CN106488769A

CN106488769A - 用于治疗纤维化的赛尼克韦罗

Info

Publication number: CN106488769A
Application number: CN201580021915.3A
Authority: CN
Inventors: E·列菲伏尔
Original assignee: Tobira Therapeutics Inc
Current assignee: Tobira Therapeutics Inc
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2017-03-08
Also published as: RU2016141281A3; JP2017509704A; RU2020119611A; AU2015230986A1; CA2941411A1; EP3119401A2; IL247515A0; SG11201607859SA; BR112016021682A2; WO2015143367A2; AU2020203867A1; SG10201808104RA; US20170239262A1; MX2016012262A; CL2016002372A1; EP3119401A4; KR20160132489A; US20190099429A1; HK1232147A1; EP3922246A1

Abstract

本公开涉及含有赛尼克韦罗的药物组合物、其制备方法及其在治疗炎症和结缔组织疾病和病症尤其是纤维化中的用途。

Description

用于治疗纤维化的赛尼克韦罗

背景

赛尼克韦罗(Cenicriviroc)(也称为CVC)是(S,E)-8-(4-(2-丁氧基乙氧基)苯基)-1-(2-甲基丙基)-N-(4-(((1-丙基-1H-咪唑-5-基)甲基)亚磺酰基)苯基)-1,2,3,4-四氢苯并[b]吖辛因-5-甲酰胺的通用名称。赛尼克韦罗甲磺酸盐的化学结构示于图1中。赛尼克韦罗结合C-C趋化因子受体2型(CCR2)和C-C趋化因子受体5型(CCR5)受体并抑制它们的活性(24)。这些受体不仅在病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)进入细胞的方面起作用，还对于将免疫细胞招募到损伤部位很重要。这种受体活性的抑制可以具有消炎作用。最近，已经调查了炎症在纤维化的发展中所起到的作用[30]。已经证明C-C趋化因子受体2型(CCR2)和CCR5可以在促进肝纤维化方面发挥作用[3,4,5,31,32]。

发明概要

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者中的纤维化或纤维化疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物。在另一个实施方案中，所述纤维化或纤维化疾病或病状是肝纤维化或肾纤维化。在又进一步的实施方案中，肝纤维化与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关。在又进一步的实施方案中，肝纤维化与非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)相关。在又进一步的实施方案中，肝纤维化与新兴肝硬化相关。在又一个实施方案中，肝纤维化包括非肝硬化性肝纤维化。在进一步的实施方案中，所述受试者被人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。在进一步的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物被配制成包含赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物和富马酸的药物组合物。在进一步的实施方案中，所述受试者患有选自由酒精性肝病、HIV和HCV共感染、HCV感染、2型糖尿病(T2DM)、代谢综合征(MS)及其组合所组成的组的疾病或病状。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者中的NASH的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物；其中NASH或与NASH相关联的肝纤维化与2型糖尿病(T2DM)相关。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者中的NASH的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物；其中NASH或与NASH相关的肝纤维化与代谢综合征(MS)相关联。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者中的NASH的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物；其中肝纤维化与HIV和HCV共感染相关。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者中的NASH的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物；其中肝纤维化与HCV感染相关。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其中赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物被配制成口服组合物。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其中赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物是每天施用一次或每天施用两次。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其中赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物是与一种或多种额外的活性剂共施用。在进一步的实施方案中，一种或多种额外的活性剂是选自由以下所组成的组的一种或多种抗逆转录病毒剂：进入抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶链转移抑制剂、成熟抑制剂及其组合。在进一步的实施方案中，一种或多种额外的抗逆转录病毒剂选自由以下所组成的组：拉米夫定、依法韦仑、雷特格韦、威维康、贝韦立马、α-干扰素、齐多夫定、阿巴卡韦、洛匹那韦、利托那韦、替诺福韦、替诺福韦二吡呋酯(tenofovirdisoproxil)、替诺福韦前药、恩曲他滨、埃替格韦、可比司他、地瑞那韦、阿扎那韦、利匹韦林、度鲁特韦及其组合。

在进一步的实施方案中，一种或多种额外的活性剂是一种或多种免疫系统抑制剂。在进一步的实施方案中，一种或多种额外的活性剂选自由以下所组成的组：环孢霉素、他克莫司、泼尼松龙、氢化可的松、西罗莫司、依维莫司、硫唑嘌呤、霉酚酸、甲氨蝶呤、巴利昔单抗、达利珠单抗、利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白及其组合。

在进一步的实施方案中，一种或多种额外的活性剂是一种或多种抗纤维化剂，包括但不限于试剂如N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)以及血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、AT II拮抗剂、奥贝胆酸(OCA)、GFT505、西妥珠单抗(simtuzumab)或其组合。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其包括检测接受纤维化或纤维化疾病或病状治疗的受试者中的一个或多个生物分子的水平，以及基于一个或多个生物分子的水平的增加或减少确定治疗方案，其中所述生物分子选自由以下所组成的组：脂多糖(LPS)、LPs结合蛋白(LBP)、16S rDNA、sCD14、肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、连蛋白-1(zonulin-1)、胶原蛋白1a1和3a1、TGF-β、纤连蛋白-1及其组合。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其包括检测接受纤维化或纤维化疾病或病状治疗的受试者中的一个或生物分子的水平，其中一个或多个生物分子的水平相较于预定标准水平的增加或减少预测纤维化或纤维化疾病或病状的治疗功效，其中所述生物分子选自由以下所组成的组：脂多糖(LPS)、LPs结合蛋白(LBP)、16S rDNA、sCD14、肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、连蛋白-1、胶原蛋白1a1和3a1、TGF-β、纤连蛋白-1及其组合。

在进一步的实施方案中，一个或多个生物分子是在来自接受纤维化或纤维化疾病或病状治疗的受试者的生物样品中进行测量。在又进一步的实施方案中，生物样品选自血液、皮肤、毛囊、唾液、口腔粘膜、阴道粘膜、汗液、泪液、上皮组织、尿液、精子、精液、精浆、前列腺液、预射精液(考珀液)、排泄物、活检物、腹水、脑脊液、淋巴、脑以及组织提取物样品或活检样品。

附图简述

图1是赛尼克韦罗甲磺酸盐的化学式。

图2是比较混配成口服溶液的赛尼克韦罗甲磺酸盐与通过湿式制粒制备并与各种酸性增溶剂赋形剂混合的赛尼克韦罗甲磺酸盐在比格犬中的绝对生物利用度的图表。

图3是当与干燥剂一起包装时接受40℃和75％相对湿度下的加速稳定性测试的不同赛尼克韦罗制剂的总杂质和降解物含量的图表。

图4是不同赛尼克韦罗制剂的动态蒸汽吸附等温线。

图5示出了在比格犬中，在三种预处理状态下，赛尼克韦罗从不同制剂的吸收。

图6示出了组合片剂中的赛尼克韦罗和拉米夫定的比格犬绝对生物利用度。

图7(A-B)示出了研究202中的参与者在第24周的PBMC中的细胞内HIV DNA水平。散点图描绘细胞内HIV DNA水平在基线和24周之间的倍数变化，并按治疗组分开。线和误差棒分别表示平均值和标准误差测量。使用HIV/GAPDH复合qPCR反应中的ΔΔCT来计算倍数变化，其中以每个患者的基线样品作为校准品。A)全长HIV DNA(晚期逆转录物)；B)强终止HIVDNA(早期逆转录物)

图8(A-B)示出了CVC和MVC对培养液中的R5嗜性病毒RNA和p24的影响。A)对照或经CVC或MVC处理的细胞在感染后4小时的培养液中的病毒载量水平。误差棒表示标准偏差。代表两个独立的实验。B)对照或经CVC或MVC处理的细胞在感染后4小时的培养液中的平均p24抗原水平。误差棒表示标准偏差。代表两个独立的实验。

图9示出了CVC和MVC对R5嗜性细胞内HIV DNA水平的影响。经CVC或MVC处理的细胞相比于无药物对照在4小时后的细胞内强终止DNA水平的平均倍数变化。误差棒表示标准偏差。使用HIV/GAPDH复合qPCR反应中的ΔΔCT来计算倍数变化，其中以4小时下的无药物对照作为校准品。代表两个独立的实验。

图10示出了CVC进入CCR5中的多种结合模式。CCR5的坐标是从与结合口袋中的马拉维诺结合的CCR5晶体结构(PDB ID:4MBS)生成。在CVC对接后检查CVC结合位点。CVC的对接姿态展示为有色细线。七个跨膜(7TM)a-螺旋结构由螺旋线表示并根据氨基酸序列的顺序(1-7)进行编号。(A)从具有三个圈出的潜在结合位点(位点1(白色)、位点2(黑色)和位点3(浅粉色))的受体的胞外侧查看的俯视图。(B)CCR5跨膜腔内的侧视图。胞外环2(ECL2)被标记。次级结构被表示为卡通结构。使用PyMOL软件处理所有图像。

图11示出了CCR5/马拉维诺和CCR5/赛尼克韦罗之间的配体结合口袋的比较。CCR5的俯视图展示了CVC(左，有色细线)和MVC(右，黄色棒)在配体结合口袋中的对接姿态。CCR5示出于分子表面表示中。涉及gp120结合的关键残基Tyr37、Trp86、Trp94、Leu104、Tyr108、Phe109、Phe112、Thr177、Ile198、Trp248、Tyr251、Leu255和Glu283位于口袋深处并且颜色是红色。

图12示出了在肾纤维化的小鼠UUO模型中评价CVC的研究示意图。以BID施用媒介物对照和CVC；以QD BID施用抗TGF-β1抗体(化合物1D11，阳性对照)；每天两次；CVC，赛尼克韦罗；ip，腹膜内；PBS，磷酸盐缓冲盐水；QD，每天一次；TGF，转化生长因子；UUO，单侧输尿管梗阻。

图13示出了肾纤维化小鼠UUO模型中的每个治疗组中的体重变化(第5天)。

图14示出了肾纤维化小鼠UUO模型中的每个治疗组中的胶原容积分数(CVF；面积％)评分。呈现的数据从CVC 20mg/kg/天组中的动物排除异常值，其具有大于比群组中的任何其它动物高2倍标准偏差的CVF值。

图15示出了来自假手术的肾皮质组织的mRNA表达

图16示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物中直到第9周的体重变化。

图17A-C示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物中直到第9周的肝重和体重变化。面板A显示体重变化，面板B显示肝重变化，且面板C显示肝重体重比变化。

图18A-F示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的全血和生物化学。面板A显示全血葡萄糖，面板B显示血浆ALT，面板C显示血浆MCP-1，面板D显示血浆MIP-1β，面板E显示肝脏甘油三酯，且面板F显示肝脏羟脯氨酸。

图19示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的HE染色肝脏切片。

图20示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的NAFLD活性评分。

图21示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的天狼星红染色肝脏切片的代表性显微照片。

图22示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的F4/80免疫染色肝脏切片的代表性显微照片。

图23示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的炎症区域的百分比。

图24示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的F4/80和CD206双重免疫染色肝脏切片的代表性显微照片。

图25示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的F4/80和CD206双阳性细胞的百分比。

图26示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的F4/80和CD16/32双重免疫染色肝脏切片的代表性显微照片。

图27示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的F4/80阳性细胞的F4/80和CD16/32双阳性细胞的百分比。

图28示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的M1/M2比。

图29示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的油红染色肝脏切片的代表性显微照片。

图30示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的脂肪沉积区域的百分比。

图31示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的肝脏中的TUNEL阳性细胞的代表性显微照片。

图32示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的TUNEL阳性细胞的百分比。

图33示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的定量RT-PCR。测量了TNF-α、MCP-1、1型胶原蛋白和TIMP-1的水平。

图34A-F示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第9周的定量RT-PCR的原始数据。面板A显示36B4的水平，面板B显示TNF-α的水平，面板C显示TIMP-1的水平，面板D显示1型胶原蛋白的水平，面板E显示36B4的水平，且面板f显示MCP-1的水平。

图35示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物从第6周到第18周的体重变化。

图36示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物从第6周到第18周的生存曲线。

图37A-C示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第18周的体重和肝重。面板A显示体重，面板B显示肝重，且面板C显示肝重体重比。

图38A-C示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第18周的肝脏宏观外表。面板A显示仅用媒介物治疗的动物的肝脏，面板B显示用低剂量赛尼克韦罗治疗的动物的肝脏，且面板C显示用高剂量赛尼克韦罗治疗的动物的肝脏。

图39示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第18周的可见肿瘤结节的数量。

图40示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第18周的可见肿瘤结节的最大直径。

图41示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第18周的HE染色肝脏切片的代表性显微照片。

图42示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第18周的GS免疫染色肝脏切片的代表性显微照片。

图43示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第18周的CD31免疫染色肝脏切片的代表性显微照片。

图44示出了经赛尼克韦罗(低或高剂量)治疗的动物在第18周的CD31阳性区域的百分比。

图45示出了不同定群和研究日的HIV-1RNA水平从基线变化的中位数–研究201。

图46是具有HIV-1RNA<50个拷贝/mL的受试者随时间推移直到第48周的比例–快照算法–ITT–研究202。

图47示出了sCD14水平(106pg/mL)随时间推移直到第48周的LS平均基线变化-ITT。

图48示出了在基线处、第24周和第48周根据APRI和FIB-4纤维化指数评分进行分组的经CVC(合并数据)和EFV治疗的受试者。

图49示出了基线APRI变化对基线sCD14变化的散点图-第48周(ITT)。

图50示出了基线FIB-4变化对基线sCD14变化的散点图-第48周(ITT)。

图51示出了肌酸磷酸激酶(CPK)随时间推移直到第48周的平均基线变化-安全性群体。

图52示出了不同严重度分级的CPK升高对c_avg(ng/mL)的点密度显示-第48周。

图53示出了不同严重度分级的ALT升高对c_avg(ng/mL)的点密度显示-第48周。

图54示出了不同严重度分级的AST升高对c_avg(ng/mL)的点密度显示-第48周。

图55示出了不同严重度分级的胆红素升高对c_avg(ng/mL)的点密度显示-第48周。

图56示出了空腹总胆固醇、LDL胆固醇计算值、HDL胆固醇和甘油三酯(mg/dL)随时间推移直到第48周的平均基线变化。

详细描述

应当理解的是，单数形式如“一”、“一个”和“所述/该”在整个本申请中是为了方便而使用，然而，除非上下文或明确的陈述另外指出，否则单数形式也意图包括复数。此外，应该理解的是，本文中所提到的每个期刊文章、专利、专利申请、出版物等在此通过引用整体并入本文并用于所有目的。所有的数值范围应当被理解为包括该数值范围内的每一个数值点，并且应该被解释为单独地列举每一个数值点。涉及相同组分或性质的所有范围的端点是包含性的并且意图为可独立地组合。

定义：

除了下面所讨论的术语，在本申请中使用的所有术语旨在具有本领域技术人员在本发明的时间下将赋予它们的含义。

“约”包括具有与参考值大体上相同的效果或提供大体上相同的结果的所有值。因此，由术语“约”涵盖的范围将根据使用该术语的上下文而变化，例如，与参考值相关联的参数。因此，根据上下文，“约”可以意指例如±15％、±10％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％或±小于1％。重要的是，由术语“约”开头的参考值的所有列举旨在也是参考值的单独列举。尽管有前述内容，但在本申请中，术语“约”具有关于药代动力学参数如曲线下面积(包括AUC、AUC_t和AUC_∞)、C_max、T_max等的特殊含义。当与药代动力学参数的值关联使用时，术语“约”意指参考参数的80％至125％。

“赛尼克韦罗”是指化合物(S)-8-[4-(2-丁氧基乙氧基)苯基]-1-异丁基-N-(4-{[(1-丙基-1H-咪唑-5-基)甲基]亚磺酰基}苯基)-1,2,3,4-四氢-1-苯并吖辛因-5-甲酰胺(结构如下所示)。赛尼克韦罗的物质组成的细节公开于美国专利申请公开号2012/0232028中，该申请出于所有目的在此通过引用整体并入。有关制剂的细节公开于美国申请号61/823,766中，该申请在此通过引用整体并入以供所有目的使用。

“本发明的化合物”或“本化合物”是指赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物。

“大体上类似”意指组合物或制剂的特性和量在很大程度上类似于参照组合物或制剂的组合物或制剂。

“药学上可接受的”是指物质或方法例如在向受试者施用方面用于医学或药学中，包括用于兽医目的的。

“盐”和“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐。“酸加成盐”是指保留游离碱的生物有效性和性质，在生物学上或在其它方面并非不合需要，并且由无机酸和有机酸形成的那些盐。“碱加成盐”是指保留游离酸的生物有效性和性质，在生物学上或在其它方面并非不合需要，并且由无机碱或有机碱加成到游离酸上所制备的那些盐。药学上可接受的盐的实例包括但不限于：碱性残基诸如胺的无机或有机酸加成盐；酸性残基的碱金属或有机加成盐；和类似物，或包括前述盐中的一种或多种的组合。药学上可接受的盐包括活性剂的盐和季铵盐。例如，酸盐包括那些由无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等衍生的盐；其它可接受的无机盐包括金属盐如钠盐、钾盐、铯盐等；和碱土金属盐如钙盐、镁盐等，或包括前述盐中的一种或多种的组合。药学上可接受的有机盐包括由有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、羟乙酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙磺酸、HOOC-(CH₂)_n-COOH(其中n是0-4)等制备的盐；有机胺盐如三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、乙醇胺盐、三乙醇胺盐、二环己基胺盐、N,N'-二苄基乙二胺盐等；以及氨基酸盐如精氨酸、天冬氨酸盐、谷氨酸盐等；或包括前述盐中的一种或多种的组合。

在一个实施方案中，赛尼克韦罗的酸加成盐是赛尼克韦罗甲磺酸盐，例如(S)-8-[4-(2-丁氧基乙氧基)苯基]-1-异丁基-N-(4-{[(1-丙基-1H-咪唑-5-基)甲基]亚磺酰基}苯基)-1,2,3,4-四氢-1-苯并吖辛因-5-甲酰胺单甲磺酸盐。在一个实施方案中，赛尼克韦罗甲磺酸盐是结晶材料，诸如浅绿黄色结晶粉末。在一个实施方案中，赛尼克韦罗甲磺酸酯易溶于冰醋酸、甲醇、苯甲醇、二甲亚砜和N,N-二甲基甲酰胺；可溶于吡啶和乙酸酐；以及难溶于99.5％乙醇；微溶于乙腈、1-辛醇和四氢呋喃；并且几乎不溶于乙酸乙酯和乙醚。在一个实施方案中，赛尼克韦罗甲磺酸盐易溶于pH为1至2的水溶液；在pH3下难溶并且在pH 4至13下几乎不溶于水中。

“溶剂化物”意指通过溶剂化(溶剂分子与本发明活性剂的分子或离子的结合)形成的复合物，或由溶质离子或分子(即，本发明的活性剂)与一个或多个溶剂分子组成的聚集体。在本发明中，优选的溶剂化物是水合物。

