CN1244352C - 黄连解毒汤及其活性部位的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开黄连解毒汤及其活性部位新用途，该活性部位为棕黄色粉末，具有一定的吸湿性，可溶于热水和热烯乙醇。碘化铋钾、碘化汞钾等反应均为阳性。主要含有生物碱类、黄酮类和环烯醚萜苷类成分，其中总生物碱类成分的含量为12.5-14.5%、总黄酮类成分的含量为31.5-32.5%。HPLC测定栀子苷含量为7.5-8.5%，黄芩苷含量为9.5-10.5%。另含有一定量的有机酸甾醇、三萜和其它成分。该黄连解毒汤及其活性部位具有很好的治疗缺血性脑中风作用。

Description

黄连解毒汤及其活性部位的新用途

发明领域

本发明涉及一种中成药及其活性部位的新用途，特别是涉及黄连解毒汤及其活性部位的新用途。

背景技术

缺血性脑中风是临床常见病，以其高发病率、高致残率、高死亡率而严重危害人类健康。目前用于心脑血管疾病治疗的中西药制剂虽较多，但尚无理想的治疗缺血性脑中风的药物，尤其是从纯中药制剂中分离出具有良好的治疗缺血性脑中风的药物有效部位及活性成分的方法及相关制剂并不多见。

本发明遵循中风病“毒损脑络”的现代中医学说，从具有改善脑血流量作用的中医经典名方“黄连解毒汤”中分离出治疗缺血性脑中风的有效部位，并在此基础上研制治疗缺血性脑中风的中药有效部位新制剂。

发明内容

本发明的一个目的在于提供黄连解毒汤活性部位；本发明的目的还在于提供黄连解毒汤及其活性部位的治疗缺血性脑中风新用途。

本发明治疗缺血性脑中风的活性部位为棕黄色粉末，具有一定的吸湿性，可溶于热水和热稀乙醇。碘化铋钾反应、碘化汞钾反应、硅钨酸反应、三氯化铁反应、三氯化铝反应、盐酸-镁粉反应、醋酐-浓硫酸反应、α-萘酚-浓硫酸反应均为阳性。主要含有生物碱类、黄酮类和环烯醚萜苷类成分，其中总生物碱类成分的含量为12.5~14.5％、总黄酮类成分的含量为31.5~32.5％。HPLC测定栀子苷含量为7.5~8.5％，黄芩苷含量为9.5~10.5％。另含有一定量的有机酸(如藏红花酸含量为0.3~0.4％)、甾醇、三萜和其它成分。

本发明药物活性部位物的制备方法：按9∶6∶6∶9称取黄连、黄芩、黄柏、栀子15重量份混合均匀，加水煎煮2~3次，每次加水135~165体积份，煎煮50~70min后，趁热过滤，合并各次滤液，静置60-72h，4300-4500转/min离心，得沉淀I。上清液浓缩至175-185体积份，通过弱极性的AB-8型大孔吸附树脂进行吸附，待上清液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用40~70％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到乙醇洗脱物II。将沉淀I和乙醇洗脱物II混合均匀，即得到黄连解毒汤治疗缺血性脑中风的活性部位。

按药剂学方法，可以将本发明药物活性部位制备成多种临床药物剂型，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂当中的一种；所说的非肠道给药剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种。本发明药物还可加入常规的药物赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂等。

