CN101822670B

CN101822670B - 小檗碱在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用

Info

Publication number: CN101822670B
Application number: CN2010101265730A
Authority: CN
Inventors: 胡振林; 张卫东; 苏娟; 柳润辉; 沈云亨; 李慧梁; 徐希科; 焦晴晴
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2010-03-17
Filing date: 2010-03-17
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2030-03-17
Also published as: CN101822670A

Abstract

本发明提供了小檗碱在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用。本发明采用小檗碱进行动物药效试验，结果显示小檗碱可抑制胶原诱导的关节炎的临床发病，明显抑制了发病严重程度和发病率。并能下调脾细胞上清液中肿瘤坏死因子α、白介素17、干扰素γ，抑制促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17的分泌，从而制备防治类风湿性关节炎药物，有较大的临床应用价值。所述药物为小檗碱作为活性成分与常规药用辅料制成的药物组合物，包括片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂。

Description

小檗碱在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药，具体涉及小檗碱在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。该病好发于手、腕、足等小关节，反复发作，呈对称分布。早期有关节红肿热痛和功能障碍，晚期关节可出现不同程度的僵硬畸形，并伴有骨和骨骼肌的萎缩，极易致残。从病理改变的角度来看，类风湿性关节炎是一种主要累及关节滑膜(以后可波及到关节软骨、骨组织、关节韧带和肌键)，其次为浆膜、心、肺及眼等结缔组织的广泛性炎症性疾病。类风湿性关节炎的全身性表现除关节病变外，还有发热、疲乏无力、心包炎、皮下结节、胸膜炎、动脉炎、周围神经病变等。但是，类风湿性关节炎至今尚无特效疗法，仍处于对炎症及后遗症的治疗。

黄连解毒汤首载于葛洪《肘后备急方》，已有一千七百年的应用历史。本方由黄连、黄芩、黄柏、栀子4味中药组成，是清热解毒的经典方剂，具有清热、泻火、解毒之功效。主治实热火毒、三焦热盛之证。现代药理研究表明黄连解毒汤具有明显的抗炎、镇痛、抗菌、抗内毒素、调节消化系统、解热、降压等多方面作用。为寻求中医药治疗类风湿性关节炎的有效方剂，本发明人经大量试验证实，黄连解毒汤有明显的抗炎及免疫作用，能较好的预防和治疗类风湿性关节炎(专利申请号：200910195341.8中药黄连解毒汤在制备防治类风湿性关节炎的药物中的应用)。同时对黄连解毒汤进行了治疗类风湿性关节炎的药效物质基础研究，揭示了一种新的药物组合物，其组成成分为小檗碱、巴马汀、药根碱、木兰花碱、黄柏碱、黄连碱、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、栀子苷、藏红花素、绿原酸(专利申请号：200910195343.7一种防治类风湿性关节炎的药物组合物)。但是黄连解毒汤13个成分的有效物质组虽然清楚，但组成太多，产业化成本太高，且其中的绿原酸被报道为许多注射剂不良反应的致敏源。

本发明人在对黄连解毒汤进一步深入的研究中发现，中药小檗碱对类风湿性关节炎有很好的治疗效果，这一发现相比所述200910195341.8和200910195343.7专利而言有积极的意义。小檗碱Berberine，又称黄连素，是一种异喹啉类生物碱，具有抗菌、抗结核、抗钩端螺旋体、抗原虫、镇静、解热、降血压、利胆等作用，未见其具有治疗类风湿性关节炎的报道。本研究发现小檗碱治疗类风湿性关节炎的作用是对小檗碱这一资源的进一步拓展，对类风湿性关节炎的防治有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究设计小檗碱在制药中的应用。

本发明提供了小檗碱在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用。

本发明采用小檗碱进行动物药效试验，结果显示小檗碱可抑制CIA(Collagen-Induced Arthritis，胶原诱导的关节炎)的临床发病，明显抑制了CIA的发病严重程度和发病率。并能下调脾细胞上清液中TNF-α(肿瘤坏死因子α)、IL-17(白介素17)、IFN-γ(干扰素γ)，抑制促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17的分泌，从而对CIA疾病具有保护作用。TNF-α和IFN-γ在RA发病机制中起着重要作用。TNF-α可直接诱导蛋白水解酶的合成，造成基质结构的破坏。实验结果也表明，小檗碱可较大程度降低脾脏细胞分泌TNF-α。用抗TNF-α疗法在治疗RA上取得了良好的效果，不但阻止了骨组织破坏而且也抑制了IL-17的产生。小檗碱对炎症的控制及对关节组织的保护可能与其降低TNF-α含量有关。

IFN-γ主要由浸润在病灶局部的CD4⁺T细胞分泌，它可以激活巨噬细胞，活化的巨噬细胞随后表达多种炎症因子，参与并加重炎症反应；IFN-γ还可诱导MIP-1α、MIP-1β和IP-10的表达，这些趋化因子参与淋巴细胞向病灶迁移的过程。本发明的实验中，小檗碱在体内明显降低了IFN-γ的水平，有可能与阻断了淋巴细胞的后继迁移有关。有研究报道，TNF-α与IFN-γ在体外共同刺激纤维原细胞和人微血管内皮细胞可协同诱导趋化因子CXCL10的产生，RA病人滑液中大量CXCL10的表达导致活化Th1细胞及自然杀伤细胞的浸润，对组织造成损伤。