“药物组合物”是指本公开的化合物和本领域中普遍接受的用于将生物活性化合物递送给哺乳动物(例如人类)的介质的制剂。这种介质包括所有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

“治疗”包括改善、缓和以及减轻疾病或病状的例子，或疾病或病状的症状。

“施用”包括任何施用方式，诸如口服、皮下、舌下、经粘膜、胃肠外、静脉内、动脉内、经颊、舌下、局部、经阴道、经直肠、经眼、经耳、经鼻、吸入和经皮。“施用”还可以包括开处方或对于包含特定化合物的剂型配处方。“施用”还可以包括提供对实施涉及特定化合物或包含该化合物的剂型的方法的说明书。

“治疗有效量”意指当施用给受试者用于治疗疾病、病症或其它不希望的医学病状时足以具有针对该疾病、病症或病状的有益效果的活性物质的量。治疗有效量将根据活性物质的化学特性和制剂形式、疾病或病状及其严重程度以及待治疗的患者的年龄、体重和其它相关特性而变化。确定给定的活性物质的治疗有效量是在本领域的一般技术范围内并且通常只需要常规实验。

纤维化：

纤维化是在修复或反应过程中过量纤维结缔组织在器官或组织中的形成。这可以是反应性、良性或病理状态。结缔组织在器官和/或组织中的沉积可以摧毁下面的器官或组织的结构和功能。纤维化是纤维组织的过量沉积的这种病理状态，以及在愈合时结缔组织沉积的过程。

纤维化与疤痕形成过程的相似性在于两者都涉及位于结缔组织下方的刺激细胞，其包括胶原蛋白和糖胺聚糖。介导许多免疫和炎性反应的细胞因子在纤维化的发展中发挥作用。由诸如脂肪堆积、病毒病原、过量饮酒、肝毒素的因素导致的肝细胞损伤不可避免地触发炎性免疫反应。细胞因子和趋化因子在肝脏中的产量增加导致募集促炎性单核细胞(前体细胞)，它们随后成熟为促炎性巨噬细胞。促炎性巨噬细胞在性质上是促纤维生成的，并且最终导致肝星状细胞(HSC)的活化，肝星状细胞主要负责细胞外基质(ECM)的沉积。

导致炎症的各种免疫细胞群的浸润是急性和慢性肝损伤后的中央病原特征。慢性肝脏炎症导致连续肝细胞损伤，这可以导致纤维化、肝硬化、ESLD和HCC。肝内免疫细胞之间的相互作用增加枯否细胞(Kupffer cell)和HSC的活化和迁移，并且对于肝纤维化的发展是关键事件。另外，关于CCR2和CCR5在肝纤维化的发病机制中的作用的证据越来越多[1-7,9,31]。C-C趋化因子家族的这些成员由促纤维生成细胞表达，所述细胞包括促炎性单核细胞和巨噬细胞、枯否细胞和HSC[1-4]。CCR2信号传导通过调节骨髓源性成纤维细胞而在肾纤维化的发病机制中起重要作用[8]。CCR2阳性和CCR5阳性单核细胞以及CCR5阳性T淋巴细胞被局部释放的MCP-1和RANTES吸引，并且能够促进肾脏中的慢性间质性炎症[10,11]。在啮齿动物中，CVC在肝脏、肠系膜淋巴结和肠(也被描述为肠-肝轴)中具有高分布。肠道菌群的破坏和其对肠-肝轴的下游效应都在代谢障碍如肥胖、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中起重要作用[16,23]。

表1列出了由肝细胞表达的趋化因子[30]。

肝星状细胞(HSC)的活化在肝纤维化的发病机制中起重要作用。在肝损伤后，肝星状细胞(HSC)被激活并表达基质金属蛋白酶(MMP)和其特异性组织抑制剂(TIMP)的组合[32]。在肝损伤的早期阶段，HSC瞬时表达MMP-3、MMP-13和尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化剂(uPA)并且表现出基质降解表型。细胞外基质的降解似乎不是CCR2或CCR5依赖性的。

激活的HSC可以通过诱导单形核白细胞和多形核白细胞的浸润增强炎症反应。浸润性单核细胞和巨噬细胞通过几种机制(包括增加细胞因子的分泌和产生氧化应激相关产物)参与纤维化的发展。激活的HSC可以表达CCR2和CCR5并且产生趋化因子，包括MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。CCR2促进HSC趋化性和肝纤维化的发展。在人类肝脏疾病中，增加的MCP-1与巨噬细胞募集以及肝纤维化和原发性胆汁性肝硬化的严重程度有关。CCR5刺激HSC迁移和增殖。

在肝损伤和HSC活化的后期阶段，模式发生变化且细胞表达具有降解正常肝基质的能力的MMP的组合，同时抑制在肝纤维化中的累积的纤维状胶原的降解。这种模式的特征为促MMP-2和膜型1(MT1)-MMP表达的组合，其促使活性MMP-2在细胞周围的产生和正常肝基质的局部降解。另外，TIMP-1的表达显着增加，导致更全面地抑制间质胶原酶(MMP-1/MMP-13)降解纤维状肝脏胶原。在与慢性酒精性肝病相关的肝损伤中，TNF-α、IL-1、IL-6以及趋化因子IL-8/CXCL8的产生增加。TNF-α也是非酒精性脂肪肝病的重要介质。这些路径在肝纤维化的进展中起重要作用。抑制HSC的活化和加快活化HSC的清除可以是用于解决肝纤维化的有效策略。

趋化因子家族在炎症中起着重要的调节作用。这个家族的成员包括但不限于：CXC受体和配体，包括但不限于：CXCR1、CXCR22、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CXCR8、CXCR9、CXCR10、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16和CXCL17；CC趋化因子和受体，包括但不限于CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR和CCR10；C趋化因子，包括但不限于XCL1、XCL2和XCR1；以及CX3C趋化因子，包括但不限于CS3CL1和CX3CR1。这些分子在纤维化器官或组织中可以被上调。在进一步的实施方案中，这些分子在纤维化器官或组织中可以被下调。在进一步的实施方案中，这些趋化因子的信号传导路径中的分子可以在纤维化器官或组织中被上调。在进一步的实施方案中，这些趋化因子的信号传导路径中的分子可以在纤维化器官或组织中被下调。

纤维化可以发生在身体内的许多组织中，包括但不限于肺、肝、骨髓、关节、皮肤、消化道、淋巴结、血管或心脏并且通常是炎症或损伤的结果。非限制性实例包括肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、肝硬化、心内膜心肌纤维化、心肌梗塞、心房纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、尘肺病并发症、肾原性系统性纤维化、克罗恩氏病(Crohn's Disease)、瘢痕疙瘩、硬皮病/系统性硬化症、关节纤维化、佩罗尼氏病(Peyronie's disease)、掌腱膜挛缩症(Dupuytren's contracture)、与动脉粥样硬化相关的纤维化、淋巴结纤维化和粘连性关节囊炎。

治疗效用的实施方案：

本发明提供了治疗纤维化的方法。当在肝损伤发作(TAA)时或不久之后(TAA；HFD)开始CVC治疗时，在动物研究中观察到CVC的抗纤维化效果，但一次也没有确立肝硬化(TAA)。这表明CVC的抗纤维化效果在具有确立的肝纤维化并处在重大的疾病进展风险下的群体中可能更显著。这些包括：与2型糖尿病(T2DM)和代谢综合征(MS)相关的非酒精性肝脂肪变性(NASH)；HIV和HCV共感染，或HCV感染。

NASH

本发明的组合物可以用于治疗由非酒精性脂肪性肝炎(NASH)引起的肝纤维化，NASH是影响2％至5％的美国人的常见肝脏疾病。虽然由于NASH所导致的肝损伤具有酒精性肝病的一些特点，但是它发生在很少或根本不饮酒的人中。NASH的主要特征是肝脏中的脂肪，以及炎症和肝细胞损伤(气球样变性)。NASH可以是严重的并且可以导致肝硬化，其中肝被永久损伤并结疤，并且不再能够适当地工作。非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是与肥胖相关性病症如2型糖尿病和代谢综合征相关的常见且经常“沉默”的肝病，其发生在很少或根本不饮酒的人中，并且特征是脂肪在肝脏中的积累，没有其它明显的原因。[32-43]NAFLD疾病谱的起点是简单的脂肪变性，其特征是脂肪在肝脏中的累积。无炎症的肝脏脂肪变性通常是良性和缓慢的或无进展的。NASH是NAFLD的更晚期和严重的亚型，其中脂肪变性并发肝细胞损伤和炎症，伴有或不伴有纤维化。

肥胖相关性病症的患病率上升已经促使NASH的患病率迅速增加。患有NAFLD的受试者的约10％至20％将会进展至NASH[44]。

NAFLD是慢性肝病的最常见的原因。[45]大多数美国研究报告了10％到35％的NAFLD患病率；然而，这些比率随研究群体和诊断方法而变化。[46]由于美国人口的大约三分之一被认为是肥胖的，因此NAFLD在美国人口中的患病率可能是约30％。[46]一项研究发现，NAFLD影响约27％至34％的美国人，或估计8600万至1.08亿名患者。[44]NAFLD不是美国所独有的。来自世界的其它地方(包括巴西、中国、印度、以色列、意大利、日本、韩国、斯里兰卡和台湾)的报告表明，患病率在6％到35％的范围内(20％的中位数)。[46]由澳大利亚胃肠病学会(Gastroenterological Society of Australia)/澳大利亚肝脏协会(Australian Liver Association)进行的一项研究发现，NAFLD影响估计有550万澳大利亚人，包括年龄≥50岁的所有成年人的40％。[47]澳大利亚的一项重度肥胖患者的研究发现，这些患者中的25％患有NASH。[48]

需要进行肝活检来作出NASH的确诊。I在美国的一项中年个体研究中，组织学上确认的NASH的患病率为12.2％。[49]目前估计NASH患病率在美国为约900至1500万(美国人口的3％至5％)，并且在欧盟和中国有类似的患病率。[46,50]NASH在肥胖人群中的患病率是在10％至56％的范围内(33％的中位数)。[46]在来自加拿大的精瘦个体的尸检系列中，脂肪性肝炎和肝纤维化的患病率分别为3％和7％。[46]NASH的患病率在发展中地区也在增加，这被归因于这些地区的人们开始采取更久坐的生活方式和由具有高脂肪和高糖/果糖含量的加工食品组成的西化饮食[51]。[52]

NASH是由肝脂肪变性和炎症以及肝细胞损伤的存在确定的严重慢性肝病，其伴有或不伴有纤维化。[34]慢性肝脏炎症是纤维化的前兆，其可以发展为肝硬化、晚期肝病和肝细胞癌。除了胰岛素抗性之外，改变的脂质储存和代谢、肝内胆固醇的累积、导致肝损伤增加的氧化应激和继发于肠道菌群破坏(与含高果糖的饮食相关)的细菌易位[34,53-56]都已被暗示为有助于NASH进展的重要辅因素。[57-60]由于肥胖和糖尿病的日益流行，NASH预计将成为晚期肝病的最常见原因以及肝移植的最常见适应症。[46,61-63]NASH的负担以及缺乏任何批准的治疗性干预代表了未满足的医疗需求。

在进一步的实施方案中，肝纤维化与新兴肝硬化相关联。在一些实施方案中，肝硬化与酒精损害有关。在进一步的实施方案中，肝硬化与肝炎感染有关，所述肝炎感染包括但不限于B型肝炎和C型肝炎感染、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎或脂肪肝疾病。在一些实施方案中，本发明提供了治疗有发展为肝纤维化或肝硬化的风险的受试者的方法。

在另一个实施方案中，纤维化包括非肝硬化性肝纤维化。在另一个进一步的实施方案中，受试者被人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。在又一个进一步的实施方案中，受试者感染了肝炎病毒，包括但不限于HCV(C型肝炎病毒)。在进一步的实施方案中，受试者具有糖尿病。在进一步的实施方案中，受试者具有2型糖尿病。在进一步的实施方案中，受试者具有1型糖尿病。在进一步的实施方案中，受试者具有代谢综合征(MS)。在进一步的实施方案中，受试者具有这些疾病或障碍中的一个或多个。在进一步的实施方案中，受试者有发展为这些疾病中的一个或多个的风险。在进一步的实施方案中，受试者具有胰岛素抗性。在进一步的实施方案中，受试者具有增加的血糖浓度、高血压、升高的胆固醇水平、升高的甘油三酯水平，或者是肥胖的。在进一步的实施方案中，受试者具有多囊卵巢综合征。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其中赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物是与一种或多种额外的活性剂共施用。在进一步的实施方案中，一种或多种额外的活性剂是选自以下的一种或多种抗逆转录病毒剂：进入抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶链转移抑制剂、成熟抑制剂及其组合。在进一步的实施方案中，一种或多种额外的抗逆转录病毒剂选自由以下所组成的组：拉米夫定、依法韦仑、雷特格韦、威维康(vivecon)、贝韦立马(bevirimat)、α-干扰素、齐多夫定、阿巴卡韦、洛匹那韦、利托那韦、替诺福韦、替诺福韦二吡呋酯(tenofovirdisoproxil)、替诺福韦前药、恩曲他滨、埃替格韦、可比司他、地瑞那韦、阿扎那韦、利匹韦林、度鲁特韦(dolutegravir)及其组合。在进一步的实施方案中，一种或多种额外的活性剂是一种或多种免疫系统抑制剂。在进一步的实施方案中，一种或多种额外的活性剂选自由以下所组成的组：环孢霉素、他克莫司、泼尼松龙、氢化可的松、西罗莫司、依维莫司、硫唑嘌呤、霉酚酸、甲氨蝶呤、巴利昔单抗、达利珠单抗、利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白及其组合。

某些实施方案包括用于监测和/或预测如本文所述的本治疗的治疗功效的方法。此类方法包括检测接受纤维化或纤维化疾病或病状治疗的受试者中(或来自该受试者的生物样品中)的一个或多个生物分子如(例如)生物标记物的水平，其中一个或多个生物分子的水平相较于预定标准水平的增加或减少指示或预测本治疗的治疗功效。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其包括检测接受纤维化或纤维化疾病或病状治疗的受试者中的一个或多个生物分子的水平，以及基于一个或多个生物分子的水平的增加或减少确定治疗方案，其中所述生物分子选自由以下所组成的组：脂多糖(LPS)、LPS结合蛋白(LBP)、16S rDNA、sCD14、肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、连蛋白-1、胶原蛋白1a1和3a1、TGF-β、纤连蛋白-1、hs-CRP、IL-1β、IL-6、IL-33、纤维蛋白原、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β、RANTES、sCD163、TGF-β、TNF-α、肝细胞凋亡的生物标记物如CK-18(半胱天冬酶裂解型和完整型)、或细菌易位的生物标记物如LPS、LBP、sCD14和I-FABP，或其组合。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其包括检测接受纤维化或纤维化疾病或病状治疗的受试者中的一个或多个生物分子的水平，其中一个或多个生物分子的水平相较于预定标准水平的增加或减少预测纤维化或纤维化疾病或病状的治疗功效。

剂量和施用：

特定受试者的剂量可以根据该受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别、膳食、施用时间、施用途径、排泄速率和待治疗的特定疾病状况的程度通过将这些和其它因素考虑在内来确定。

本发明提供一种治疗方法，其中赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物被配制成口服组合物。

本发明提供一种治疗方法，其中赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物是例如每天施用一次或每天施用两次。可以施用所述剂型达足以治疗纤维化疾病或病状的持续时间。

在口服施用的情况下，日剂量是在每体重50kg的成人约5至1000mg，优选约10至600mg，以及更优选约10至300mg，最优选约15至200mg活性成分(即作为本发明的化合物)的范围内，并且药物可以例如每天施用一次或以2至3个分剂量施用。

赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物可以被配制成适合于口服或注射施用的任何剂型。当口服施用该化合物时，它可以被配制成用于口服施用的固体剂型，例如，片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂等等。它还可以被配制成用于口服施用的液体剂型，诸如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆等。如本文所用的术语“片剂”指的是通过将化合物和合适的辅料均匀地混合和压制成为圆形或不规则的锭剂所制备的那些固体制剂，主要是用于口服施用的普通片剂，还包括口含片剂、舌下片剂、颊晶片、咀嚼片剂、分散片剂、可溶性片剂、泡腾片、缓释片剂、控释片剂、肠溶片剂等。如本文所用的术语“胶囊”指的是通过将化合物或化合物与合适的辅料一起填充到空心胶囊中或密封进软胶囊材料中所制备的那些固体制剂。根据溶解性和释放性质，胶囊可以分为硬胶囊(常规胶囊)、软胶囊(软壳胶囊)、缓释胶囊、控释胶囊、肠溶胶囊等。如本文所用的术语“丸剂”指的是通过经由合适的方法混合化合物和合适的辅料所制备的球形或接近球形的固体制剂，包括滴丸、糖衣丸、小丸等。如本文所用的术语“颗粒剂”是指通过混合化合物和合适的辅料所制备并具有一定粒度的干燥颗粒状制剂。颗粒剂可以分为可溶性颗粒剂(通常称为颗粒剂)、悬浮颗粒剂、泡腾颗粒剂、肠溶颗粒剂、缓释颗粒剂、控释颗粒剂等。如本文所用的术语“口服溶液剂”是指通过将化合物溶解在适用于口服施用的溶剂中所制备的沉降液体制剂。如本文所用的术语“口服混悬剂”是指通过将不溶性化合物分散于液体媒介物中所制备的用于口服施用的混悬剂，还包括干燥混悬剂或浓缩混悬剂。如本文所用的术语“糖浆”是指含有化合物的浓缩蔗糖水溶液。可注射剂型可以通过制剂领域中的常规方法来生产，并且可以选择水性溶剂或非水性溶剂。最常用的水性溶剂是注射用水，以及0.9％氯化钠溶液或其它合适的水溶液。常用的非水性溶剂是植物油，主要是注射用大豆油，以及醇、丙二醇、聚乙二醇等的其它水溶液。

在一个实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含赛尼克韦罗或其盐和富马酸。在某些实施方案中，赛尼克韦罗或其盐是赛尼克韦罗甲磺酸盐。

在进一步的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐对富马酸的重量比为约7:10至约10:7，诸如约8:10至约10:8、约9:10至约10:9或约95:100至约100:95。在其它进一步的实施方案中，富马酸按组合物的重量计是以约15％至约40％，诸如约20％至约30％，或约25％的量存在。在其它进一步的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐按组合物的重量计是以约15％至约40％，诸如约20％至约30％，或约25％的量存在。