黄连解毒汤及其活性部位具有很好的治疗缺血性脑中风作用。

实验例：本发明活性部位对缺血性脑中风治疗的药理作用

1材料与方法：1.1药品与试剂：黄连解毒汤有效部位，黄连解毒汤流浸膏(每毫升相当于原药材1g)，由中药学院中药化学系提供；牛黄清心丸，同仁堂集团公司产品；红四氮唑(2，3，5，三苯基氯化四氮唑，TTC)分析纯，中国医药(集团)上海化学试剂公司生产，批号：990930；硫酸庆大霉素，烟台只楚药业有限公司产品，批号000208；伊文思兰：上海化学试剂采购供应站经销，批号：821102；甲酰胺，苏州正兴化工研究所出品，分析纯，批号：960630；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S-转移酶(GSH-ST)和还原型谷胱胺态(GSH)测试试剂盒由南京建成生物工程公司提供。1.2实验动物：SD大鼠，体重200~230g(多发脑梗塞用6~8月龄，体重350~450g)由维通利华提供。1.3实验仪器：AEG-220型电子分析天平，日本岛津产品；400R低温离心机，德国Heraeus产品；XTT实体显微镜，北京电光科学仪器厂生产。DS型电热三用水箱，北京医疗仪器厂产品；HZQ-C空气浴振荡器，哈尔滨市东明医疗仪器厂；722型紫外分光光度计，上海第三分析仪器厂产品。1.4FeCl₃化学诱导大脑中动脉血栓闭塞模型的建立及神经行为与梗塞范围的测定：实验动物分七组，即对照组、MCAO模型组、黄连解毒汤有效部位大剂量(0.610g/kg)组；中剂量(0.305g/kg)组、小剂量(0.158g/kg)组；黄连解毒汤流浸膏4g/kg组；牛黄清心丸1.6g/kg。预先灌胃给药2天，2次/天。对照组与模型组给与等体积CMC。第三天晨给药后30分钟造模，大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(350mml/kg)麻醉。按Tamura等的方法，稍加改进。大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切去，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。置一小片塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有50％FeCl3溶液10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，常规皮肤消毒并腹腔注射硫酸庆大霉素防止感染，大鼠回笼饲养。假手术组，除不滴加FeCl3溶液外，其余操作同其余各组，术后当日继续给药，次日晨在给药一次后取材。造模后6h、24h按bederson等的方法加以改进，对动物进行评分。满分为4分，得分越高，动物行为障碍越严重，神经症状越明显。将各组动物评分进行组间t检验。动物经24h行为评分后，断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分在4℃冰盘上冠状切5片。迅速将脑片置于TTC染液中(每5mlTTC染液中含4％TTC1.5ml，1MK2HPO40.1ml)，37℃避光温孵30分，取出后置于10％甲醛溶液中避光保存。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区位白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占全脑重量百分比为脑梗塞范围，分别计算每只动物全脑和半脑，将各组动物脑梗塞范围进行组间t检验。1.5双侧颈总动脉结扎大鼠脑缺血模型的建立及脑毛细血管通透性的测定大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉，仰位固定，常规皮肤消毒。切开颈正中皮肤，分离双侧颈总动脉并埋线。舌下静脉注射2.5％伊文思兰生理盐水溶液50mg/kg，5分钟后结扎双侧颈总动脉，缝合肌肉与皮肤，其中假手术组只埋线不结扎。实验动物64只分六组，即假手术组、缺血模型组、实验动物分七组，即对照组、MCAO模型组、黄连解毒汤有效部位大剂量(0.610g/kg)组；中剂量(0.305g/kg)组、小剂量(0.158g/kg)组；黄连解毒汤流浸膏4g/kg组；牛黄清心丸1.6g/kg。预先灌胃给药三天，假手术组与模型组给与等体积CMC。第四日上午给药后1h进行造模。结扎6小时后，断头取全脑，去除嗅球小脑及脑干，将脑组织称重后置于4ml甲酰胺中，37度温孵浸泡24h，取上清液，用722型分光光度计620nm比色，根据标准曲线回归方程计算脑内EB含量，以每克脑组织湿重所含EB量进行标识，进行组间t检验。1.6同源血粉所致大鼠多发性脑梗塞模型的制备及该模型脑生化指标测定实验动物随机分7组：假手术组；模型对照组；黄连解毒汤有效部位大剂量(0.610g/kg)组；中剂量(0.305g/kg)组、小剂量(0.158g/kg)组；黄连解毒汤流浸膏4g/kg组；牛黄清心丸1.6g/kg。黄连解毒汤有效部位研细后用0.5％CMC配制。动物给药2天，每日剂量分上下午两次给与，假手术组和模型组给与同体积CMC。第三日晨再给药一次后进行造模。同源血块制备：在该批大鼠中取一只，水合氯醛麻醉后分离颈总动脉放血，血液37度放置48h至完全干燥，将干燥血块置研钵中研细，过75目筛，所得干燥细小血块备用，造模时用生理盐水配成3％混悬液。同源血块法脑梗塞模型造模：将大鼠水合氯醛麻醉，常规消毒后颈正中切口，分离暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉、翼腭动脉。首先在颈外动脉近端有医用缝合线打一活结暂时阻断，然后手术线打结阻断翼腭动脉。之后暂时夹闭颈总动脉，用1ml玻璃注射器吸取3％血块生理盐水混悬液0.5ml由颈总动脉穿刺缓慢注射使血块进入颈内动脉，抽出针头在穿刺处涂抹少量医用胶堵住伤口，立即打开颈总动脉恢复血流供应使血块完全被冲入颈内动脉，打开颈外动脉活结恢复颈外动脉血流供应。逐层缝合肌肉与皮肤，腹腔注射庆大霉素。大鼠回笼饲养并与实验当晚和次日晨各给药一次。取材：造模后次日末次给药后1h，将大鼠断头处死，于冰盘上迅速分离大鼠右侧脑，去除溴球与低位脑干，称重后，以生理盐水1∶9在冰水浴中匀浆制成10％脑匀浆，每个标本分装几份后，低温冰箱冻存备用。生化指标测定：取出匀浆化冻后4000rpm15min得到匀浆上清液，按照试剂盒说明书所示方法，采用发色底物法分别测定SOD活性、GSH-PX活性、CAT活性、GSH-ST活性和GSH含量。