在类风湿关节炎的模型中升高的IL-15可通过诱导IL-17而发挥其促炎症细胞因子的特性，IL-15可能通过环孢菌素A和类固醇敏感的途径，导致关节中的IL-17过度分泌。IL-17除了可刺激滑膜细胞释放各种炎症介质外，还可通过刺激RANKL与RANK结合，刺激骨吸收，是目前认识到的在类风湿性关节炎骨破坏病理中最重要的细胞因子之一。

因此，小檗碱对CIA有明显的疗效，可明显抑制CIA临床发病，可显著抑制IL-17的生成，降低炎性细胞因子TNF-α及IFN-γ的分泌，这是小檗碱治疗类风湿关节炎的机制。

本发明所述小檗碱在制备防治类风湿性关节炎药物为以小檗碱作为活性成分与常规药用辅料制成的药物组合物。所述药物组合物可以是片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等。

附图说明

图1小檗碱临床评分图

图中

模型组对照组

小檗碱1mg/kg小檗碱5mg/kg

小檗碱10mg/kg

图2脾细胞上清细胞因子TNF-α检测结果图；柱1：空白组柱2：模型组柱3：甲氨喋呤组柱4：小檗碱0.2mg/kg 柱5：小檗碱1mg/kg柱6：小檗碱2mg/kg *P＜0.05**P＜0.01

图3脾细胞上清细胞因子IL-17检测结果图；柱1：空白组柱2：模型组柱3：甲氨喋呤组柱4：小檗碱0.2mg/kg 柱5：小檗碱1mg/kg柱6：小檗碱2mg/kg *P＜0.05**P＜0.01

图4脾细胞上清细胞因子IFN-γ检测结果图；柱1：空白组柱2：模型组柱3：甲氨喋呤组柱4：小檗碱0.2mg/kg 柱5：小檗碱1mg/kg柱6：小檗碱2mg/kg *P＜0.05**P＜0.01

具体实施方式

实施例1小檗碱动物药效试验

一、实验材料

药物与试剂

小檗碱：购自中国药品生物制品鉴定所，以3‰的CMC-Na溶液溶解成1mg/ml的溶液。给药时按照动物体重腹腔注射不同的体积。鸡II型胶原(CII)：Chondrex，Redmond，WA 98052，USA；不完全弗氏完全佐剂(IFA)Difco Laboratories，Detroit，MI；磷酸缓冲盐溶液(PBS)：由本实验室自行配制，在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄。用盐酸调PH至7.4，加水定容至1L，过滤除菌后使用；DMSO二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)：为sigma公司产品；1640培养基：吉诺生物医药技术有限公司；小牛血清：民海生物有限公司；96孔平底板，CORNING公司；70μm细胞研磨滤网，BD Falcon公司；15ml、50ml离心管，BD Falcon公司；0.22μm滤器，Millipore公司；1ml旋口注射器，BD公司；贝朗三通，德国贝朗公司；甲氨喋呤片：上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂(080605)

动物

DBI/I型小鼠，雄性，6-8周，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2007-0005，饲养于第二军医大学实验动物中心清洁级环境中。

仪器与设备

高速台式离心机，Eppendorf；高速台式低温离心机，HITACHI公司；倒置显微镜，Nikon公司；超净台，苏净集团安泰公司制造；电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；湿度CO₂培养箱，Heraus公司；恒温水浴锅，上海国华电器有限公司。

二、实验方法

模型的建立

实验准备

完全弗氏佐剂(CFA)的制备：在不完全弗氏佐剂中加入热灭活的结核分支杆菌至终浓度4mg/ml，使用之前充分混匀。

0.01M冰乙酸制备：11.43μl冰乙酸溶于20ml去离子水中，过滤，4℃备用。

CII制备：将CII溶解于0.01M冰乙酸至终浓度4mg/ml，4℃保存。

抗原的乳化：用三通管连接两支玻璃针管，将PBS、完全弗氏佐剂和抗原CII分别加入一支针管中(每100μl乳化液含200μg CII和50μl完全弗氏佐剂)，排除针管内气泡后，来回推动针管约500次，将针管内各成分充分混匀成乳化状态。

CIA模型的诱导

第0天，小鼠尾根部2-3厘米处给予100μl/只乳化好的CII抗原皮下注射免疫；第21天，加强免疫：50μl CII和150μl PBS充分混匀，150ul/只腹腔注射；正常组用生理盐水同法注射。

三、实验分组和给药方案

小鼠随机分为6组，每组12只，分别为正常组、CIA模型组、阳性对照组(甲氨喋呤2mg/kg)、小檗碱组分为高、中、低三个剂量组，其给药量分别为10mg/kg、5mg/kg、1mg/kg。于二次免疫前一天(第20天)至第34天小檗碱组分别按10mg/kg、5mg/kg、1mg/kg连续灌胃给药，甲氨喋呤组每两天按2mg/kg给药，正常组和模型组按10ml/kg给予饮用水。