在其它进一步的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐和富马酸的组合物进一步包含一种或多种填充剂。在更具体的实施方案中，所述一种或多种填充剂选自微晶纤维素、磷酸氢钙、纤维素、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、淀粉和碳酸钙。例如，在某些实施方案中，一种或多种填充剂是微晶纤维素。在具体的实施方案中，一种或多种填充剂对赛尼克韦罗或其盐的重量比是约25:10至约10:8，诸如约20:10至约10:10，或约15:10。在其它具体的实施方案中，一种或多种填充剂按组合物的重量计是以约25％至约55％，诸如约30％至约50％或约40％的量存在。在其它进一步的实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种崩解剂。在更具体的实施方案中，所述一种或多种崩解剂选自交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠和羟乙酸淀粉钠。例如，在某些实施方案中，一种或多种崩解剂是交联羧甲基纤维素钠。在具体的实施方案中，一种或多种崩解剂对赛尼克韦罗或其盐的重量比是约10:10至约30:100，诸如约25:100。在其它具体的实施方案中，一种或多种崩解剂按组合物的重量计是以约2％至约10％％，诸如约4％至约8％，或约6％的量存在。在其它进一步的实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种润滑剂。在更具体的实施方案中，所述一种或多种润滑剂选自滑石、二氧化硅、硬脂精、硬脂酸镁和硬脂酸。例如，在某些实施方案中，一种或多种润滑剂是硬脂酸镁。在具体的实施方案中，一种或多种润滑剂按组合物的重量计是以约0.25％至约5％，诸如约0.75％至约3％，或约1.25％的量存在。

在其它进一步的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐和富马酸的组合物大体上类似于表2的组合物。在其它进一步的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐和富马酸的组合物大体上类似于表3和4的组合物。在其它进一步的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐和富马酸的任何组合物是通过包括干式制粒的方法来生产。在其它进一步的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐和富马酸的任何组合物当与干燥剂包装在一起时，在约75％相对湿度下暴露于约40℃下六周后具有不超过约4重量％的水含量，诸如不超过2重量％。在其它进一步的实施方案中，任何上述组合物当与干燥剂包装在一起时，在75％相对湿度下暴露于40℃下12周后具有不超过约2.5％的总杂质水平，诸如不超过1.5％。在其它进一步的实施方案中，任何上述组合物的赛尼克韦罗或其盐在口服施用后具有大体上类似于溶液中的赛尼克韦罗或其盐在口服施用后的生物利用度的平均绝对生物利用度。在又进一步的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐在比格犬中具有约10％至约50％(如约27％)的绝对生物利用度。

在另一个实施方案中，提供了一种药物制剂，其包含赛尼克韦罗或其盐和富马酸的组合物。在进一步的实施方案中，所述制剂中的组合物可以是颗粒的形式。在其它进一步的实施方案中，制剂中的组合物被布置在胶囊壳中。在其它进一步的实施方案中，制剂的组合物被布置在小袋中。在其它进一步的实施方案中，制剂的组合物是片剂或片剂的组分。在其它更进一步的实施方案中，所述制剂的组合物是多层片剂的一个或多个层。在其它进一步的实施方案中，所述制剂包含一种或多种额外的药学上无活性的成分。在其它进一步的实施方案中，所述制剂大体上类似于表9中的制剂。在其它进一步的实施方案中，提供了具有大体上类似于表9的组成的片剂。在其它进一步的实施方案中，任何上述实施方案是被涂覆的基材。在另一个实施方案中，提供了制备任何上述实施方案的方法。在进一步的实施方案中，所述方法包括掺混赛尼克韦罗或其盐和富马酸以形成混合物，并且将该混合物干式制粒。在其它进一步的实施方案中，所述方法进一步包括将一种或多种填充剂与赛尼克韦罗或其盐以及富马酸混合以形成混合物。在其它进一步的实施方案中，所述方法进一步包括将一种或多种崩解剂与赛尼克韦罗或其盐以及富马酸混合以形成混合物。在其它进一步的实施方案中，所述方法进一步包括将一种或多种润滑剂与赛尼克韦罗或其盐以及富马酸混合以形成混合物。在其它进一步的实施方案中，所述方法进一步包括将干式制粒的混合物压缩成片剂。在其它进一步的实施方案中，所述方法包括用干式制粒的混合物填充胶囊。

此外，本发明的化合物可以包含在输血用血或血液衍生物中或与其组合使用。在一个实施方案中，本发明的化合物可以与清除潜伏HIV储器并加入输血用血或血液衍生物中的一种或多种药剂组合地被包括或使用。通常，输血用血或血液衍生物是通过混合从多个人员获得的血液而产生，并且在一些情况下，未感染的细胞被感染HIV病毒的细胞污染。在这样的情况下，未感染细胞有可能感染HIV病毒。当本发明的化合物与清除潜伏HIV储器的一种或多种药剂一起被加入输血用血或血液衍生物中时，可以防止或控制病毒的感染和增殖。特别是当储存血液衍生物时，加入本发明的化合物能有效地防止或控制病毒的感染和增殖。另外，当将被HIV病毒污染的输血用血或血液衍生物施用给人时，可以通过将本发明的化合物与清除潜伏HIV储器的一种或多种药剂一起添加到血液或血液衍生物中防止该病毒在人的身体内的感染和增殖。例如，通常对于预防通过口服施用使用血液或血液衍生物后的HIV感染性疾病而言，剂量是在每体重约60kg的成人约0.02至50mg/kg，优选约0.05至30mg/kg，以及更优选约0.1至10mg/kg CCR5/CCR2拮抗剂的范围内，并且药物可以每天施用一次或以2至3个剂量施用。当然，虽然可以基于分开日剂量所需的单位剂量控制剂量范围，但如上所述，特定受试者的剂量可以根据该受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别、膳食、施用时间、施用途径、排泄速率和待治疗的特定疾病状况的程度通过将这些和其它因素考虑在内来确定。在这种情况下，施用途径也被适当选择，并且本发明的用于预防HIV感染性疾病的药物可以在输血或使用血液衍生物之前直接添加到输血用血或血液衍生物中。在这样的情况下，理想的是将本发明的药物在输血或使用血液衍生物前24小时，优选12小时，或更优选6小时立即与血液或血液衍生物混合。

除了输血用血或血液衍生物以外，当本发明的组合物与输血用血或血液衍生物和/或其它活性剂一起施用时，所述药物优选在输血或使用血液衍生物的同一时间至1小时前之间施用。更优选地，例如，每天施用所述药物1次至3次，并且持续施用4周。

组合治疗：

本发明的化合物可以单独使用或与一种或多种额外的活性剂组合使用。所述一种或多种额外的活性剂可以是能够对有需要的受试者施加治疗效果的任何化合物、分子或物质。所述一种或多种额外的活性剂可以被“共施用”，即，作为不同的药物组合物或混合在单一药物组合物中以配合的方式一起施用给受试者。通过“共施用”，一种或多种额外的活性剂也可以与本发明化合物同时施用，或与本发明化合物分开施用，包括在不同时间和以不同的频率。所述一种或多种额外的活性剂可以通过任何已知的途径来施用，诸如口服、静脉内、肌内、经鼻、皮下、阴道内、直肠内等；且治疗剂也可以通过任何常规途径施用。在许多实施方案中，一种或多种额外的活性剂中的至少一种和任选两种可以口服施用。

这些一种或多种额外的活性剂包括但不限于：一种或多种抗纤维化剂、抗逆转录病毒剂、免疫系统抑制剂以及CCR2和/或CCR5抑制剂或治疗。当两种或更多种药物组合使用时，每种药物的剂量通常与该药物在独立使用时的剂量相同，但是当一种药物干扰另一种药物的代谢时，每种药物的剂量被适当地调节。每种药物可以同时或在例如小于12小时、24小时、36小时的时间间隔内分开施用。如本文所述的剂型如胶囊可以以适当的间隔施用。例如，每天一次、每天两次、每天三次等等。具体地讲，所述剂型是例如每天施用一次或两次。甚至更具体地讲，所述剂型是每天施用一次。在一个实施方案中，一种或多种抗逆转录病毒剂包括但不限于：进入抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、成熟抑制剂及其组合。在一个实施方案中，一种或多种额外的抗逆转录病毒剂包括但不限于：拉米夫定、依法韦仑、雷特格韦、威维康、贝韦立马、α-干扰素、齐多夫定、阿巴卡韦、洛匹那韦、利托那韦、替诺福韦、替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦前药、恩曲他滨、埃替格韦、可比司他、地瑞那韦、阿扎那韦、利匹韦林、度鲁特韦及其组合。

在一个实施方案中，一种或多种免疫系统抑制剂包括但不限于：环孢霉素、他克莫司、泼尼松龙、氢化可的松、西罗莫司、依维莫司、硫唑嘌呤、霉酚酸、甲氨蝶呤、巴利昔单抗、达利珠单抗、利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白及其组合。

下面的实施例进一步详细说明本发明，但不应被解释为限制其范围。

实施例

实施例1–赛尼克韦罗甲磺酸盐组合物

在Key 1L筒式制粒机中通过湿式制粒，然后盘式干燥、筛分、混合并在Carver压机上压成片剂制备一系列除酸增溶剂不同以外相同的赛尼克韦罗甲磺酸盐组合物。表2中示出制剂的组合物。

表2

将片剂施用给小猎犬。还施用口服溶液作为对照。测定制剂和口服溶液的绝对生物利用度，并在图2中示出。结果显示，赛尼克韦罗甲磺酸盐与富马酸的生物利用度显著高于测试的任何其它增溶剂。

实施例2：赛尼克韦罗甲磺酸盐组合物

赛尼克韦罗甲磺酸盐、富马酸、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁与颗粒外微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁混合、干式制粒、研磨、共混，并压成硬度大于10kP且脆碎度小于0.8重量/重量％的片剂。所得片剂具有表3中所示组合物。

表3.

a.相当于150mg赛尼克韦罗游离碱。

b.添加在粉末共混物的颗粒外部分中。

举例来说，表4中给出实施例2b(即，实施例2b)中的组分的每片剂浓度百分比和质量。

表4

组分	浓度(重量/重量％)	每片剂质量(mg)
			赛尼克韦罗甲磺酸盐	26.26	170.69^a
富马酸	24.62	160.00
			微晶纤维素	41.87	272.18
交联羧甲基纤维素钠	6.00	39.00
			硬脂酸镁	1.25	8.13
总计	100.0	650.0

^a相当于150mg赛尼克韦罗游离碱

实施例3：赛尼克韦罗甲磺酸盐组合物

赛尼克韦罗甲磺酸盐、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁与颗粒外微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、富马酸、胶体二氧化硅和硬脂酸镁混合、干式制粒、干燥、研磨、共混，并压成硬度大于10kP且脆碎度小于0.8重量/重量％的片剂。所得片剂具有表5中所示组合物。

表5

组分	浓度(重量/重量％)	每片剂质量(mg)
			赛尼克韦罗甲磺酸盐	26.26	28.45^a
富马酸	24.62	26.67
			微晶纤维素	41.87	45.36
交联羧甲基纤维素钠	6.00	39.00
			硬脂酸镁	1.25	1.35
总计	100.0	108.3

^a相当于25mg赛尼克韦罗游离碱

值得注意的是，表5的制剂具有与表3b相同的组分比例，且只是用于每个片剂的组分的总量不同。因此，表4示出具有150mg赛尼克韦罗(基于游离碱)的片剂，而表CC-1示出具有25mg赛尼克韦罗(基于游离碱)，组分比例与表4中所示的实施例2b的150mg片剂相同。

实施例4–参考

如下制备表6的基于柠檬酸的制剂。赛尼克韦罗、羟丙基纤维素、甘露糖醇和交联羧甲基纤维素钠与微晶纤维素,交联羧甲基纤维素钠、柠檬酸,胶体二氧化硅、滑石和硬脂酸镁混合、湿式制粒、干燥、研磨和共混。将所得共混物压成硬度大于10kP且脆碎度小于0.8重量/重量％的片剂。用羟丙基甲基纤维素,聚乙二醇8000、二氧化钛和黄色氧化铁涂覆片剂。由此制备的涂覆片剂基本上与那些公开在美国专利申请公开号2008/031942中的相同(参见例如表3)。

表6

组分	mg/片剂	重量/重量％
			赛尼克韦罗甲磺酸盐	28.91	4.68
甘露糖醇	341.09	56.85
			微晶纤维素	80.00	12.94
胶体二氧化硅	12.00	2.00
			无水柠檬酸	75.00	12.14
羟丙基纤维素	12.00	1.94
			交联羧甲基纤维素钠	30.00	4.85
滑石	12.00	1.94
			硬脂酸镁	9.00	1.46
羟丙基甲基纤维素	11.71	1.89
			聚乙二醇8000	2.69	0.44
二氧化钛	3.03	0.49
			黄色氧化铁	0.57	0.09

实施例5–参考

将赛尼克韦罗和羟丙甲基纤维素乙酸琥珀酸酯溶解在甲醇中并喷雾干燥成含25重量％赛尼克韦罗的细粉(基于赛尼克韦罗游离碱的重量)。所述粉末与胶体二氧化硅、微晶纤维素、甘露糖醇、月桂基硫酸钠、交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁混合。将所述掺加物压成硬度大于10kP且脆碎度小于0.8重量/重量％的片剂。表7中示出片剂的最终组合物。

表7

实施例6：CVC制剂的生物利用度

将实施例3的片剂在小猎犬中的绝对生物利用度与实施例4和5的片剂，以及赛尼克韦罗甲磺酸盐的口服溶液和含赛尼克韦罗甲磺酸盐粉末的明胶胶囊作比较。结果被示出在表8中。

表8

组分	绝对生物利用度(％)
		口服溶液	25.8
胶囊中的粉末	6.4
		实施例3	26.6
实施例4	21.1
		实施例5	12.4

这个实施例证实，具有富马酸的干式制粒片剂(实施例3)中赛尼克韦罗的生物利用度基本上类似于口服溶液，且显著高于具有富马酸(实施例1b)或柠檬酸(实施例4)的湿式制粒片剂中赛尼克韦罗的生物利用度，且超过具有与HPMC-AS呈喷雾干燥分散体的非晶态赛尼克韦罗的片剂(实施例5)。这些结果是出乎意料的，因为没有理由怀疑结晶API的干式制粒相对于湿式制粒和非晶态喷雾干燥分散体显著增加生物利用度。因为常使用非晶态喷雾干燥分散体来增加水溶性差的药物的生物利用度，所以更是如此。这些结果也是出乎意料的，因为富马酸的溶解时间比柠檬酸慢，且所使用的酸相对于CVC API的质量比例更低(柠檬酸:API 3:1对富马酸:API 1.06:1)。因此，出乎意料地，针对CVC，富马酸被证明是比柠檬酸更有效的增溶剂。

实施例7：CVC制剂的加速稳定性

通过暴露癌75％相对湿度和40℃的环境下，将实施例2b的片剂的加速稳定性与实施例1b、4和5的片剂作比较。在研究期间，将所有片剂与干燥剂一起包装。如图3中所示，实施例2b的片剂出乎意料地比其它湿式制粒片剂稳定得多，且与喷雾干燥分散体片剂稳定性类似。实施例2b与实施例4的片剂间的稳定性差异尤其出乎意料，因为只有所述两者的间的显著差异才是制备制剂的方法(干式制粒对湿式制粒)。这些结果也是出乎意料的，因为先前并不知道制粒方法能够对赛尼克韦罗生物利用度和稳定性都产生影响。

实施例8：CVC制剂的稳定性

通过将片剂暴露在75％相对湿度和40℃的环境下六周测试实施例2和3的稳定性。在研究期间，所有片剂包装有干燥剂。结果示于表9中，结果显示，片剂在这些条件下极为稳定。

表9

时间(周)	水含量(％)	强度(％)	总杂质(％)
				0	1.5	99.1	1.2
2	1.4	99.2	1.1
				4	1.4	98.0	1.0
6	1.4	98.6	1.0

实施例9：CVC制剂的稳定性

25℃下的动态蒸汽吸附等温线将实施例3和4的片剂的稳定性与赛尼克韦罗甲磺酸盐的稳定性相联系。以5％间隔从0％相对湿度至90％相对湿度进行吸附。在每个间隔下，每个样品平衡不少于10分钟且不多于30分钟。当质量增加速率不超过0.03重量/重量％每分钟时或者30分钟后(以较短者为准)，停止平衡。出现在图4中的结果显示，实施例2b的片剂比实施例4的片剂明显更稳定。这个结果与实施例3相一致，吸湿明显少于实施例4。实施例4相比于实施例2b的吸湿性增加可以与较高移动水含量相关，较高移动水含量进而可导致实施例4的部分凝胶化和后续稳定性降低。

实施例10：CVC制剂的生物利用度

在小猎犬的不同胃状态下对实施例3的片剂的生物利用度与实施例5和在明胶胶囊中的赛尼克韦罗甲磺酸盐粉末作比较。在不同预处理状态下测试生物利用度，每种预处理状态改变胃pH。具体地说，五肽胃泌素预处理提供最低pH，不处理提供中间pH，且法莫替丁(famotidine)处理提供最高pH。

出现在图5中的结果显示，实施例3的片剂在所有测试条件下具有较高生物利用度。实施例3的生物利用度在五肽胃泌素处理的狗与未处理的狗间的变化较小，而实施例4在未处理的禁食狗(中间胃pH)中与在五肽胃泌素处理的狗(最低胃pH)中相比，生物利用度明显减损。用法莫替丁(一种H2受体激动剂，抑制胃酸性且提升pH)处理降低所有样品的生物利用度，然而，实施例3的减少比实施例4少得多。

这些结果证实，具有富马酸的干式制粒赛尼克韦罗组合物的意料不到的额外益处。具体地说，当在全范围可能的人类胃pH条件下施用时，此类制剂的药代动力学的变化不及喷雾干燥分散体(实施例4)的大。这个结果是意料不到的且出乎意料的，因为其它弱碱性抗逆转录病毒药物如阿扎那韦的生物利用度受到胃pH的巨大影响。对于此类药物，胃pH的变化可将生物利用度降至次治疗水平，胃pH的变化可以由疾病或医疗条件(achlorohydric患者)或者共同施用药物(诸如抗酸剂质子泵抑制剂或H2受体激动剂)所导致。这些结果显示，实施例3的干式制粒的基于富马酸的赛尼克韦罗甲磺酸盐制剂在胃pH变化时较不倾向于生物利用度变化，表面实施例3是较为稳健的制剂，可用于具有或有可能具有变化的胃pH水平的患者中。

实施例11a-11c：制备赛尼克韦罗甲磺酸盐和拉米夫定制剂

如下制备表10的赛尼克韦罗甲磺酸盐和拉米夫定的制剂。首先，混合颗粒内组分，并干式制粒形成作为干式制粒掺加物的组合物。然后这个干式制粒掺加物进一步与颗粒外组分混合形成混合物。将所述混合物压成片剂。在小猎犬中测量150mg CVC强度片剂(实施例11b和11c)中赛尼克韦罗(CVC)和拉米夫定(3TC)的绝对生物利用度。结果示于图6中。