2.结果：2.1黄连解毒汤有效部位对MCAO大鼠神经症状的影响：结果显示，除假手术组未见行为异常改变，MCAO模型组大鼠在术后6h，24h均出现偏瘫样症状，主要表现为手术对侧前肢内收，肩内旋，前肢肌张力降低，肩抗力下降。黄连解毒汤有效部位大、中、小剂量组和黄连解毒汤组对大鼠在术后6h，24h神经症状均有明显的改善作用(P＜0.01，P＜0.05＝，结果见表1。

表1  黄连解毒汤有效部位对MCAO脑梗塞大鼠神经症状的影响( X±SD)

组别	剂量(g/kg)	动物数	神经症状评分
					6h	24h
			假手术MCAO模型黄连解毒汤有效部位黄连解毒汤牛黄清心丸	--0.6100.3050.1584.01.6			10111211111212	0±0**3.58±0.672.58±1.00*2.73±1.0*2.73±0.79**2.42±1.00**2.83±1.03*	0±0**3.42±0.672.17±0.83**2.73±0.65*2.63±0.50**2.17±0.83**2.67±0.89*

注：与模型组相比：^*P＜0.05，^**P＜0.01

2.2黄连解毒汤有效部位对MCAO大鼠脑梗塞范围的影响：结果显示，术后24h，除假手术组未见脑组织异常改变外，血栓模型组、给药组大鼠均有不同程度梗塞灶，黄连解毒汤有效部位大、中、小剂量组可明显减少MCAO大鼠脑梗塞范围(P＜0.01)。结果见表2。

表2  黄连解毒汤有效部位对MCAO大鼠脑梗塞范围的影响( X±SD)

组别	剂量(g/kg)	动物数	半脑脑梗塞范围(％)	全脑脑梗塞范围(％)
					假手术MCAO模型黄连解毒汤有效部位黄连解毒汤牛黄清心丸	--0.6100.3050.1584.01.6	10121211101212	0±0**6.06±2.273.05±2.39**1.82±0.92**3.57±2.72*3.47±1.64*3.57±2.10*	0±0**2.92±1.371.50±1.11*0.88±0.40**1.73±1.28*1.75±0.82*1.79±1.07*

注：与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01

2.3黄连解毒汤有效部位对CCAO大鼠脑毛细血管通透性的影响：结果显示：模型组大鼠脑组织EB含量明显高于假手术组(p＜0.01)，黄连解毒汤有效部位中、小剂量组EB含量明显低于模型组p＜0.05；p＜0.01)。结果见表3。

表3  黄连解毒汤有效部位对双侧颈总动脉结扎大鼠脑毛细血管通透性的影响( X±SD)

组别	n	剂量(g/kg)	EB含量(μg/g wet.wt)
				假手术组模型黄连解毒汤有效部位黄连解毒汤牛黄清心丸	12121010101010	--0.6100.3050.1584.01.6	10.04±1.27**12.12±1.7811.64±1.9410.64±1.74*9.97±2.39**11.67±1.4610.06±2.11**

