷元(水解温度140℃),分离纯化后使得纯度为95%。
帕吉林:sigma公司产品,规格1g/瓶
磷酸钠,蔗糖均购于北京化学试剂公司
MAO活性测试试剂盒:购于南京建成生物工程研究所,试剂盒组成:
试剂一:苯胺溶液(0.016mol/L)
试剂二:pH7.6Tris缓冲液
试剂三:10%过氯酸溶液(反应终止液)
试剂四:环己烷试剂
2.实验方法
单胺递质是神经系统传导信号的介质,它的正常存在是神经系统正常发挥作用的前提,在抑郁症的发病机制研究中,研究者发现单胺递质的减少与抑郁症的发病具有相关性,而单胺氧化酶A(MAO-A)的活性异常增高直接导致突触间隙的单胺递质减少,临床应用的一些抗抑郁药就是基于单胺假说而设计的(如丙咪嗪、苯乙肼等),因此,寻找单胺氧化酶抑制剂是发现具有抗抑郁活性药物的途径之一。
本实验根据苄胺在MAO作用下氧化生成苄醛的原理,以环己烷抽提产物在242nm波长处吸收度测定氧化产物的量,指示MAO-A的活性。
3.实验过程
(1)大鼠肝线粒体单胺氧化酶粗酶(MAO)的制备:将Sprague-Dawley大鼠断头处死,取肝,用4℃缓冲液(pH=7.6,0.2M磷酸钠缓冲液)反复冲洗干净,称取10g,剪碎后研磨,用高速分散器打成匀浆,以1∶20(w/v)加入预冷的0.3M蔗糖溶液3000rpm离心10min,取上清液,10000rpm离心30min,取沉淀溶于40ml缓冲液中,高速分散器打匀,分装至40管(1ml/管),并测定蛋白含量(双缩脲法),-80℃贮存备用。
(2)测试样品溶液的制备:精密称取50mg橙皮素对照品,于10ml容量瓶中超声溶解,定容,从该标准液中分别吸取不同体积的溶液,配制成一系列不同浓度的供试溶液,使其加入酶液和试剂一以及试剂二后的浓度分别为400、200、100、50、25、6.25、3.125μg/ml。
(3)MAO-A抑制活性的测定方法:加入MAO-B型抑制剂300μl帕吉林pargyline(500nmol/L)至30ml大鼠肝线粒体酶中,37℃温浴半小时,以抑制MAO-B的活性。在测定管中依次加入一系列待测样品溶液各0.3ml,试剂一(苄胺基质液)0.3ml,试剂二(pH7.6Tris缓冲液)3ml,以及0.6ml酶液,空白管以生理盐水代替酶液,其余相同。放置37℃水浴中3h,取出后各加10%过氯酸0.3ml,各加环己烷3.0ml,在旋涡混合器上旋转混匀2min,离心沉淀(2000r/min)10min,取上清液于石英比色皿内,以空白调零,于242nm波长测定吸光度,测定MAO-A活性。以只加底物不加抑制剂的对照组的酶活性为100%,计算待测物对MAO-A活性的抑制率。
MAO-A活性抑制率=(对照组吸光度-测试组吸光度)/对照组吸光度×100%
4.实验结果
橙皮素对MAO-A活性抑制的IC50值为12.43μM,与阳性对照药吗氯贝胺IC50值(5.25μM)相近,结果表明,橙皮素具有显著的抑制MAO-A活性的作用,提示橙皮素具有抗抑郁药理活性。
实例5.小鼠悬尾应激不动时间的测定实验
1.实验动物
ICR小鼠,18~20g,20只,分为两组,每组10只。
2.样品来源和处理
(1)空白对照组:给予生理盐水。
(2)橙皮素给药组:给予橙皮素溶液,浓度为2.0mg/ml。
3.实验方法
悬尾箱为30×30×30cm,顶部中心设置一个小夹子,将胶布粘在小鼠尾端2cm处,用夹子夹住胶布,使小鼠呈倒悬姿势,头部离箱底约10cm,观察6分钟,记录后4分钟的累计不动时间。判断标准为动物静止不同、不挣扎。结果进行统计学处理。小鼠连续7天给予橙皮素溶液,药效行为学评价结果见表4。
表4.小鼠悬尾应激不动时间列表
结果显示橙皮素能够显著的缩短小鼠悬尾不动时间,具有抗抑郁活性。
上述实验结果显示橙皮苷或其水解代谢产物橙皮素均具有抗抑郁活性,表明橙皮苷或其衍生物具有抗抑郁活性,可用于预防或治疗焦虑状态或抑郁状态。
Claims (3)
1.橙皮苷或其衍生物作为抗抑郁药物的应用,其特征在于:橙皮苷或其衍生物在制备抗抑郁药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述的橙皮苷衍生物是指由橙皮苷经水解或酶解生成的苷元或次生苷得到的衍生物。
3.根据权利要求1-2所述的用途,其特征在于:药物剂型为片剂、胶囊、溶液、悬浮液、注射液、滴注液或冻干粉针等。
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