表10

实施例12：双重CCR2和CCR5拮抗剂赛尼克韦罗在NASH小鼠模型中的抗纤维变性和抗炎活性

背景：非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的特征在于脂肪积聚、慢性炎症(包括促炎性单核细胞和巨噬细胞)，且在存在纤维变性时，可导致硬化症或肝细胞癌。当前没有批准用于NASH的疗法。证据表明，2型C-C趋化因子受体(CCR)和它的主要配体单核细胞趋化蛋白-1有助于肝脏中的促炎性单核细胞募集。赛尼克韦罗(CVC)是一种口服强效双重CCR2/CCR5拮抗剂，在48周2b期研究中，在143名HIV-1感染成人(NCT01338883)中示出有利的安全性和耐受性。在饮食引起的NASH(导致肝细胞癌)的小鼠模型中评估CVC；提供来自模型的第一纤维变性阶段的数据。

方法：通过在出生2天后单次注射200μg链脲霉素，随后从4周大开始高脂肪饮食，在雄性小鼠中诱导NASH(导致血糖控制受损)。从6至9周大开始，3组动物(n＝6/组)通过管饲法每天两次施用0(媒介物)、20(低剂量)或100(高剂量)mg/kg/天的CVC剂量。在9周大时处死动物，并对肝脏进行生化、基因表达和组织学评估。

结果：CVC处理对体重或肝脏重量、全血葡萄糖或肝脏甘油三酯没有影响。相比于对照，两个CVC处理组中的平均(±SD)丙氨酸转氨酶水平都显著下降(58±12、51±13和133±80U/L分别对应低剂量、高剂量和媒介物；p<0.05)，且处理组中的肝脏羟脯氨酸倾向于下降。借助实时RT-PCR，全肝脏溶解物中1型胶原mRNA用CVC处理时下降27–37％。纤维变性面积(通过天狼星红染色)的百分比用CVC处理时相对于对照显著下降(p<0.01)：当包括血管周围间隙时，0.66％±0.16、0.64％±0.19和1.10％±0.31分别对应20mg/kg/天、100mg/kg/天和对照；当扣除血管周围间隙时，分别为0.29％±0.14、0.20％±0.06和0.61％±0.23。重要的是，组织学非酒精性脂肪肝病活性评分(在这个模型中，未处理小鼠的评分为0)在用CVC处理时显著下降(4.0±0.6、3.7±0.8和5.3±0.5分别对应低剂量、高剂量和媒介物；p<0.05)，这主要是因为炎症和气球样变性评分减少。如先前在人类中所示，在小鼠中观察到血浆单核细胞趋化蛋白-1水平的CVC剂量相关补偿性增加(低剂量和高剂量分别对应1.1-和1.5倍增加)，这与CCR2的拮抗作用相一致。

结论：这些数据表明，CVC(一种当前针对HIV-1进行人类试验的研究药物)在NASH小鼠模型中具有抗纤维变性和抗炎活性，批准临床研究。这些发现提供气体证据，破坏CCR2/单核趋化蛋白-1轴可能是一种NASH的新型治疗方法。

实施例13：赛尼克韦罗(一种双重CCR2/CCR5拮抗剂)在硫代乙酰胺-诱导的肝纤维变性和硬化症大鼠模型中的显著抗纤维变性活性

背景：2和5型C-C趋化因子受体(CCR)在促炎性单核细胞和巨噬细胞、库普弗细胞和肝星状细胞(HSC)中表达，它们促进肝中的炎症和纤维发生。赛尼克韦罗(CVC；新型强效口服双重CCR2/CCR5拮抗剂)在48周2b期研究中，在143名HIV-1感染成人(NCT01338883)中示出有利的安全性和耐受性。这项研究评估CVC在出现由于硫代乙酰胺(TAA)-诱导的损伤所引起的肝纤维变性的大鼠中的体内抗纤维变性效果和治疗干预相对于疾病发作的时间。

方法：在Sprague-Dawley大鼠中通过腹膜内施用TAA150mg/kg，3次/周达8周诱导纤维变性。大鼠(n＝4–8/组)在最初8周接受TAA的同时(组1；早期干预)、在完成TAA施用后的4–8周期间(组2；出现纤维变性)或8–12周期间(组3；硬化症逆转)接受CVC 30mg/kg/天(a)、CVC 100mg/kg/天(b)或媒介物对照(c)。对肝脏进行生化、基因表达和组织学评估。

结果：当同时以TAA开始时(组1)，30mg(组1a)和100mg(组1b)的CVC显著减少纤维变性(分别减少49％和38％；p<0.001)，这是通过胶原形态测定估算。当同时以TAA开始时(组1)，30mg(组1a)和100mg(组1b)的CVC显著减少纤维变性(分别减少49％和38％；p<0.001)，这是通过胶原形态测定估算。组1a和1b的1型胶原的蛋白质水平分别减少30％和12％，而α-SMA分别减少17％和22％。在TAA-诱导损伤后开始治疗时(组2)，CVC 30mg(组2a，胶原减少36％；p<0.001)观察到统计上显著的抗纤维变性效果，而CVC 100mg(组2b)未观察到。当在第8周(存在硬化症)开始治疗并继续4周(组3)时，CVC对纤维发生基因表达或纤维变性没有显著效果。

结论：CVC是一种由于TAA引起的非硬化症肝纤维变性的强效抗纤维变性药物。所述药物在早期干预(组1)和出现纤维变性(组2a)时是有效的，但在已经形成硬化症时(组3)无效。

实施例14：赛尼克韦罗在低纳摩尔浓度下实现高CCR5受体占用

背景：赛尼克韦罗(CVC)是一种每天一次的新型高效CCR5和CCR2拮抗剂，它已经在治疗初治成人(NCT01338883)中完成治疗HIV-1感染的2b期评估。这项研究的目的是评估用CVC、BMS-22(TOCRIS，一种CCR2拮抗剂)和获批的CCR5拮抗剂马拉维诺(MVC)治疗后的体外受体占用和生物学。

方法：来自5名HIV+和5名HIV-受试者的PBMC与CVC、BMS-22或MVC培养，随后治疗或用RANTES(CCR5配体)或MCP-1(CCR2配体)治疗。评估每种药物抑制CCR5或CCR2内在化的能力。通过流式细胞术评估CCR5和CCR2的细胞表面表达，并将荧光值转化为可溶性荧光当量分子(MESF)。

结果：CVC和MVC在RANTES不存在时增加CCR5的细胞表面表达。这种效果在HIV-阴性受试者(CD4+和CD8+T细胞)中的程度要大得多。CVC在比MVC更低的有效浓度下预防RANTES-诱导的CCR5内在化。对于CVC，CCR5达到饱和时的有效浓度：CD4+为3.1nM，且CD8+T细胞为2.3nM(受体占用分别为～91％和～90％)。对于CD4+和CD8+T细胞，MVC在12.5nM下达到饱和，分别代表～86％和～87％受体占用。CVC和MVC实现CCR5的高但不完全饱和，这种效果可以通过两种药物在RANTES不存在时增加CCR5表达的观测结果放大。在MCP-1不存在时，CVC诱导CCR2内在化并减少单核细胞上的细胞表面表达。BMS-22略微增加CCR2细胞表面表达。CVC在比BMS-22更低的浓度下防止MCP-1-诱导的CCR2内在化。单核细胞CCR2在6nM的CVC下达到饱和，代表～98％CCR2占用。为达到>80％受体占用，与1.8nM CVC相比，平均需要18nM BMS-22。

结论：CVC在体外比MVC更容易防止RANTES-诱导CCR5内化(在更低浓度下)，表明CVC可在体内比MVC更有效防止通过RANTES进行细胞活化。经治疗的受试者的基线CCR5表达水平可为CCR5拮抗剂体内活性的决定子。CVC在体外在低纳摩尔浓度下在单核细胞上实现CCR2的～98％受体占用，并在MCP-1不存在下减少单核细胞上的CCR2表达。通过CVC的CCR2的高饱和伴随着表达减少可以解释临床上观测到的CVC的强效CCR2阻断。CVC具有强效体外免疫调节活性，且在慢性HIV感染中可以是重要组合免疫治疗和抗逆转录的。

实施例15：CVC阻断HIV进入，但不会像MVC一样导致进入细胞外空间的HIV重新分布CVC阻断HIV进入，但不会像MVC一样导致进入细胞外空间的HIV重新分布

背景：在体内，CVC已在具有CCR5嗜性病毒7的经过治疗的个体的单一疗法期间示出功效。在IIb期临床研究(652-2-202；NCT01338883)中，CVC在24周时(初步分析)展示与非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)依法韦仑(EFV)类似的功效，和比非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)依法韦仑(EFV)优异的毒性概况，当两者联合恩曲他滨(FTC)和替诺福韦(TDF)施用时分别具有有利的安全性和耐受性。我们假设CVC在研究202(实施例22)中的抗逆转录功效可能由于用MVC观察到的反跳现象而被低估。因此，我们开展了研究202(实施例22)的离体子分析，方式是测量来自30名在研究的第24周达成病毒学成功的受试者的储存PBMC的细胞内HIV DNA下降。我们还进行体外分析，来测定和比较CVC或MVC可能导致的任何无细胞病毒粒子重新分布的程度。

我们现在证明，CVC不会引起病毒粒子反跳。实际上，用CVC或EFV治疗的个体中看到细胞内DNA的可比较降低，表明血浆病毒载量是CVC治疗成功的准确量度。结构建模潜在地解释用MVC和CVC所得结果间的差异。

方法：细胞。在37℃、5％CO2下将表达CD4、CCR5和CXCR4的PM-1细胞保持在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(R10培养基)中。在37℃、5％CO2下将用于转染的293T细胞保持在DMEM中，10％FBS、L-谷氨酰胺和抗生素(D10培养基)。病毒原液。通过用质粒pWT/BaL转染293T细胞产生HIV-1BaL病毒。使用脂质体2000作为转染剂。在转染48小时后收集培养上清液，滤过0.45μm孔过滤器，并在37C下用50单位苯佐那酯/ml病毒原液处理20分钟，以移除受污染的质粒DNA。将病毒原液冷冻在-80C下，以阻止苯佐那酯活性。经过苯佐那酯处理的病毒原液在脐血单个核细胞(CBMC)中繁殖。在R10培养基中用植物凝集素(PHA-M)刺激CBMC72h，然后用HIV-1BaL感染。随后将病毒扩增培养物生长在补充有白介素2(IL-2)的R10中，并在37C、5％CO2下培养。

感染：我们在抑制浓度的CVC(20nM)和MVC(50nM)存在下将PM-1细胞暴露至HIV-1BaL。在37℃下将两种药物与PM-1细胞培养在一起，然后添加病毒。在1ml R10培养基中每5X 105个细胞培养500ng HIV-1BaL的p24抗原。使用只有病毒的对照(在本文中称为“无细胞”)测定病毒死亡。在无药物对照中测定病毒吸附，由此在无药物治疗存在下每5X 105个在37C下预培养的PM-1细胞添加500ng HIV-1Bal的p24Ag。一式两份地进行每种药物治疗和对照。根据制造商说明书利用QIAamp病毒RNA微型试剂盒从140μl上清液流体提取病毒RNA。将样品储存在-80C下，直到进行分析。利用定量实时逆转录PCR(qRT-PCR)和引物US1SSF(5'-AACTAGGGAACCCACTGCTTAA-3')、US1SSR(5'-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTCA-3')和US1SS探针(5’-(FAM)CCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAA)和Invitrogen qRT-PCRSupermix试剂盒测量上清液病毒载量。循环参数是：50℃持续15分钟，95℃持续10分钟，随后50个循环的95℃持续15秒，和60℃持续1分钟。所有值都是在2个独立实验中重复测试的结果。通过使用pBaL/wt的10倍连续稀释液确定RNA拷贝数，以生成每个分析的标准曲线，并针对来自先前研究的具有已知拷贝数的样品进行校准。

患者样品：从30名在研究202IIb期临床试验中第24周达成病毒学成功的患者(10、13和7分别对应CVC 100mg、CVC 200mg和EFV)获得外周血单个核细胞(PBMC)样品，比较CVC(100mg或200mg)或EFV与恩曲他滨/富马酸替诺福韦二吡呋酯(FTC/TDF)组合在具有CCR5嗜性病毒的感染HIV-1的治疗初治患者中的功效、安全性和耐受性。从具有<100,000但>1,000病毒RNA拷贝/ml的基线病毒载量的参与者获取基线和24周的样品，≥200个细胞/μl的CD4计数随机指定接受CVC或EFV。

细胞内DNA qPCR。提取总DNA，定量并储存在-80C下。用上述US1SS引物/探针组定量细胞内强终止DNA水平。用US1FL引物/探针组(正向：5’-AACTAGGGAACCCACTGCTTAA；反向：5’-CGAGTCCTGCGTCGAGAGA；探针：5’-[FAM]-CCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAA)定量细胞内全长DNA水平。两种DNA水平与GAPDH引物/探针组(正向：5’-ACCGGGAAGGAAATGAATGG；反向：5’-GCAGGAGCGCAGGGTTAGT；探针：5’-(VIC)-ACCGGCAGGCTTTCCTAACGGCT)复合以归一化DNA输入，并验证样品完整性。

统计分析：利用Mann-Whitney测试分析所有三个治疗组的体外细胞内HIV DNA水平。利用Prism 5软件分析所有数据。

赛尼克韦罗在CCR5中的分子对接

通过结构生物信息学研究联合实验室(RCSB)蛋白质数据库获得CCR5趋化因子受体的晶体结构(蛋白质数据库识别号[PDB ID]4MBS)并用作对接目标。从PubChem获得CCR5-受体接抗体赛尼克韦罗(以前的TAK-652/TBR-652)并用作配体。通过使用UCSF Chimera促进使配体对接结构最小化，UCSF Chimera准备CCR5和CVC作为DOCK计算的输入，这预测配体在CCR5七跨膜(7TM)α-螺旋受体腔中的取向。进行对接计算，并使用最大尺寸的栅格箱来将所有可能的对接位点囊括在CCR5中。结合位点由所有来自7TM腔的小于的残基组成(在残基Glu283和Tyr10周围)。处理对接结果以识别分子间相互作用。保持测试的九个姿态以备进一步分析。为了验证对接系统的准确性，利用相同方法将MVC对接至CCR5，并测定其相对于晶体结构的取向。利用PyMOL计算的观测到的晶体结构与从AutoDock Vina获得的预测构型之间的均方根偏差(RMSD)是表明方案是合理的。

结果

首先，我们定量HIV细胞内DNA，以验证在研究202临床试验期间获得的病毒载量的措施。从这个临床试验中参与者分离的PBMC中的全长细胞内HIV DNA水平(指示早期逆转录)的离体分析在24周时所有组(CVC 100mg、CVC 200mg、EFV 600mg)都类似(图7A)。从基线的平均倍数变化：CVC组100mg(n＝10)和CVC 200mg(n＝11)分别为0.643和0.787。EFV600mg组(n＝7)在24周时，从基线的平均倍数变化为0.825。差异不具有统计显著性。

接下来，强终止细胞内HIV DNA水平(指示晚期逆转录)在24周时与全长水平同时测量(图7B)。从基线的平均倍数变化：CVC 100mg组为0.49，CVC 200mg组为0.63，且EFV600mg组为1.01。平均值并不具有统计显著性。

还在CVC和MVC暴露后进行测量细胞外病毒水平的体外实验。在感染进入抑制剂暴露细胞4小时后，通过qRT-PCR和P24ELISA定量培养物流体中病毒的水平。4小时后，来自MVC治疗细胞的培养物流体与基线相比(基线：1.19X10¹⁰拷贝/ml，4小时：1.67X10¹⁰拷贝/ml)(图8A)呈现出比CVC治疗细胞更高的RNA水平。(基线：506ng/ml，4小时：520ng/ml)(图8B)。来自CVC治疗细胞的培养物流体中的病毒RNA在4小时后没有显著变化(基线：1.19X10¹⁰拷贝/ml，4小时：1.26X10¹⁰拷贝/ml)(图8A)。在用CVC治疗4小时后，P24水平从基线下降(基线：506ng/ml，4小时：192ng/ml)(图8B)。无细胞和无药物对照的病毒RNA下降在4小时后类似，分别为1.14X10¹⁰拷贝/ml和1.1X10¹⁰拷贝/ml(图8A)。506ng/ml的基线p24水平后，无细胞对照的p24抗原水平在4小时后为138ng/ml。p24无药物对照水平为244ng/ml(图8B)。

细胞外病毒水平在CVC和MVC后的这些变化提示我们检查在用HIV-1BaL感染前1h暴露至CVC或MVC的PM-1细胞中的细胞内强终止HIV DNA水平。4h后，从细胞沉淀物提取总DNA。CVC或MVC治疗细胞的细胞内强终止HIV DNA水平与无药物对照作比较(图9)。我们在MVC治疗细胞中观察到与无药物对照相比的0.02的相对DNA水平，而CVC治疗细胞只呈现出0.1的相对细胞内DNA水平。MVC与CVC治疗细胞的相对DNA水平间的差异显著。

CCR5 7TM的晶体结构与MVC(PDB ID 4MBS)复合，且用它生成CVC对接至结合口袋中的CCR5的模型。我们预测了也是通过将MRV重新对接至CCR5中评估的对接姿态；具有最有利能量的顶部姿态具有适当取向，并与晶体结构中的构型重叠计算机CCR5对接模拟指示，CVC只结合CCR5结构的疏水口袋，也称为配体结合口袋(图10)。只有顶部的9个姿态继续进行进一步分析。有三种CVC后对接至CCR5中的不同构型，且它们聚集成三个位点(图10A、B)。第一位点(位点1)深入疏水口袋并填充大体积(图10A)。第二位点(位点2)部分定位在口袋中部，还从TM1与TM7间的CCR5向外凸出(图10A)。在第三位点(位点3)，极少CVC姿态定位在受体腔的入口附近。

细胞外环内的残基和CCR5中的跨膜结构域的定点突变已经识别了参与gp120结合的关键残基；不同位置的突变完全破坏、损害或影响gp120结合至CCR5。被识别为对gp120结合在CCR5内重要的十三个关键残基是Tyr37、Trp86、Trp94、Leu104、Tyr108、Phe109、Phe112、Thr177、Ile198、Trp248、Tyr251、Leu255和Glu283。图11示出CVC(左边)和MVC(右边)在结合口袋中为对接姿态的CCR5的分子表面表示。CVC和MVC分别具有～1285和(利用PyMOL计算)的分子表面积。MVC占据结合口袋的中部。所有十三个确定对gp120结合重要的残基是在距离MVC内，由PyMOL测量(这个研究中针对静电和/或疏水相互作用使用截止距离)。相比之下，对接CVC姿态占据相同口袋，但不是在如MVC所见的中部(图11)。确切地说，CVC向口袋的一侧偏移(图12A/B)，且测得CCR5中的共有残基在CVC的内。即使CVC占据比MVC更大的表面积，对gp120结合重要的十三个残基中只有七个在CVC的内，即Tyr37、Trp86、Tyr108、Phe109、Ile198、Leu255和Glu283。总之，这些模拟表明，CVC在CCCR5的结合口袋中占据与MVC类似的区域。