注：与模型组比：^*p＜0.05   ^**p＜0.01

2.4黄连解毒汤有效部位对同源血粉颈内静脉注射所致脑梗塞大鼠过氧化损伤的保护作用：结果显示造模后模型组大鼠脑匀浆中CAT活性、GSH-ST活性与Cu-ZnSOD活性显著下降著，表明清除自由基的主要活性酶类活性显著下降，抗氧化活力下降。黄连解毒汤有效部位大、中、小剂量均可提高模型动物脑匀浆CAT和GSH-PX活性；黄连解毒汤有效部位中剂量可提高模型大鼠GSH-ST活性；黄连解毒汤有效部位大、中、小剂量均能提高还原型谷胱甘肽含量；黄连解毒汤有效部位小剂量还可显著提高模型动物脑匀浆Cu-ZnSOD活性，表明黄连解毒汤有效部位对脑梗塞过氧化损伤具有明显的保护作用。结果见表4。

表4  黄连解毒汤有效部位对同源血粉颈内静脉注射所致脑梗塞大鼠过氧化损伤的保护作用( X±

                                      SD)

组别	动物数	剂量(g/kg)	CAT活性(U/mgprot)	GSH-ST活性(U/mgprot)	GSH-PX活性(U/mgprot)	GSH含量(mg/mgprot)	Cu-ZnSOD活性(NU/mgprot)
								假手术	10	-	360±1.05*	95.99±13.93*	10.37±2.46	109.97±16.37	345.72±75.23*
模型	9	-	2.58±0.97	84.93±7.59	9.83±2.09	112.38±9.05	278.13±36.55
								有效部位(大)	10	0.610	3.66±0.82*	89.13±7.80	11.65±1.43*	125.13±13.98*	292.02±30.52
有效部位(中)	9	0.305	3.75±0.43**	93.60±9.09*	12.09±2.30*	139.29±19.70**	290.84±45.06
								有效部位(小)	9	0.158	3.90±0.81**	91.55±11.09	12.48±2.73*	143.41±19.88**	324.60±35.35*
黄连解毒汤	9	4.0	3.30±1.74	92.91±22.66	14.50±4.78*	128.32±18.11*	287.30±71.10
								牛黄清心丸	10	1.6	3.42±0.66*	90.59±6.12	12.32±1.31**	l30.92±13.63**	268.54±21.98

注：与模型组比较：*p＜0.05；**p＜0.01

下列实施例均能实现上述实验例的效果。

实施例1

称取黄连4.5kg、黄芩3kg、黄柏3kg、栀子4.5kg，混合均匀，加水煎煮2次，每次加水150L，煎煮1h后，趁热过滤，合并2次滤液，静置72h，离心(4500转/min)，得沉淀I。上清液浓缩至180L，通过弱极性的AB-8型大孔吸附树脂(树脂体积为15L)进行吸附，吸附流速为2L/h；待上清液全部通过树脂柱后，用8倍树脂体积(约120L)的水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用10倍树脂体积(约150L)的50％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，洗脱流速为2L/h；收集50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到乙醇洗脱物II。将沉淀I和乙醇洗脱物II混合均匀，即得到黄连解毒汤治疗缺血性脑中风的有效部位1141g。计算本发明治疗缺血性脑中风有效部位的得率为7.61％。加入赋形剂按常规工艺制成胶囊5000粒，每粒0.25克，每日2次，每次2粒。

实施例2 片剂的制备

本发明有效部位1000g，药用淀粉400g，糊精100g，混合均匀，用适量乙醇制粒，经整粒机整粒，压片，每片0.25g，口服，每次3片，每日2次。

实施例3 颗粒剂的制备

本发明有效部位100g，药用淀粉800g，糖粉100g，混合均匀，用适量乙醇制粒，干燥、整粒、分装即得。口服，一次5g，一日两次。

实施例4 注射剂的制备

本发明有效部位20g，丙二醇20ml，聚乙二醇-400 50ml，注射用水300ml，混合，水浴加热30分钟，加苯甲醇50ml，再用注射用水加至1000ml，在超声波中处理10分钟，再水浴上加热30分钟，调PH值5.5-6.5，过滤澄明，灌封，灭菌即得。每支2ml，肌肉注射，一次2ml，一日1次。