1、多发性关节炎指数(arthritis index，AI)评分

二次免疫后，定期记录小鼠全身关节病变情况，按3级评分法评价，计算发病率及平均发病指数。具体评分标准为：0分-关节正常；1分-关节轻微红肿；2分-关节红肿严重，累及整个关节，活动受限；3分-爪子或关节功能障碍，关节僵硬。四肢的总和为小鼠的评分，最高为12分。

2、淋巴及脾脏单个核细胞(MNC)悬液的制备

小鼠处死，固定，剪开腹部皮肤，取两侧腹股沟淋巴结；后打开腹腔，取出脾脏，立即放入装有1640的15ml离心管中，置于冰上；将脾脏倒入70μm的细胞研磨滤网中，用1ml注射器针芯充分研磨，使之成细胞悬液；收集细胞悬液，4℃，1000rpm，离心8min，离心后弃去上清；打散细胞，加入0.83％氯化铵水(约1.0ml/脾脏)，裂解5min；加入3倍体积的PBS终止裂解反应，并用玻璃吸管去除细胞悬液中的絮状物；4℃，1000rpm，离心8min，离心后弃去上清；打散细胞，加入1ml 1640(含小牛血清)，混匀后计数，以1640完全培养基(含小牛血清)在96孔板中培养，5×10⁶/ml每孔100ul，贴壁2小时。

3、脾细胞NO测定

在96孔平圆底板中每孔加入5×106/ml脾脏MNC100ul，每组4复孔；贴壁2小时后，换液DMEM培养基，每孔加LPS(终浓度1ug/ml)，将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养18小时后取出上清液检测NO。

4、脾、淋巴细胞增值测定

在96孔平圆底板中分别加入5×10⁶/ml脾脏及淋巴MNC100ul，每组4复孔；贴壁2小时后，加CII(100ug/ml)，将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时后取出加MTS测增值。

5、脾细胞细胞因子测定

在96孔平圆底板中加入5×10⁶/ml脾脏MNC100ul，每组4复孔；贴壁2小时后，加CII(100ug/ml)，将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时后取上清液检测细胞因子。

四、结果

1、小檗碱可抑制CIA的临床发病

在此CIA的实验中，用CII诱导CIA模型，初次免疫为第0天，第21天加强免疫后小鼠随机分为6组：对照组和三组小檗碱组。于第20天开始给，阳性对照组每两天给予甲氨喋呤药2mg/kg，小檗碱高剂量组给予10mg/kg，中剂量组为5mg/kg，低剂量组为1mg/kg，连续给药14天，直到实验结束。每天观察小鼠并依据评分标准给每只小鼠评分。

CII诱导CIA，加强免疫后小鼠陆续出现发病，对照组与用药组在发病时间上没有明显差异。发病后，模型组组小鼠疾病严重程度加重较快，在免疫后第37天达到高峰，而给药组小鼠发病后疾病发展较对照组小鼠缓和(图1)。从发病率来看，模型组为90％，对照组为73％，小檗碱高、中、低三个剂量组分别为70％，72％和73％。由此可见，小檗碱对CIA发病时间没有明显影响，但明显抑制了CIA的发病严重程度和发病率，说明小檗碱对CIA具有明显的保护作用。

2、小檗碱能下调脾细胞上清液中TNF-α、IL-17、IFN-γ

在体内给予药物治疗CIA的实验中，疾病达到平台期后处死小鼠，取出脾脏细胞，制成单细胞悬液，每孔1.5×10⁶个细胞铺板，在体外用20μg/ml的抗原CII刺激，培养48小时后收集上清，用ELISA方法测量细胞因子TNF-α、IFN-γ的浓度。

如图2、3、4所示，CII刺激后，模型组细胞上清中TNF-α、IFN-γ及IL-17均高于各个药物处理组，与阳性对照组及小檗碱组相比，存在统计学差异(p＜0.05)。说明体内给予药物治疗后，能够抑制促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17的分泌，并能从而对CIA疾病具有保护作用。

实施例2

片剂：小檗碱 20g

乳糖 177g

玉米淀粉 50g

硬脂酸镁 3g

制备方法：将小檗碱、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，小檗碱含量为20mg。

实施例3：

安瓿剂：小檗碱 10g

氯化钠 9g

制备方法：将小檗碱和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中，每支含小檗碱10mg。

实施例4：

注射用冻干粉针剂：小檗碱 10g

甘露醇 20g

制备方法：将小檗碱和甘露醇溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入西林瓶中，冻干，每支含小檗碱10mg。

Claims

1.小檗碱作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为小檗碱作为唯一活性成分与常规药用辅料制成的药物组合物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述药物组合物为片剂、胶囊剂、滴丸、颗粒剂或注射剂。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述药物组合物为分散片、含片、口崩片、缓释片、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、粉针剂或气雾剂。