讨论：在这项研究中，我们观察到CVC和MVC(两种防止HIV进入的CCR5拮抗剂)对细胞外病毒水平具有不同影响。

在比较CVC和EFV的IIb期双盲双模拟研究中，两者都在治疗初治受试者中具有FTC/TDF，与73％接受CVC 200mg的患者和71％接受EFV的患者相比，76％接受CVC 100mg的患者在24周达成病毒学成功(HIV RNA<50拷贝/ml)。我们先前证实，MVC可人为地增加病毒载量，因为无细胞病毒粒子可在未能在MVC存在下进入后从目标细胞排出。当前的研究的设计目的是回答CVC是否可能出现相同效果，和在比较进入和逆转录酶抑制剂时，细胞内DNA测量值是否可能较准确地代表抗病毒功效。

事实上，研究202治疗组全过程的细胞内DNA水平与选定样品在24周时类似(图7)，反映了意向治疗(ITT)分析期间观察到的趋势。所有组在24周时的全长HIV-DNA水平也类似，表明CVC和EFV都具有类似抗病毒功效。CVC和EFV组间观察到强终止HIV DNA水平存在差异，而两个CVC组的病毒载量与EFV相比呈现出更陡峭的下降。因为强终止HIV DNA水平受到进入抑制剂的直接影响，可以预测到这个结果。EFV和CVC间关于病毒学成功和细胞内HIVDNA水平的相似性表明这种双重CCR5和CCR2抑制剂的抗病毒效力未被病毒载量测量值掩盖。

我们提出了CVC是否可以导致如MVC在体外所看到的病毒排斥。两种独立的病毒定量测量qRT-PCR和p24ELISA证实MVC治疗在感染后维持细胞外病毒水平长达4小时。相比之下，用CVC治疗导致导致病毒水平在4小时处下降，与无药物或无细胞对照相当(图8)。D尽管抗病毒机制表面上类似，似乎CVC与MVC关于无细胞病毒与CCR5间的相互作用间存在差异。

细胞内强终止DNA体外的进一步检查显示，CVC与MVC相比导致水平轻微但显著增加(图9)。这可能是由于两种抑制剂对CCR5的效果不同，这进而影响病毒与受体间的解离速率。这提高了gp120与MVC相比更持久地缔合CVC-结合CCR5的可能性。

我们还旨在通过检查CCR5的结合位点理解CVC如何抑制HIV进入目标细胞。工程化人类CCR5构建体先前已经与MVC在的分辨率下复合结晶。虽然这不是CCR5的全长晶体结构，但它被用来更好地理解CVC与CCR5在计算机对接分析中的相互作用。所有声称为CVC的对接模型暗示药物深深渗入CCR5的7TM腔，MVC也可以看到。然而，CVC对接姿态并没有靠近细胞外环2，ECL2在对接后仍然可接触。其它组已经报道，CCR5N-末端和ECL2结构域都在HIV-1与CCR5的相互作用中起关键作用。此外，据报道，gp120的V3的杆状区域结合至CCR5N-末端，而V3冠状物与ECL2和结合口袋内的残基相互作用。基于我们的模型，我们假定CVC不会直接干扰gp120 V3环与ECL2的相互作用，因为ECL2似乎暴露在这个模型中。

可以想到，如果CCR5仍处于失活状态，CVC可阻断CCR5激活。已显示，7TM中的两个残基Tyr37和Trp248在结合趋化因子配体时对CCR5激活很重要，且还显示对MVC结合很重要。类似于MVC，CVC的不同对接姿态内埋在疏水结合位点中。我们的模型显示，接触Trp248被CVC阻断；已显示，Trp248对CCR5激活很重要，这解释了趋化因子受体的失活。第二假说是MVC结合至CCR5可导致CCR5经历全方位构型变化，这在CVC存在下时的改变较少。

基于本研究提供的其它组的定点突变实验和组织培养实验和对接模拟，我们假设MVC占据疏水口袋的中部，潜在地导致CCR5中对gp120结合重要的一些残基不可接触。这些残基也可能对gp120通过直接静电或疏水相互作用和水介导的氢键结合很重要。相比之下，CVC占据结合位点，且有可能gp120在CVC存在下仍可接触对CCR5结合重要的一些残基。这种假说受到定点突变研究的支持，表明gp120部分填充受体腔，同时占据整个ECL2。然而，gp120的V3环渗入CCR5 7TM的程度仍不清楚。还报道了，gp120从CCR5的解离速率在MVC存在下加速，因为后者阻碍ECL2与V3环间的紧密缔合。基于这些研究，CVC对ECL2/V3相互作用具有不同于MVC的效果。CCR5与CVC复合的解离和表面等离振子共振研究和结晶将提供关于这个话题的宝贵信息。

需要定点突变和生化研究来说明对CCR5与CVC相互作用重要的残基。测定CCR5的N末端的近侧位置也受到关注。

在这项研究中，我们已经证实，病毒载量定量准确测量CVC的抗病毒功效，且通过CVC抑制病毒进入不会导致细胞表面的病毒粒子反跳至细胞外环境。我们的计算机结构建模为CVC与MVC间的功能差异提供可能的解释。需要进一步研究来理解CVC如何影响gp120结合至CCR5。

实施例16：双重CCR5/CCR2拮抗剂赛尼克韦罗在肾纤维变性小鼠模型中之抗纤维变性活性

背景：赛尼克韦罗(CVC)是一种已经完成2b期HIV研发的每天一次的新型口服双重CCR5/CCR2拮抗剂(研究202；NCT01338883)。CVC在555名已经用至少一个剂量治疗的受试者中具有安全特性，包括115名在48周持续时间用CVC治疗的HIV-1感染成人。最近，CVC在饮食引起的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的小鼠模型和硫代乙酰胺-诱导的纤维变性的大鼠模型中展示显著抗纤维变性活性。这里，我们在由单侧输尿管闭塞(UUO)诱导的肾纤维变性的已经确立的小鼠模型中评估了CVC。

方法：在外科手术前一天(第1天)将测试动物分配成重量匹配的治疗组。雄性CD-1小鼠(N＝51；年龄，7–8周)通过无菌剖腹手术经历假手术或右侧输尿管完全结扎即UUO(图12)。从第0至5天：经历假手术的小鼠通过每天两次管饲法接收媒介物对照(0.5％甲基纤维素+1％Tween-80)；永久UUO的小鼠通过每天两次管饲法接收媒介物对照、CVC 7mg/kg/天或CVC 20mg/kg/天。另一组从第-1至4天以3mg/kg/天接收抗转化生长因子TGF-β1抗体化合物1D11(阳性对照)，每天一次腹膜内注射，并从第0至5天接收媒介物对照。起初将CVC 100mg/kg/天组(N＝9)囊括在研究中，但因为濒死状态而提前终止(因为没有动物达到第5天，所以没进行分析)。多至2000mg/kg/天的CVC剂量在不涉及外科手术的小鼠毒性研究中耐受性良好。在第5天，麻醉动物，在处死前收集血液和组织。

研究终点：研究终点包括：a)体重和肾重量；b)通过苦味酸天狼星红染色的组织学定量图像分析(得到十个图像/深度/肾，并利用光学显微镜[200x]，以盲式评估，以取样60–70％的肾皮质区)评估的阻塞肾中的纤维变性，并通过复合胶原容积分数(CVF[成像总面积％])评分量化，所述评分表示为来自阻塞肾的三个解剖学上不同(间隔200–250μM)的组织切片或深度的平均阳性染色；c)冷冻肾皮质组织活检的羟脯氨酸含量，通过生化分析评估；d)促纤维变性和炎症生物标记物(包括MCP-1、胶原1a1、胶原3a1、TGF-β1、纤连蛋白-1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和结缔组织生长因子-1(CTGF-1)的mRNA表达；通过(Life Technologies^TM,Carlsbad,CA,USA)分析评估，将相对表达归一化至HPRT(黄嘌呤磷酸核糖转移酶)。

统计分析：将数据表示为平均值±平均数标准误差(SEM)。利用GraphPad(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA,USA)进行统计分析。通过不成对t检验分析假手术+媒介物对照与UUO+媒介物对照组之间，和UUO+媒介物对照与UUO+化合物-1D11(阳性对照)组之间的治疗差异。通过单因素ANOVA(方差分析)与Dunnett’s检验(post-hoc)分析UUO+媒介物对照与CVC-剂量组之间的治疗差异。

方法：CVC展示显著抗纤维变性效果，通过肾纤维变性的已经确立的UUO模型中的胶原容积分数或CVF(组织学阻塞肾切片中针对胶原为染色阳性的面积％)的减少确定。阻塞肾中观察到胶原1a1、胶原3a1、TGF-β1和纤连蛋白-1mRNA表达下降的趋势，但这些并未达到统计显著行。综上，CVC的作用模式、在动物模型(肾和肝)中的抗纤维变性活性和广泛安全性数据库支持纤维变性疾病的进一步评估。计划在非HIV感染的NASH和肝纤维变性患者中进行概念验证研究。还计划在HIV-1感染患者中进行III期试验，以评估在与共同施用指南优选的第三药剂时固定剂量组合的CVC/拉米夫定(3TC)作为新型‘基础(backbone)’相对于富马酸替诺福韦二吡呋酯/恩曲他滨(TDF/FTC)。

结果：体重和阻塞肾重量：CVC 7mg/kg/天和化合物1D11(阳性对照)对体重没影响，而CVC 20mg/kg/天导致体重在第5天时相对于UUO+媒介物对照组存在适度但不明显的下降(5％)(p<0.05)(图13；体重变化以克[g]计)。阻塞或对侧肾重量或肾重量指数相对于UUO+媒介物对照组(数据未显示)未观察到显著治疗效果(CVC或化合物1D11[阳性对照])。组织学：CVF的复合测量(针对三种深度求取面积％的平均值[±SEM])在UUO+媒介物对照组中显著高于假手术组(11.4±1.0倍；p<0.05)(图14)。CVC 7和20mg/kg/天和化合物1D11(阳性对照)相对于UUO+媒介物对照组显著削弱UUO-诱导的CVF的复合测量(针对三种深度求取的平均值[±SEM])(分别减少28.6±8.8％、31.8±6.8％和50.3±7.3％；p<0.05)。

羟脯氨酸含量：来自UUO+媒介物对照组的阻塞肾的羟脯氨酸含量(占蛋白质的％)相对于假手术组显著增加(0.72％对0.27％；p<0.05)(数据未显示)。相对于UUO+媒介物对照组，测试的任一CVC剂量都不影响UUO-诱导的阻塞肾羟脯氨酸含量增加；然而化合物1D11(阳性对照)组具有显著更低水平(0.55％对0.72％；p<0.05)(数据未显示)。

促纤维化和炎症生物标记物mRNA表达：对于每种评估的生物标记物(MCP-1、胶原1a1、胶原3a1、TGF-β1、纤连蛋白-1、α-SMA和CTGF-1)，UUO+媒介物对照组中mRNA的表达与假手术组相比显著增加(p<0.05)(图15)。CVC 7和20mg/kg/天减弱UUO-诱导的胶原1a1、胶原3a1、TGF-β1和纤连蛋白-1mRNA表达增加。然而，这些降低与UUO+媒介物对照组相比没有达到统计显著性。化合物1D11(阳性对照)相对于UUO+媒介物对照组显著减少UUO-诱导的胶原1a1、胶原3a1、TGF-β1和纤连蛋白-1的mRNA表达的增加(p<0.05)。与UUO+媒介物对照组(未显示α-SMA和CTGF-1mRNA的数据)相比，CVC 7和20mg/kg/天和化合物1D11(阳性对照)对于UUO-诱导的阻塞肾皮质MCP-1、α-SMA和CTGF-1mRNA表达没有显著影响。

结论：CVC展示显著抗纤维变性效果，通过肾纤维变性的已经确立的UUO模型中的胶原容积分数或CVF(组织学阻塞肾切片中针对胶原为染色阳性的面积％)的减少确定。阻塞肾中观察到胶原1a1、胶原3a1、TGF-β1和纤连蛋白-1mRNA表达下降的趋势，但这些并未达到统计显著行。综上，CVC的作用模式、在动物模型(肾和肝)中的抗纤维变性活性和广泛安全性数据库支持纤维变性疾病的进一步评估。计划在非HIV感染的NASH和肝纤维变性患者中进行概念验证研究。还计划在HIV-1感染患者中进行III期试验，以评估在与共同施用指南优选的第三药剂时固定剂量组合的CVC/拉米夫定(3TC)作为新型‘基础(backbone)’相对于富马酸替诺福韦二吡呋酯/恩曲他滨(TDF/FTC)。

实施例17：APRI和FIB-4纤维变性评分的提高与48周内接收赛尼克韦罗的HIV-1感染成人中sCD14的降低相关

背景和目标：赛尼克韦罗(CVC)(一种每天一次的新颖口服CCR2/CCR5拮抗剂)已经在临床试验中展示有利安全性和抗HIV活性。CVC在两种肝病动物模型中展示抗纤维变性活性。在研究202(NCT01338883)中对APRI和FIB-4开展Post-hoc分析。

方法：以4:1将具有CCR5嗜性HIV-1,BMI≤35kg/m2且无明显肝病(即，ALT/AST级别≤2，总胆红素≤ULN，无HBV、HCV、活性或慢性肝病或硬化症)的143名患者随机分配至CVC或依法韦仑(EFV)。计算APRI和FIB-4评分。在无数据缺失的患者中评估从基线(BL)到第24和28周的评分类别变化。评估APRI和FIB-4评分从BL开始的变化与MCP-1(CCR2配体)和sCD14(炎症生物标记物)水平之间的相关性。

结果：在BL时，CVC比EFV更多的患者的APRI≥0.5和FIB-4≥1.45；高于这些阈值的CVC患者的比例在第24和48周时下降(表)。在第24周时，观察到APRI评分的变化与MCP-1水平之间(p＝0.014)，以及FIB-4评分的变化与sCD14水平之间(p＝0.011)具有显著相关性，且在第48周时观察到APRI(p＝0.028)和FIB-4评分的变化(p＝0.007)与sCD14水平之间具有显著相关性。(表11)。

表11

[表格]

结论：在这个没有明显肝病的群体中，CVC治疗与APRI和FIB-4评分的提高有关，且APRI和FIB-4评分的变化与第48周的sCD14水平之间观察到相关性。动物模型中得到证实的CCR2/CCR5拮抗性、抗纤维变性效果以及广泛临床安全数据都支持CVC在肝纤维变性中的临床研究。

实施例18：赛尼克韦罗在非酒精性脂肪性肝炎STAM模型中的体内功效研究

开展这项体内功效研究以检查赛尼克韦罗在非酒精性脂肪性肝炎的STAM^TM小鼠模型中的效果。

材料和方法

实验设计和治疗

研究组

组1-媒介物：十八只NASH小鼠从6周大开始以10mL/kg的体积每天两次(9:00和19:00)口服施用媒介物。

组2-赛尼克韦罗20mg/kg(低剂量cvc)：十八只NASH小鼠从6周大开始以10mg/kg的剂量每天两次(20mg/kg/天)(9:00和19:00)口服施用补充有赛尼克韦罗的媒介物。

组3-赛尼克韦罗100mg/kg(高剂量cvc)：十八只NASH小鼠从6周大开始以50mg/kg的剂量每天两次(100mg/kg/天)(9:00和19:00)口服施用补充有赛尼克韦罗的媒介物。

表12 汇总了治疗计划表：

表12

结果

第1部分：评估CVC的抗NASH/纤维变性效果的研究

直到第9周的体重变化和一般状态(图16)

体重在治疗期间逐渐增加。媒介物组与低剂量CVC或高剂量CVC组间的平均体重在治疗期间无显著差异。本研究中没有动物的一般状态在治疗期间示出劣化。

在第9周处死之日的体重(图17A和表13)

媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的平均体重无显著差异(媒介物：18.9±3.3g，低剂量cvc：19.5±2.0g，高剂量cvc：18.7±0.9g)。

表13：第9周的体重和肝重

第9周的肝重和肝重体重比(图17B&C和表13)

媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的平均肝重无显著差异(媒介物：1270±326mg，低剂量cvc：1334±99mg，高剂量cvc：1307±119mg)。

媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的平均肝重体重比无显著差异(媒介物：6.6±0.8％，低剂量cvc：6.9±1.0％，高剂量cvc：7.0±0.8％)。

第9周的全血和生物化学

图18A-D和表1中示出全血葡萄糖数据。

媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的血液葡萄糖水平无显著差异(媒介物：590±108mg/dL，低剂量cvc：585±91mg/dL，高剂量cvc：585±91mg/dL)。4.4.2.血浆ALT(图18B，表14)。低剂量cvc和高剂量cvc组的血浆ALT水平与媒介物组相比示出显著降低(媒介物：133±80U/L，低剂量cvc：58±12U/L，高剂量cvc：52±13U/L)。

表14：第9周的血液和肝生物化学

图18C和表14中示出了血浆MCP-1数据。高剂量cvc组的血浆MCP-1水平与媒介物组相比示出显著增加。媒介物组与低剂量cvc组间的血浆MCP-1水平无显著差异(媒介物：60±4pg/mL，低剂量cvc：68±16pg/mL，高剂量cvc：91±14pg/mL)。

图18D、表14示出了血浆MIP-1β数据。媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的血浆MIP-1β水平无显著差异(媒介物：18±5pg/mL，低剂量cvc：18±2pg/mL，高剂量cvc：20±4pg/mL)。

第9周的肝生物化学

图18D和表14中示出了肝脏甘油三酯含量数据。媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的肝脏甘油三酯含量无显著差异(媒介物：40.8±20.4mg/g肝低剂量cvc：48.5±16.1mg/g肝高剂量cvc：51.7±14.1mg/g肝)。

图18E和表14中示出了肝羟脯氨酸含量数据。与媒介物组相比，肝羟脯氨酸含量在低剂量cvc和高剂量cvc组中倾向于下降(媒介物：0.75±0.18μg/mg，低剂量cvc：0.63±0.05μg/mg，高剂量cvc：0.62±0.09μg/mg)。

第9周的组织学分析

图19和20以及表15中示出了HE染色和NAFLD活性评分数据。来自媒介物组的肝切片展现出严重的小泡性和大泡性脂肪沉积、肝细胞气球样变性和炎症细胞浸润。与媒介物组相比，低剂量cvc和高剂量cvc组的炎症细胞浸润和肝细胞气球样变性示出温和提高，NAS显著减少(媒介物：5.3±0.5，低剂量cvc：4.0±0.6，高剂量cvc：3.7±0.8)。图19中示出HE染色切片的代表性显微照片。