实施例5 口服液的制备

本发明有效部位20g，制成口服液1000ml，每支10ml。口服，一次10ml，一日2次。

实施例6 滴丸的制备

本发明有效部位10g，制成滴丸200粒，每天服用2次，每次5粒。

Claims (10)

1、一种黄连解毒汤的有效部位，其特征在于该有效部位是由如下方法制成的：按9∶6∶6∶9称取黄连、黄芩、黄柏、栀子15重量份混合均匀，加水煎煮2～3次，每次加水135～165体积份，煎煮50～70min后，趁热过滤，合并各次滤液，静置60-72h，4300-4500转/min离心，得沉淀I；上清液浓缩至175-185体积份，通过弱极性的AB-8型大孔吸附树脂进行吸附，待上清液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用40～70％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到乙醇洗脱物II；将沉淀I和乙醇洗脱物II混合均匀，即得到黄连解毒汤的有效部位。

2、如权利要求1所述的有效部位，其特征在于该有效部位是由如下方法制成的：按9∶6∶6∶9称取黄连、黄芩、黄柏、栀子15重量份混合均匀，加水煎煮2次，每次加水150体积份，煎煮1h后，趁热过滤，合并2次滤液，静置72h，4500转/min离心，得沉淀I；上清液浓缩至180体积份，通过弱极性的AB-8型大孔吸附树脂，树脂体积为15L，进行吸附，吸附流速为2L/h；待上清液全部通过树脂柱后，用8倍树脂体积的水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用10倍树脂体积的50％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，洗脱流速为2L/h；收集50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到乙醇洗脱物II；将沉淀I和乙醇洗脱物II混合均匀，即得到黄连解毒汤的有效部位。

3、如权利要求1所述的有效部位，其特征在于该有效部位主要含有生物碱类、黄酮类和环烯醚萜苷类成分，其中总生物碱类成分的含量为12.5～14.5％、总黄酮类成分的含量为31.5～32.5％。

4、如权利要求1所述的有效部位，其特征在于该有效部位的HPLC测定栀子苷含量为7.5～8.5％，黄芩苷含量为9.5～10.5％；还含有0.3～0.4％藏红花酸、甾醇、三萜和其它成分。

5、如权利要求1、2、3或4所述的有效部位，其特征在于加入常规的药物赋形剂、溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂。

6、如权利要求1、2、3或4所述的有效部位，其特征在于制成临床接受的剂型。

7、如权利要求6所述的有效部位，其特征在于制成的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂、注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种。

8、如权利要求1、2、3或4所述的有效部位在制备治疗缺血性脑中风的药物中的应用。

9、一种黄连解毒汤的有效部位的制备方法，其特征在于该方法为：按9∶6∶6∶9称取黄连、黄芩、黄柏、栀子15重量份混合均匀，加水煎煮2～3次，每次加水135～165体积份，煎煮50～70min后，趁热过滤，合并各次滤液，静置60-72h，4300-4500转/min离心，得沉淀I；上清液浓缩至175-185体积份，通过弱极性的AB-8型大孔吸附树脂进行吸附，待上清液全部通过树脂柱后，用水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用40～70％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到乙醇洗脱物II；将沉淀I和乙醇洗脱物II混合均匀，即得到黄连解毒汤的有效部位。

10、如权利要求9所述的有效部位的制备方法，其特征在于该方法为：按9∶6∶6∶9称取黄连、黄芩、黄柏、栀子15重量份混合均匀，加水煎煮2次，每次加水150体积份，煎煮1h后，趁热过滤，合并2次滤液，静置72h，4500转/min离心，得沉淀I；上清液浓缩至180体积份，通过弱极性的AB-8型大孔吸附树脂，树脂体积为15L，进行吸附，吸附流速为2L/h；待上清液全部通过树脂柱后，用8倍树脂体积的水继续冲洗树脂柱，至水洗液近无色止，然后再用10倍树脂体积的50％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，洗脱流速为2L/h；收集50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到乙醇洗脱物II；将沉淀I和乙醇洗脱物II混合均匀，即得到黄连解毒汤的有效部位。