表15：第9周的NAFLD活性评分

NAS组分的定义

图21、22、23和表16中示出了天狼星红染色数据。来自媒介物组的肝切片在肝小叶的中心周围区域中示出胶原沉积。与媒介物组相比，在低剂量cvc和高剂量cvc组中，中心周围区域中的胶原沉积大幅减少。与媒介物组相比，在低剂量cvc和高剂量cvc组中，纤维变性面积(天狼星红阳性面积)显著减小(媒介物：1.10±0.31％，低剂量cvc：0.66±0.16％，高剂量cvc：0.64±0.19％)。与媒介物组相比，在低剂量cvc和高剂量cvc组中，修正纤维变性面积也显著减小(媒介物：0.61±0.23％，低剂量cvc：0.29±0.14％，高剂量cvc：0.20±0.06％)。

表16：第9周的组织学分析

图21中示出了肝的天狼星红染色切片的代表性显微照片。

图22和23以及表16示出了F4/80免疫组织化学数据。来自媒介物组的肝切片的F4/80免疫染色证明肝小叶中累积F4/80+细胞。媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的F4/80+细胞的数量和大小以及炎症面积(F4/80阳性面积)的百分比没有显著差异(媒介物：4.99±1.10％，低剂量cvc：4.77±1.02％，高剂量cvc：4.96±0.60％)。

图22中示出了F4/80-免疫染色切片的代表性显微照片。

图24、25、26、27、28和表16中示出了F4/80+CD206+和F4/80+CD16/32+免疫组织化学数据。媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的巨噬细胞中的F4/80+CD206+细胞的百分比没有显著差异(媒介物：34.3±4.2％，低剂量cvc：34.7±6.3％，高剂量cvc：33.1±3.0％)。媒介物组与低剂量cvc组间的巨噬细胞中的F4/80+CD16/32+细胞的百分比没有显著差异。与媒介物相比，F4/80+CD16/32+细胞的百分比在高剂量cvc组中倾向于升高(媒介物：33.5±3.7％，低剂量cvc：38.7±7.6％，高剂量cvc：41.5±8.2％)。媒介物组与低剂量cvc组间的M1/M2比没有显著差异。与媒介物相比，在高剂量cvc组中，M1/M2比倾向于升高(媒介物：99.6±20.2％，低剂量cvc：112.3±17.0％，高剂量cvc：125.1±21.9％)。

图24和26中示出F4/80和CD206、F4/80和CD16/32双免疫染色切片的代表性显微照片。

图29、图30和表16中示出了油红染色数据。媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的脂肪沉积以及脂肪沉积面积(油阳性面积)的百分比没有显著差异(媒介物：9.66±5.02％，低剂量cvc：6.51±3.88％，高剂量cvc：7.23±3.59％)。

图29中示出了油红染色切片的代表性显微照片。

图31、32和表16中示出了TUNEL染色数据。与媒介物组相比，低剂量cvc组中的TUNEL阳性细胞的百分比显著升高。媒介物组与高剂量cvc组间的TUNEL阳性细胞的百分比无显著差异(媒介物：36.0±3.7％，低剂量cvc：43.3±2.9％，高剂量cvc：39.0±5.3％)。

图31中示出了肝脏中TUNEL阳性细胞的代表性显微照片。

图33和表17-18中示出了第9周的基因表达分析。

表17：第9周的基因表达分析

表18：第9周的P值

TNFα

媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的TNFαmRNA表达水平无显著差异(媒介物：1.00±0.24，低剂量cvc：1.16±0.39，高剂量cvc：1.09±0.23)。

MCP-1

媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的MCP-1mRNA无显著差异(媒介物：1.00±0.31，低剂量cvc：1.05±0.50，高剂量cvc：1.00±0.53)。

1型胶原

与媒介物组相比，低剂量cvc组中1型胶原mRNA表达水平显著下调。与媒介物组相比，高剂量cvc组中1型胶原mRNA表达水平倾向于下调。(媒介物：1.00±0.42，低剂量cvc：0.63±0.10，高剂量cvc：0.73±0.04)。

TIMP-1

媒介物组与低剂量cvc和高剂量cvc组间的TIMP-1mRNA表达水平无显著差异(媒介物：1.00±0.46，低剂量cvc：0.75±0.32，高剂量cvc：0.80±0.20)。

第2部分：评估CVC的抗HCC效果的研究

直到第18周的体重变化(图35)

体重在治疗期间逐渐增加。媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的平均体重在治疗期间无显著差异。

图36中示出了存活分析数据。在媒介物组中，十二只小鼠中有四只在第59天(ID112)、第75天(ID113、115)和第84天(ID116)死亡(将施用的第一天指定为第0天)。在低剂量cvc组中，十二只小鼠中有六只在第62天(ID209)、第64天(ID217)、第75天(ID212)、第76天(ID213)、第86天(ID215)和第86天(ID208)死亡。在高剂量cvc组中，十二只小鼠中有五只在第62天(ID317)、第65天(ID312)、第70天(ID316)、第78天(ID314)和第85天(ID309)死亡。在死亡动物中，除NASH的典型肝脏病变以外，没有异常验尸发现。媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的存活率无显著差异。按照发货人指示，在安排之前的18周大时处死剩余的动物(原本安排在20周大时处死)。

图37A和表19中示出了第18周数据的处死之日的体重。与媒介物组相比，高剂量cvc组中的体重倾向于下降。媒介物组与低剂量cvc组间的平均体重无显著差异(媒介物：23.0±2.3g，低剂量cvc：22.9±3.5g，高剂量cvc：20.8±2.7g)。

表19：第18周的体重和肝重

图37B&C和表19中示出了第18周数据的肝重和肝重体重比。媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的平均肝重无显著差异(媒介物：1782±558mg，低剂量cvc：1837±410mg，高剂量cvc：1817±446mg)。媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的平均肝重体重比无显著差异(媒介物：7.7±2.2％，低剂量cvc：8.3±2.8％，高剂量cvc：8.8±2.3％)。

第18周的肝脏宏观分析

38A-C中示出了肝脏的宏观外观。

图39和表20中示出了肝脏表面上形成的可见肿瘤结节的数量。媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的每个个别小鼠的肝脏肿瘤结节的数量没有显著差异(媒介物：2.4±4.1，低剂量cvc：1.5±1.9，高剂量cvc：3.6±2.5)。

表20：第18周的肝脏宏观分析

图40和表20中示出肝脏表面上形成的可见肿瘤结节的最大直径。媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间的肿瘤最大直径无显著差异(媒介物：4.0±4.7mm，低剂量CVC：4.8±5.4mm，高剂量CVC：5.3±5.1mm)。

第18周的组织学分析

图41中示出了HE染色数据。HE染色揭示媒介物组中的炎症细胞浸润、大泡性和小泡性脂肪沉积、肝细胞气球样变性、焦距改变和结节病变。媒介物组中八只小鼠中有六只表现出HCC病变。在低剂量cvc组中，六只小鼠中有五只检测到HCC病变，且在高剂量cvc组中，七只小鼠中有六只检测到HCC病变。媒介物组与低剂量cvc或高剂量cvc组间未发现明显差异。

图41中示出了HE染色切片的代表性显微照片。

图42中示出了GS免疫组织化学数据。在媒介物组中，八只小鼠中有六只检测到切片中有GS阳性结节，在低剂量cvc组中，六只小鼠中有五只检测到切片中有GS阳性结节，且在高剂量cvc组中，七只小鼠中有七只检测到切片中有GS阳性结节。

图42中示出了GS染色切片的代表性显微照片。

图43和44以及表21示出了CD31免疫组织化学数据。与媒介物组相比，低剂量cvc组中的CD31阳性面积倾向于减小。与媒介物组相比，高剂量cvc组中的CD31阳性面积倾向于增加(媒介物：2.71±1.36％，低剂量cvc：1.47±1.10％，高剂量cvc：3.68±1.37％)。

图43中示出CD31染色切片的代表性显微照片。

表21：第18周的组织学分析

表22：第18周的P值

总结与讨论

在第9周的分析中，用低和高剂量CVC治疗以剂量依赖性方式显著减少纤维变性面积，证实CVC在本研究中具有抗纤维变性效果。用低和高剂量CVC治疗还降低1型胶原和肝羟脯氨酸含量的mRNA表达水平，这支持了它的抗纤维变性性质。与媒介物组相比，CVC治疗组以剂量依赖性方式显著降低血浆ALT水平和NAS。NAS的改善可归因于小叶炎症和肝细胞气球样变性的减少。因为肝细胞气球样变性来自氧化应激诱导的肝细胞损伤，且与NASH的疾病进展有关[26；27]，这强烈地暗示CVC通过抑制肝细胞损伤和气球样变性改善NASH病理学。总之，CVC在本研究中具有潜在的抗NASH和保肝效果。

如人类中所示，血浆MCP-1水平在本研究中通过用CVC治疗而增加，表明CVC对CCR2具有剂量依赖性拮抗性，而血浆MIP-1β水平不因所述治疗而示出任何显著变化。为了研究CVC的作用机制，我们评估了CVC对巨噬细胞群体的作用。初步结果证实，与媒介物组相比，CVC展示高M1/M2比倾向性，这暗示CVC可能通过调节发炎肝脏中的巨噬细胞亚群的平衡来抑制纤维发生。未来将对此进行进一步研究。

在第18周的分析中，CVC治疗组中未观察到对NASH衍生的HCC的作用。总之，CVC在本研究中示出抗NASH、保肝和抗纤维变性效果。

实施例19：CVC和代谢物的受体结合性质

CVC作为CCR2拮抗剂具有独特的体外性质，50％抑制浓度(IC50)为5.9nmol/L。CVC以剂量依赖方式抑制RANTES、MIP-1α和MIP-1β结合至表达CCR5的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，IC50分别为3.1、2.3和2.3nmol/L。在人类中，在3.1nM的CD4+离体浓度和2.3nM的CD8+T-细胞离体浓度下，CVC针对CCR5达到≥90％受体占用[4]。CVC抑制MCP-1结合至CCR2b，IC50为5.9nmol/L。CVC在体外在6nM下在单核细胞上实现CCR2的～98％受体占用，并在MCP-1不存在下减少单核细胞上的CCR2表达。CVC只微弱地抑制配体结合至CCR3和CCR4。CVC不抑制配体结合至CCR1或CCR7。CVC阻断RANTES-诱导的Ca2+转移。

动物研究中检测到CVC的两种代谢物(M-I和M-II)(参见例如20)；M-II在猴和狗中是主要代谢物，M-I在所有物种中都是微量代谢物。M-I抑制RANTES结合至CCR5-表达细胞，IC50为6.5nmol/L，这大约是CVC的IC50的2倍。M-II对抑制RANTES无效果。

实施例20：鉴定代谢物

以3mg/kg大剂量口服施用[14C]-CVC来喂养动物后，未变化的CVC是大鼠和狗的血浆中检测到的主要组分，CVC对14C的AUC0-24比分别为58.9％和47.4％[44]。在猴中，这个比例只有12.9％，但是检测到相对大量的代谢物M-II，M-II对14C的AUC0-24比为34.3％。特别在狗和猴中，M-II在口服施用后的量比IV施用后明显更大。这些结果暗示，CVC可在到达系统循环之前代谢成M-II。在大鼠、狗和猴的血浆中还检测到微量代谢物(包括M-I、T-1184803和T-1169518)。据推测，代谢物M-I是通过氧化CVC的亚磺酰基部分而形成，且M-II是通过后续还原亚磺酰基部分，并裂解[(1-丙基-1H-咪唑-5-基)甲基]亚磺酰基基团的C-S键，随后S-甲基化形成。

临床试验

实施例21：HIV-1感染成人受试者的短期功效数据

方法

2a期双盲、随机、安慰剂对照、剂量递增研究评估在感染CCR5嗜性HIV-1的受试者中用CVC单药治疗10天的抗病毒活性、PK、安全性和耐受性。要求参与者经历过抗逆转录病毒治疗，初次使用CCR5拮抗剂，HIV-1RNA水平为至少5000拷贝/mL，且CD4+细胞计数为至少250个细胞/mm³。随后将10名受试者群组以4:1受试者比纳入每个定群，以接收CVC(25、50、75、100或150mg)或相匹配的安慰剂。所有受试者接收每天一次剂量的CVC或安慰剂10天，并追踪到第40天。

人口统计和其它基线特征

将总共54名受试者纳入本研究。人口统计在剂量组间大体上类似。每个剂量组中的大多数受试者是男性(66.7％至100％)，且中位数年龄介于33.5岁(安慰剂组)至45.0岁(150-mg组)的范围内。大所属受试者是白种人或非裔美国人。中位数BMI介于22.9kg/m2(100-mg组至27.4kg/m2(25-mg组)的范围内。中位数HIV-1RNA值介于4.00log10拷贝/mL(150-mg组)至4.60log10拷贝/mL(75-mg组)的范围内。中位数CD4+细胞计数在150-mg组(508.0个细胞/mmm³)中最高，且在剩余的组中介于402.0至460.0个细胞/mm³的范围内。

功效和安全性结果

CVC对HIV-1RNA水平示出强效效果，这种效果在完成治疗后持续。在初次使用CCR5-拮抗剂、经历过治疗的HIV-1感染受试者中，25-、50-、75-和150-mg剂量的与基线相比的中位数最低点变化分别为-0.7、-1.6、-1.8和-1.7log¹⁰拷贝/mL。这些结果证实CVC具有强效拮抗CCR5活性。图45中示出HIV-1RNA水平的平均变化。

开展MCP-1(CCR2的配体，它是一种在促炎性单核细胞上表达的趋化因子共受体，也称作CCL2)、hs-CRP和IL-6的变化的探索性评估，且观察到MCP-1的显著剂量依赖性增加(表23)。

在第10天，与安慰剂组中的略微下降相比，在25-、50-、75-和150-mg剂量组中，最小二乘均数MCP-1水平比基线分别高56.3、94.2、34.4和334.3pg/mL。在50-和150-mg剂量下，这些结果具有统计显著性(分别地，p＝0.024和p<0.001)。这些结果证实CVC具有强效拮抗CCR2活性。CVC在这个10天研究中对hs-CRP或IL-6水平总体上无效果。

表23

缩写：LS，最小二乘

a P值是单侧的，且基于每个剂量的CVC与安慰剂的比较，无需多重比较调整。

不良事件

赛尼克韦罗在所研究的剂量下大体上耐受良好，且没有识别出安全问题。没有死亡、SAE、或其它重大AE，且未因为AE而中断。大多数治疗突发AE的严重性是轻度或中度。与其它剂量组中的受试者相比，接收150mg CVC(即，研究的最高剂量)具有更多AE，但所有剂量组的AE严重性是相当的。在这个研究中，最常见(≥10％)治疗紧急AE为恶心(18.5％)、腹泻(16.7％)、头疼(14.8％)和疲劳(11.0％)。

实验安全性

在观测期间，在25mg(2名受试者)、50mg(2名受试者)、100mg(1名受试者)和150mg(1名受试者)剂量组中有6名受试者ALT和/或AST升高，且安慰组中有一名受试者AST升高。所有升高都是1级，孤立的，在2名具有超过一个升高的受试者(都是在50-mg剂量组)除外，且都在没有后遗症的情况下消解。具有超过一个升高的2名受试者在50mg剂量组，且这些受试者中的一名在基线时具有1级升高AST。在治疗期间，在100mg和150mg剂量组中的受试者中观察到AST升高(在每个剂量组的1名受试者中观察到)，其在继续治疗期间恢复到正常值。研究期间没有出现ALT或AST的2-4级升高。

仅有的3级别或更高级实验异常是25mg剂量组中的在给药前存在的3级低磷血症，50mg剂量组中在基线时具有3级甘油三酯的受试者中的4级升高甘油三酯，和在先前具有胰腺炎病史的受试者中的3级淀粉酶和4级脂肪酶。

心血管安全性和身体检查

在150-mg剂量组中在基线时具有收缩压2级升高的受试者中观察到3级收缩性高血压。没有临床相关身体检查或ECG发现。

如先前所述，CVC具有作为CCR5和CCR2拮抗剂的双重活性。开展MCP-1(CCR2的配体，也称作CCL2)、hs-CRP和IL-6的变化的探索性评估，且观察到MCP-1的显著剂量依赖性增加(参见表24)。在第10天，与安慰剂组中的略微下降相比，在25、50、75和150mg剂量组中，最小二乘均数MCP-1水平比基线分别高56.3、94.2、34.4和334.3pg/mL。在50和150mg剂量下，这些结果具有统计显著性(分别地，p＝0.024和p<0.001)。这些结果证实CVC具有强效拮抗CCR2活性。CVC在这个10天研究中对hs-CRP或IL-6水平总体上无效果。

表24：依据定群汇总的MCP-1水平–研究201

耐性数据

在研究201中，在基线、第7天和第40天(或在“提前终止”访视时，如果适用)开展药物耐性测试。所有具有可评估样品的受试者仍然完全对CVC敏感。

病毒嗜性

测试研究201中的所有受试者的病毒嗜性，以排除他们的病毒是CXCR4嗜性或双重/混合的。所有受试者在筛选时具有CCR5嗜性病毒(基于增强敏感性概况分析)。总共39名在接受CVC的受试者在治疗后具有可评估样品，且发现这些受试者中有一名(在CVC 150mg剂量组)在第10天具有双重/混合嗜性病毒。进一步测试(在另一个使用不同分析的实验室)揭示，这个受试者在基线时主要具有CXCR4嗜性病毒，因此，根据入选标准，这个受试者不应纳入研究中。这名受试者对CVC治疗无响应；这名受试者的HIV-1RNA的最大下降为0.13log₁₀拷贝/mL，低于基线值。

药代动力学/药效动力学关系

对于研究201中测试的所有剂量，对于“制剂F1”，在暴露时不止观察到剂量比例增加，将所述制剂用于所有定群，100mg剂量定群除外。

利用以下最大效果(E_max)模型表征药物反应：

其中E为效果，E0为基线效果(固定为0)，I_max为最大抑制，C表示PK变量(AUC_0-24、C_max或稳态浓度[C_ss])，IC₅₀为对应50％最大抑制的PK变量的值，且γ为描述S形度的形状参数。

CVC在PK/PD模型中的Emax为-1.43log₁₀拷贝/mL。基于Emax模型，25、50、75和150mg剂量的CVC的平均C_ss预期造成药物的54.9％、79.8％、85.9％和95.9％最大抑制效应。因此，75和150mg QD的剂量水平展示强效抗病毒活性，PD效果在HIV-1感染受试者中大于CVC的E_max的80％。

实施例22：HIV-1感染成人受试者的长期功效数据

研究202的功效结果

研究设计和目标

这是一项随机、双盲、双模拟、48周比较研究，评估了CVC 100mg和CVC 200mg与获批抗逆转录病毒药剂依法韦仑(EFV，)的功效和安全性，它们全部与获批的抗逆转录病毒药剂恩曲他滨/富马酸替诺福韦二吡呋酯(FTC/TDF)在只有CCR5嗜性病毒的HIV-1感染的抗逆转录病毒治疗初治成人受试者中结合施用。将具有HIV-2、乙型和/或丙型肝炎、肝脏硬化症或任何已知活性或慢性活性肝病病史的受试者从研究中排除。

计划以2:2:1比将约150名受试者随机分配(143名受试者实际上随机分配)给CVC100mg+安慰剂、CVC 200mg+安慰剂或获批的抗病毒药剂依法韦仑(EFV)+安慰剂，全部与获批的抗病毒药剂恩曲他滨/富马酸替诺福韦二吡呋酯(FTC/TDF)组合以固定剂量组合制剂提供为开放标签研究药物。在最初的25名研究受试者中开展药代动力学评估，以确认在所选的CVC 100mg和CVC 200mg的剂量下充分CVC血浆暴露，然后纳入剩余的研究群体。

人口统计和基线特征

大多数收受试者为男性(94％)和白人(62％)，平均年龄35岁，且平均体质指数为26.2kg/m²。总共32％的受试者是美国黑人/非裔美国人。此外，24％的随机分配受试者是西班牙裔。

在基线时，HIV-1感染的中位数持续时间(即第一次阳性HIV-1测试到知情同意日期的时间[月])是8个月，平均HIV-1 RNA为4.50log¹⁰拷贝/mL。(80％的受试者的病毒载量<100,000拷贝/mL)，且平均CD4+细胞计数为402个细胞/mm³(58％的受试者的CD4+细胞计数≥350个细胞/mm3)。

初步功效结果

主要功效终点为第24周的病毒学应答，利用FDA快照算法定义为HIV-1 RNA<50拷贝/mL。具有病毒学成功(应答)的受试者的百分比在三个治疗组中相当(CVC 100mg 76％，CVC 200mg73％，且EFV 71％)。与CVC 100mg组(17/59受试者，29％)和CVC 200mg组(15/56受试者，27％)相比，EFV组中更多受试者提前终止研究(11/28受试者，39％)。

第48周的数据与第24周观察到的数据一致。随时间推移具有病毒学成功的受试者的百分比在3个治疗组中大体上相当，但与EFV组相比，第48周时CVC组更高(CVC 100mg68％，CVC 200mg 64％且EFV 50％)。

次要和探索性分析

炎症的生物标记物

作为探索性分析，测量炎症生物标记物MCP-1、sCD14、高敏C-反应蛋白[hs-CRP]、白介素n-6[IL-6]、D-二聚体和纤维蛋白原)的水平。表25中汇总了MCP-1、sCD14、hs-CRP、IL-6、D-二聚体和纤维蛋白原的基线值和在第24周和第48周与基线相比的变化。

表25

N＝受试者的数量

备注：基线被定义为在研究治疗开始前的最后一次不可缺失的评估。

*使用LSMeans基于具有治疗、基线和基线下HIV-1RNA的因素的ANCOVA模型与EFV组进行的成对比较显示<0.001的p值。

#治疗组之间的差异(如利用控制基线HIV-1RNA的van Elteren检验所评估)具有统计显著性(p值：0.048)。

使用CVC观察到MCP-1(CCR2的配体)随时间增加的剂量-反应，而MCP-1在EFV组中保持基线值(参见图46)。EFV和CVC 100mg与CVC 200mg治疗组之间的血浆MCP-1与基线相比的变化的差异在第24周和第48周具有统计显著性(p<0.001)(参见表25)。

此外，在两个CVC治疗组中，观察到sCD14在48周治疗期间的下降(重复sCD14分析的线性混合模型分析，参见下文)，而在EFV组中，观察到sCD14在相同的观察期内增加(参见图47)。可溶性CD14是单核细胞活化的生物标记物，且独立地与大型长期定群研究中HIV感染患者的发病率和死亡率以及具有慢性病毒性肝炎的患者和具有严重肝纤维变性的患者中的较差临床结果相联系。

sCD14样品起初在2个独立批次中进行分析：批次1包括第24周初步分析前的样品，且批次2包括第32周和第48周(研究结束)样品。表25中提供来自2-批次分析的sCD14与基线相比的变化的结果。开展全部在一个批次中分析的存档样品的重复分析，以获得不同时间点的分析一致性。为控制协变量的效果，对sCD14于基线相比的变化开展线性混合模型重复测量(分析日期为2013年9月)。除CVC 200mg组中从基线到第32周的变化以外，与使用EFV观察到的增加相比，两种剂量(100和200mg)下在48周治疗期间使用CVC观察到的sCD14水平(LS均数)具有统计显著性(p<0.05)(参见表26和图47)。

表26

在CVC和EFV治疗组中，其它炎症生物标记物(hs-CRP、IL-6、D-二聚体)的变化类似。

APRI和FIB-4评分

此外，在来自这个纳入根据严格合格标准(HIV-1感染且ALT/AST级别不≥2，总胆红素>ULN、HBV和/或HCV、活性或慢性肝病、硬化症或BMI>35kg/m2)无明显肝病的受试者的研究的数据的post-hoc分析中，在≥10％的所有CVC治疗受试者中经时观察到AST-血小板比率指数(APRI)和综合了标准生化值、血小板、ALT、AST和年龄(FIB-4)的无创性肝纤维变性指数评分的提高(合并CVC 100mg和200mg的数据)(图48)。在EFV组中，5％的受试者在第24周且6％的受试者在第48周的APRI评分与基线相比下降一个类别；没有用EFV治疗的受试者的FIB-4评分下降一个类别，其中所有受试者在基线时评分<1.45。

如上所述，在这个研究中，CVC还对sCD14(单核细胞活化的重要标记物)具有显著影响。在上述相同post-hoc分析中，CVC治疗受试者在第24周的FIB-4评分与sCD14水平的变化间以及第48周的FIB-4评分与sCD14水平的变化间具有统计上显著的相关性。图49和图50中示出第48周的结果。

安全性结果

暴露程度

在CVC组中，摄入研究药物(CVC或EFV)的平均持续时间比EFV治疗组长(CVC 100mg和200mg分别为41.2和40.9周，相对地，EFV为36.2周)，在EFV组中，这受到较高中断率的影响。

所有不良事件汇总

总计，CVC 100mg组、CVC 200mg组和EFV组中分别有51名受试者(88％)、48名受试者(84％)和27名受试者(96％)具有至少1个AE。最常报道的AE(首选术语，3个治疗组中任一个中≥10％受试者)是恶心、上呼吸道感染、腹泻、头疼、皮疹事件、疲劳、头晕、鼻咽炎、异常梦境、失眠、淋巴结病、抑郁和梅毒(表27)。在这些最常报道的AE中，在CVC组中，头疼、疲劳和上呼吸道感染比EFV组报道更频繁；且在EFV组中，头晕、异常梦境、失眠、淋巴结病、抑郁和梅毒比CVC组报道更频繁。

表27

N＝受试者数量；n＝观察的数量。

备注：使用MedDRA版本13.1将不良事件编码。只报告发作日期在研究药物的第一次给药日期至研究药物停用后30天内之间的不良事件。对于经历相同编码事件超过一次的受试者，只呈现具有最高严重度的事件。

^a注意暴露是基于ITT群体。

^b包括皮疹、斑状丘疹、瘙痒性皮疹、全身性皮疹和流行性皮疹。

大多数AE是轻度或中度(1级或2级)。3级或4级AE汇总于表29中。经历≥3级AE的受试者的百分比在CVC组中(总计4％)比在EFV组中(15％)低。EFV组中的一个受试者(受试者06007)具有自杀意念的4级AE，这被认为是严重的。在经CVC治疗的受试者中没有4级AE的报告。没有在超过1个受试者中报道≥3级的AE(首选术语)。表28提供了死亡、SAE、AE、不同严重程度的AE、与研究药物相关的AE和导致停药的AE的概述。

表28

N＝受试者数量；n＝观察的数量。

^a注意暴露是基于ITT群体。

^b根据研究人员所知被认为与研究药物(即，CVC、EFV或FTC/TDF)至少部分相关的AE。

表29

N＝受试者数量；n＝观察的数量。

^a 注意暴露是基于ITT群体。

^b CVC 100mg组中的受试者10004和54001

^c CVC 200mg组中的受试者06009、42001和45005

^d EFV组中的受试者06005、06007、46003和48001

^e 备注：这项(EFV组中的自杀意念)是4级事件；所有其它事件为3级。

严重的不良事件汇总于表30中。

表30-直到第48周具有严重不良事件的受试者的数量(％)-安全性群体

N＝受试者数量；n＝观察的数量。

备注：使用MedDRA版本13.3将不良事件编码。只报告发作日期在研究药物的第一次给药日期至研究药物停用后30天内之间的不良事件。对于经历相同编码事件超过一次的受试者，只呈现具有最高严重度的事件。

^a 注意暴露是基于ITT群体。

导致停药的不良事件

导致研究药物停用的AE汇总于表31中。总的来说，导致研究药物停用的AE发生在CVC 200mg组的1个受试者中(2％)，以及EFV组的6个受试者中(21％)。在超过1个受试者中报告的导致研究药物停用的AE(首选术语)是失眠和眩晕，在EFV组中分别报告于3和2个受试者中；以及抑郁，在CVC 200mg组中报告于1个受试者中并且在EFV组中报告于1个受试者中(失眠、眩晕和抑郁都是EFV的常见AE)。

表31-直到第48周具有导致研究药物停用的不良事件的受试者的数量(％)-安全性群体

N＝受试者数量；n＝观察的数量。

^a 注意暴露是基于ITT群体。

^b CVC 200mg组中的受试者06001。

^c EFV组中的受试者02016、16031、20004、26001、46003和48001。

具有分级的治疗突发实验室异常的受试者数目的概述提供于表32中。

表32

N＝受试者数量；n＝观察的数量。

a 百分比是基于具有给定实验室评估的受试者的数量。

3或4级(最坏毒性等级)治疗突发实验室异常汇总于表33中。除了在CVC 200mg组中观察到更频繁的CPK异常以外，具有3级或4级实验室异常的受试者的百分比在治疗组之间无差异。

表33-直到第48周的治疗突发的3级或4级(最坏等级；DAIDS)实验室参数-安全性群体

N＝受试者数量；n＝观察的数量。

a 百分比是基于具有给定实验室评估的受试者的数量。

在CVC 200mg组中观察到的肌酸磷酸激酶(CPK)的3级或4级增加比在其它两个治疗组中更频繁。在CVC组中的具有3或4级CPK增加的12个受试者(CVC 100mg有3个受试者且CVC 200mg有9个受试者)中，11个受试者具有在单一时间点下观察到的CPK升高(8个受试者具有3级升高且3个受试者具有4级升高)(注意：这11个受试者中的1个[受试者48015]在第8周和第36周具有单独的3级CPK升高)。第12个受试者(受试者42001)具有2个连续的CPK升高(3级之后4级)，它们在后续访问下进行持续治疗的同时恢复到正常值。CPK升高均不与临床症状相关；没有受试者因CPK升高而停药，并且在CVC和EFV组之间没有与肌肉骨骼病症相关的AE的差异。

CPK的基线变化示于图51中。在任何治疗组中均没有观察到CPK的随时间变化的实际值或基线变化的明显趋势。

具有选定的目标肝脏参数的分级治疗突发实验室异常的受试者的数量示于表34中。没有观察到4级ALT或AST升高。除了一个3级AST升高，所有的ALT和AST升高均为1级或2级。在1个受试者(CVC 100mg组中的48015)中的3级AST升高是在单一时间点下被观察到并且是无症状的；该受试者没有因3级AST升高而停用研究药物并且没有报告与AST升高相关的AE。此外，这个具有3级AST升高的受试者没有任何分级胆红素升高，而是在与3级AST升高相同的研究访问下具有单个3级CPK增加。所有胆红素异常均为1级或2级。大多数ALT、AST和胆红素升高是短暂的，在后续访问时进行持续治疗后恢复至基线值，与任何临床症状不相关，并且没有造成停药。

表34-直到第48周的治疗突发最坏等级(DAIDS)选定肝脏参数实验室异常-安全性群体

N＝受试者数量；n＝观察的数量。

a 百分比是基于具有给定实验室评估的受试者的数量。

在第24和48周进行探索性分析，以评价具有治疗突发实验室不良事件的受试者中的CVC暴露。特别受关注的是CPK升高(鉴于CPK异常在CVC 200mg组中的发生率增加)，以及受关注的肝脏参数(AST、ALT和胆红素)。两个暴露参数(Cavg和Cmin)被认为可合理地探索与实验室异常的可能的关系；然而C_avg被认为是最相关的，因为它反映总体CVC暴露。

尽管由于研究治疗组之间的差异而存在关于CPK升高的剂量-反应关系的可能信号，但这些广泛的探索性分析都未能发现任何暴露-反应关系。评估Ln暴露的Logistic回归分析输出与CPK严重度等级>2的概率的关系曲线没有确定CVC暴露和CPK升高之间存在关联。没有CPK升高的频率或严重度相对于CVC暴露渐增的趋势。

对ALT、AST和胆红素升高进行类似分析，并且这些分析也没有揭示CVC暴露和肝脏相关的实验室异常间的任何明显的关系(图52-图55)。

代谢参数

具有空腹访问下的分级治疗突发空腹实验室异常的受试者的数量示于表35中。总胆固醇、LDL胆固醇、甘油三酯或葡萄糖的所有异常均为1级或2级。在CVC组中具有总胆固醇和LDL胆固醇异常的受试者的百分比比在EFV组中低，这与在CVC治疗期间胆固醇随时间的减少相一致(图56)。

表35-直到第48周的空腹访问下的治疗突发的最坏等级(DAIDS)空腹实验室异常。

N＝受试者数量；n＝观察的数量。

备注：(LDL)胆固醇的4级异常和甘油三酯的1级异常无法利用DAIDS分级量表获得。

a 百分比是基于具有给定实验室评估的受试者的数量。

HbA1c、HOMA-IR、空腹LDL、空腹HDL、空腹总胆固醇、空腹总胆固醇/HDL比和空腹甘油三酯的平均基线值和基线变化示于表36中。代谢参数的平均基线变化示于图56中。在CVC治疗(包括CVC100mg和200mg两者)期间观察到总胆固醇的减少，这主要是由于LDL胆固醇的减少(见表36)。与此相反，在EFV治疗期间观察到LDL胆固醇以及HDL胆固醇的增加。在所有的治疗组中观察到空腹总胆固醇/HDL比的小幅和相当的下降。没有观察到葡萄糖、胰岛素、HOMA-IR、HbA1c和甘油三酸酯随时间推移的显著变化(见表36)。

表36-直到第48周的空腹代谢实验室参数的平均基线变化-安全性群体

HbAlc＝血红蛋白类型A_lc；HDL＝高密度脂蛋白；HOMA-IR＝稳态模型评估–胰岛素抗性；LDL＝低密度脂蛋白；N＝受试者数量。

在任何治疗组中，没有在第24周和第48周观察到腰臀比从基线的显著变化。

心血管安全性

治疗期间最坏的治疗突发ECG异常汇总于表37中。CVC组中具有>30–60msec的QTc增加的受试者的比例相比于EFV组是较低的。在CVC 100mg组中只有1个受试者具有>60msec的QTc增加。没有受试者具有延长的或病理上延长的QTc。

在任何治疗组中的治疗期过程中，没有观察到ECG参数的临床相关的变化。

表37-直到第48周的治疗期内的最坏的治疗突发ECG异常

N＝受试者数量；n＝观察的数量。

备注：百分比是基于具有给定ECG参数的受试者的数量。

a QTcF：正常<450ms≤边界<480ms<延长≤500ms<病理

b QTcB：正常<450ms≤边界<480ms<延长≤500ms<病理

c 异常QRS：异常低≤50ms<正常<120ms≤异常高

d 该受试者(受试者06004)在24周具有120ms的QRS值并且具有125ms的筛选值和<120ms的基线值(即111ms；参见列表16.2.8.7)。

e 异常PR：正常<210ms≤异常高。

f 异常HR：异常低≤50bpm<正常<120bpm<异常高。

生命体征

在任何治疗组中均未观察到关于任何生命体征参数(收缩压和舒张压、心率)的临床相关的平均变化。来自2期试验的关于MCP-1的数据观察结果。MCP-1蛋白和基因表达被证明在具有不同程度的肝损伤和纤维化的慢性肝病患者的肝组织中被上调。如前所示，在非临床和临床研究中的CVC治疗后观察到血浆MCP-1水平的代偿性增加，这表明有效的CCR2阻断。虽然继发于CVC的CCR2拮抗作用的MCP-1水平的持久代偿性增加在人类中的影响目前尚不清楚，但现有数据基于48周的安全性数据未表明肝胆障碍的风险增加或肝脏参数的异常。

没有在临床病理学参数或任何组织包括肝中通过在1000mg/kg/天的高剂量下的显微评价看见炎症的任何指示，其中在慢性(3和9个月)猴毒性研究中的血浆MCP-1水平是对照的～5倍。

事实上，在NASH的小鼠模型中观察到的100mg/kg/天剂量的CVC的抗纤维化作用与显著增加的血浆MCP-1水平一起被看见。另外，在经CVC治疗的受试者中观察到APRI和FIB-4纤维化指数评分的改善长达48周，尽管MCP-1显著和持续地升高。另外，在此研究中，CVC在经受CVC 100mg和200mg治疗的115个受试者中普遍耐受良好长达48周。

第1年和第2年的NAS和肝纤维化阶段(NASH CRN系统和Ishak)的变化将通过组织学进行评估。肝活检物上的胶原的形态定量评估的变化也将进行评估。将评价疗效终点和MCP-1血浆水平之间的相关性，以确定伴随CVC治疗所观察到的持久MCP-1增加是否在具有由NASH所引起的肝纤维化的受试者中造成潜在危险。

实施例23：炎症和免疫功能的生物标记物

使用CVC观察到MCP-1(在单核细胞上发现的趋化因子受体CCR2的配体)随时间增加的剂量反应，而MCP-1在EFV组中保持基线值。EFV与CVC 100mg和CVC 200mg治疗组之间的血浆MCP-1的基线变化的差异在第24周和第48周是统计显著的(p<0.001)，这表明CVC的有效和剂量依赖性CCR2阻断。此外，在两个CVC治疗组中均观察到sCD14(单核细胞活化的生物标记物和HIV感染的死亡率的独立预测因子)在最初24周内的下降，而在EFV组中，在相同的观察期内观察到sCD14的增加。在第24周和第48周之间，sCD14水平在经CVC治疗的受试者中恢复到基线值，而它们在经EFV治疗的受试者中继续上升。CVC组和EFV组之间的基线变化的差异在第24周和第48周以及在重复分析中的第48周是统计显著的(p<0.001)。这些结果表明CVC对降低单核细胞活化的潜在作用。

在治疗组之间没有观察到其它炎症生物标记物(hs-CRP、纤维蛋白原、IL-6和D-二聚体)和免疫功能生物标记物(CD4+T细胞或CD8+T细胞上的总CD38+表达和总HLADR+表达)的基线变化的有意义的差异。

实施例24：与细菌易位有关的生物标记物的测量

在经CVC治疗的受试者中的sCD14水平的降低也可以等同于细菌易位的减少，细菌易位是在HIV感染患者[15]以及具有NASH[16-18]、酒精性肝病[17,19]、HIV/HCV共感染[20]和肝硬化[21]的患者中普遍观察到的现象。细菌易位是由于肠上皮细胞紧密连接(TJs)的破坏而产生，其损害肠粘膜屏障，该现象通常被称为肠漏。肠完整性的降低已与免疫缺陷和/或肠道菌群的显著变化(也被称为生态失调和细菌过度生长)相关联。微生物产物如脂多糖(LPS)和16S核糖体DNA(16S rDNA)的后续易位有助于免疫激活。LPS(革兰氏阴性细菌的细胞壁的组分)结合膜或可溶性CD14(sCD14；在LPS激活单核细胞后产生)和髓样分化蛋白-2(MD-2)-TLR4复合物[14]。

脂多糖在单核细胞和巨噬细胞中是炎性细胞因子特别是TNF-α的最有效的诱导物。高血浆sCD14水平预测HBV和HCV感染的疾病进展，而不依赖于肝脏炎症、纤维化和疾病进展的其它标记物[20]。暴露于肠源性细菌产物(最显著的是内毒素，包括LPS)导致肝脏炎症、肝细胞损伤和肝纤维化[22]。经由TLR4依赖性机制的枯否细胞活化和肝星状细胞的后续活化都是纤维发生的有效驱动因子[19]。

该假设将通过测试来自研究652-2-202、即将进行的肝损害研究652-1-121和肝纤维化PoC研究652-2-203的归档样品中的细菌易位的生物标记物进行评价。这些生物标记物将包括LPS、LPS结合蛋白(LBP)、sCD14、肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)。

实施例25-基于CVC临床第1阶段数据和第2阶段的总结

感染HIV的受试者中的数据。CVC已经在健康志愿受试者(n＝390)的14个单剂量和多剂量生物利用度研究和DDI研究中以及感染HIV的受试者(n＝159)(包括用CVC治疗长达48周的115个受试者)的两个2期研究中进行评价。

在仅提供CVC的1期研究中观察到的最常见的不良事件与在1期研究单元中通常报道的情况是一致的。总体而言，不良事件的模式表明CVC在评价高达800mg的单剂量CVC的这些1期研究中以及在持续10天的多个高达200mg的日剂量下普遍耐受良好。在这些研究中观察到的转氨酶升高的频率和幅度与科学文献中针对1期研究所描述的模式是一致的。已经在2a期的10天CVC单药治疗研究中以25mg至150mg的剂量(n＝44)以及在2b期的48周疗效和安全性研究中以CVC 100mg和CVC 200mg的剂量(n＝115)评价CVC。在两项研究中和所有剂量下，CVC均呈现有利的不良事件概况。基于来自2b期研究的48周数据，CVC与肝胆病症或转氨酶升高的风险增加不相关。在此研究中，在经CVC治疗的受试者中观察到总胆固醇和LDL胆固醇的降低。在48周的治疗期内，没有观察到临床相关的ECG参数的变化或任何生命体征参数的变化。没有观察到关于不良事件、实验室异常(包括CPK、ALT、AST和胆红素升高)或剂量限制性毒性的明显的剂量或暴露关系。

基于来自1期程序的数据和来自HIV感染受试者的研究的2期数据，我们计划在研究652-2-203中，在患有由NASH所致的肝纤维化的受试者的治疗中评价每天服用一次的CVC150mg持续2年时间(主要研究终点在第1年)。这项研究的交叉设计将评价连续2年的CVC治疗以及在1年安慰剂治疗后进行1年CVC治疗的安全性和疗效。CVC治疗对由NASH所引起的肝纤维化的影响的标准评估将基于来自肝活检的数据和组织学改善的其它量度来进行。安全性和耐受性将被评估，并且将对肝或其它器官毒性的迹象进行仔细监测，包括由独立的数据监测委员会进行的定期数据审查。预期该研究将阐明CVC的抗炎和抗纤维化活性及其对由NASH所引起的肝纤维化的影响，并且针对CVC 150mg的安全性和耐受性评估提供额外的数据。

实施例26-评价NASH中的肝组织学改善的CVC研究

基于指示CVC具有抗炎和抗纤维化活性并且普遍耐受良好的非临床和临床数据，Tobira计划在2期研究中在患有由NASH所引起的肝纤维化的受试者中探究CVC。该2期研究将评价CVC治疗患有肝纤维化的成年受试者中的NASH的功效，这些成年受试者由于至少一种影响因素的存在而处在疾病进展的风险下，所述影响因素包括2型糖尿病(T2DM)、具有由美国国家胆固醇教育计划(NCEP)所定义的代谢综合征(MS)的至少1个标准的高体质指数(BMI)(>25kg/m2)、桥连纤维化和/或明确型NASH(NAS≥5)。

该2期研究旨在评价CVC治疗这种严重病状的潜力并解决患有由NASH所引起的肝纤维化的患者的未满足的重大医疗需求。该研究是随机、双盲、安慰剂对照研究，其旨在评价CVC 150mg在患有由NASH所引起的肝纤维化的受试者中相比于安慰剂的疗效和安全性。研究群体由患有由NASH(NAS≥4)所引起的肝纤维化(NASH临床研究网络[CRN]阶段1-3)并且有疾病进展的风险的受试者组成。

将在研究652-2-203中基于以下考虑评价CVC 150mg(DP7制剂)的剂量对肝纤维化受试者中的NASH的治疗作用：

预期CVC将提供抗炎和抗纤维化活性，这主要是由于其对CCR2和CCR5共受体的拮抗作用以及对促炎性单核细胞募集、迁移和浸润到肝损伤部位所产生的影响。因此，对于选择用于本研究的剂量的主要考虑因素是确保CVC血浆暴露足以提供CCR2和CCR5的接近最大的拮抗作用。

CVC对CCR2和CCR5的拮抗作用已在体外和离体研究中以及CVC治疗HIV-1感染的2个临床研究(2a期研究652-2-201和2b期研究652-2-202)中进行评价。在每种情况下，观察到CCR2和CCR5的有效的和浓度依赖性的拮抗作用。通过在这2个2期研究中分别测定血浆MCP-1(CCR2的配体)浓度的基线变化和血浆HIV-RNA(HIV进入所需的CCR5共受体)的变化确立了CCR2和CCR5拮抗作用的临床证据。

在研究652-2-202中，CVC 100mg和CVC 200mg(DP6制剂)的剂量在115个HIV-1感染受试者中被评价长达48周(CVC摄入的平均[SE]持续时间：41.1[1.33]周)，并且被发现在HIV感染的治疗中是有效的和耐受良好的。基于表明渐增的CVC血浆浓度与改善的病毒学结果具有相关性的暴露-反应分析，CVC 200mg被认为是用于在3期研究中进一步评价CVC作为治疗HIV感染的抗病毒剂的适当剂量。

然而，当在相同的给药条件下施用CVC时(研究652-1-111、652-1-110、652-2-202)，在非HIV感染的健康志愿受试者中的CVC血浆暴露似乎比在HIV感染受试者中高。在研究652 2 203中将评价CVC 150mg的剂量对肝纤维化受试者中的NASH的治疗。基于引用的现有数据，该剂量被认为是在治疗上相关的范围内并且预期将在患有NASH和肝纤维化的受试者中提供与CVC 200mg相当的暴露，CVC 200mg在研究652-2-202中进行评价并且被发现产生有效的CCR2和CCR5拮抗作用。

计划共有250个受试者(每个治疗组125个受试者)，并且总研究治疗持续时间为2年。研究群体将包括患有NASH(NAS≥4)和肝纤维化(阶段1至3[NASH CRN系统])的受试者，其由于≥1个影响因素的存在而具有增加的疾病进展风险：

2型糖尿病的书面证据

具有如NCEP所定义的代谢综合征的下列标准中的至少1个的高BMI(>25kg/m2)：

中心性肥胖：腰围≥102cm或40英寸(男性)，≥88cm或35英寸(女性)

血脂异常：TG≥1.7mmol/L(150mg/dL)

血脂异常：HDL胆固醇<40mg/dL(男性)，<50mg/dL(女性)

血压≥130/85mmHg(或接受高血压治疗)

空腹血糖≥6.1mmol/L(110mg/dL)；或

桥连纤维化(NASH CRN阶段3)和/或明确型NASH(NAS≥5)。

将会有2个治疗期。治疗期1将由1年的双盲随机治疗(CVC 150mg或匹配的安慰剂)组成。受试者和研究人员在周期1期间将对治疗分配保持不知情。在治疗期2期间，原本随机分配到CVC 150mg的受试者将继续接受该治疗额外的一年，且原本随机分配到安慰剂的受试者将从安慰剂交叉到CVC 150mg。

受试者将接受研究药物，每天一次(QD)，持续2年。该研究将包括2个治疗期：治疗期1(第一年)和治疗期2(第二年)。合格的受试者将在治疗的第一年期间(治疗期1)被分配到接受CVC(n＝126)或匹配的安慰剂(n＝126)。对于治疗期2，经安慰剂治疗的受试者的一半(在基线处随机分配)将交叉到CVC，而另一半将在第二年的治疗中继续接受安慰剂。在基线处(第1天)，筛选评价后，合格的受试者将利用通过筛选时的NAS(4或≥5)和纤维化分期(≤2或>2)分层的置换区组随机化分配给治疗组。合格的受试者将以2:1:1的比率被随机分配至以下3个治疗组之一：

表38

组	n	治疗期1	治疗期2
				A	126	CVC 150mg,QD	CVC 150mg,QD
B	63	匹配安慰剂，QD	CVC 150mg,QD
				C	63	匹配安慰剂，QD	匹配安慰剂，QD

CVC和匹配的安慰剂将会作为双盲研究药物施用。研究药物(CVC/匹配安慰剂)应该每天早晨随食物一起服用。

主要终点(第1年)活检必须在治疗期1结束前的1个月内和开始治疗期2之前进行。最后(第2年)活检必须在研究药物治疗结束前的1个月内进行。

招募将在有限数量的地点开始，直到最多20个受试者已被随机分配和治疗并且安全性数据已由数据监测委员会(DMC)审查。第一DMC审查将在第一个受试者被招募的3个月内，或当最多20个受试者已被随机分配并且至少10个受试者已被治疗1个月时进行，无论哪种情况先发生。一旦DMC已评价这些最初的10至20个受试者的安全性数据并确定该研究可以继续，就将进行其余的研究受试者的后续招募。

在治疗期1期间，所有受试者将在第1个月的第2周和第4周接受安全性评估。另外，最初的20个受试者将在第1个月的第1周和第3周接受安全性评估。所有受试者将在第2个月期间每2周接受一次研究访问评估，在第3至6个月期间接受每月一次的访问，并在第8、10和12个月接受访问。在治疗期2期间，受试者将在第13至15个月期间以及第18、21和24个月接受每月访问。

重点评估

在研究期间：

肝活检将在筛选时、在主要终点处(第1年：治疗期1结束前的1个月内和开始治疗期2之前)和在第2年(治疗结束前的1个月内)进行。

促炎性细胞因子、炎症的生物标记物、肝细胞凋亡的生物标记物、细菌易位的生物标记物、空腹代谢参数、肾参数和eGFR将在基线处以及第3、6、12、15、18和24个月进行测量。

在可用的部位，非侵入性肝成像(例如，超声瞬时弹性成像[TE]、二维磁共振弹性成像[MRE]、声辐射力脉冲[ARFI])的评估将在基线处以及在第6、12、18和24个月进行。

CVC的药代动力学样品将在基线处(在即将开始治疗前的给药前样品)、第0.5、3和15个月(给药前和给药后至少1小时)以及第6、12、18和24个月(给药前)进行收集。

体重、腰围、臀围、臂围和三头肌皮褶厚度将在基线处和第3、6、12、15、18和24个月进行测量。身高将在筛选时和第12个月进行测量。

身体检查和实验室分析将在每次访问时进行。ECG将在基线处和在第3、6、12、15、18和24个月进行。

不良事件和伴随用药将在每次访问时进行评估。

知情同意书和有关NASH、肝纤维化和肝活检程序的患者教育材料将在筛选访问时进行审查。

研究药物日记将在分配研究药物的同时被提供给每个受试者。该日记将在所有治疗期间访问和早期停药访问时进行审查。

受试者将在接受其最后治疗后的1个月返回临床以接受研究结束时的随访评价。

该研究的主要疗效目标将是评价第1年的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)活性评分(NAS)相对于筛选活检的肝组织学改善，由最小2分的NAS改善以及小叶炎症和气球样变性分类的至少1分的改善和没有纤维化分期的同时恶化(恶化被定义为进展至桥连纤维化或肝硬化)所定义。

次要疗效目标包括评价在第2年无肝纤维化分期的同时恶化(恶化被定义为进展至桥连纤维化或肝硬化)的NASH分解；在第1年无肝纤维化分期的同时恶化(恶化被定义为进展至桥连纤维化或肝硬化)的NASH分解；CVC在肝纤维化成年受试者的1年和2年NASH治疗中的安全性和耐受性；CVC在群体PK分析中的血浆PK的表征；评价第2年的NAS的肝组织学改善，由最小2分的NAS改善和超过1个分类的至少1分的改善以及没有纤维化分期的同时恶化(恶化被定义为进展至桥连纤维化或肝硬化)所定义；在第1年和第2年评价CVC在肝纤维化成人受试者中相对于安慰剂的疗效，如肝活检物上的形态定量胶原的变化所测定；在第1年和第2年评价组织学纤维化分期(非酒精性脂肪性肝炎临床研究网络[NASH CRN]系统和Ishak)的变化；在第1年和第2年评价肝组织纤维发生蛋白(α-平滑肌肌动蛋白[α-SMA])的变化；在第3、6、12、15、18和24个月评价非侵入性肝纤维化标记物(APRI、FIB-4、透明质酸、FibroTest(FibroSure)、NAFLD纤维化评分[NFS]和增强肝纤维化测试[ELF])的基线变化；在第1年和第2年评价肝细胞凋亡的生物标记物的基线变化；在第3、6、12、15、18和24个月评价肝脏参数和空腹代谢参数的基线变化；在第3、6、12、15、18和24个月评价体重、BMI、腰围、腰臀比、臂围和三头肌皮褶厚度的基线变化。

第三目标包括评价非侵入性肝成像方法(例如，超声瞬时弹性成像[TE]、二维磁共振弹性成像[MRE]、声辐射力脉冲[ARFI])在第6、12、18和24个月(在可用的部位)的基线变化；促炎性细胞因子和炎症的生物标记物在第3、6、12、15、18和24个月的基线变化；肾小球滤过率估计值(eGFR)和肾参数在第3、6、12、15、18和24个月的基线变化；以及与细菌易位相关的生物标记物在第3、6、12、15、18和24个月的基线变化。

本文中的详细说明描述了本发明的各个方面和实施方案，然而，除非另有规定，否则这些都不旨在为限制性的。事实上，已阅读本公开的本领域技术人员将预想到可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下作出的变化、改变和调整，所有这些都应该被认为是本发明的一部分，除非另有规定。因此，申请人预想本文所描述的发明将仅受所附权利要求书限制。

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Claims

1.一种治疗有需要的受试者中的纤维化或纤维化疾病或病状的方法，其包括向所述受试者共施用治疗有效量的赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物以及额外的活性剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维化或纤维化疾病或病状是肝纤维化或肾纤维化。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物被配制成包含赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物和富马酸的药物组合物。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述肝纤维化与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述肝纤维化与非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)相关。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述肝纤维化与新兴肝硬化相关。

7.根据权利要求2所述的方法，其中所述肝纤维化包括非肝硬化性肝纤维化。

8.根据权利要求2所述的方法，其中所述受试者被人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述受试者患有选自由酒精性肝病、HIV和HCV共感染、病毒性肝炎(诸如HBV或HCV感染)、2型糖尿病(T2DM)、代谢综合征(MS)及其组合所组成的组的疾病或病状。

10.一种治疗有需要的受试者中的NASH的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物；其中所述NASH与2型糖尿病(T2DM)相关。

11.一种治疗有需要的受试者中的NASH的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物；其中所述NASH与代谢综合征(MS)相关。

12.一种治疗有需要的受试者中的NASH的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物；其中所述NASH与HIV和HCV共感染相关。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物被配制成口服组合物。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物是每天施用一次或每天施用两次。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述赛尼克韦罗或其盐或溶剂化物是与一种或多种额外的活性剂共施用。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种额外的活性剂是选自由以下所组成的组的一种或多种抗逆转录病毒剂：进入抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、成熟抑制剂及其组合。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种额外的抗逆转录病毒剂选自由以下所组成的组：拉米夫定、依法韦仑、雷特格韦、威维康、贝韦立马、α-干扰素、齐多夫定、阿巴卡韦、洛匹那韦、利托那韦、替诺福韦、替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦前药、恩曲他滨、埃替格韦、可比司他、地瑞那韦、阿扎那韦、利匹韦林、度鲁特韦及其组合。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种额外的活性剂是一种或多种免疫系统抑制剂。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种额外的活性剂选自由以下所组成的组：环孢霉素、他克莫司、泼尼松龙、氢化可的松、西罗莫司、依维莫司、硫唑嘌呤、霉酚酸、甲氨蝶呤、巴利昔单抗、达利珠单抗、利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白及其组合。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括检测接受纤维化或纤维化疾病或病状治疗的受试者中的一个或多个生物分子的水平，以及基于一个或多个生物分子的水平的增加或减少确定治疗方案，其中所述生物分子选自由以下所组成的组：脂多糖(LPS)、LPs结合蛋白(LBP)、16S rDNA、sCD14、肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、连蛋白-1、胶原蛋白1a1和3a1、TGF-β、纤连蛋白-1、hs-CRP、IL-1β、IL-6、IL-33、纤维蛋白原、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β、RANTES、sCD163、TGF-β、TNF-α、肝细胞凋亡的生物标记物如CK-18(半胱天冬酶裂解型和完整型)和其组合。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括检测接受纤维化或纤维化疾病或病状治疗的受试者中的一个或多个生物分子的水平，其中一个或多个生物分子的水平相较于预定标准水平的增加或减少预测纤维化或纤维化疾病或病状的治疗功效，其中所述生物分子选自由以下所组成的组：脂多糖(LPS)、LPs结合蛋白(LBP)、16S rDNA、sCD14、肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、连蛋白-1、胶原蛋白1a1和3a1、TGF-β、纤连蛋白-1、hs-CRP、IL-1β、IL-6、IL-33、纤维蛋白原、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β、RANTES、sCD163、TGF-β、TNF-α、肝细胞凋亡的生物标记物如CK-18(半胱天冬酶裂解型和完整型)和其组合。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述一个或多个生物分子是在来自接受纤维化或纤维化疾病或病状治疗的受试者的生物样品中进行测量。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述生物样品选自血液、皮肤、毛囊、唾液、口腔粘膜、阴道粘膜、汗液、泪液、上皮组织、尿液、精子、精液、精浆、前列腺液、预射精液(考珀液)、排泄物、活检物、腹水、脑脊液、淋巴、脑以及组织提取物样品或活检样品。