CN101843618A - 小檗碱及其衍生物在制备吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，涉及小檗碱及其衍生物在制药中的新用途，具体涉及小檗碱及其衍生物在制备吲哚胺2，3-双加氧酶IDO抑制剂中的用途。本发明经IDO抑制活性检测，以及可逆抑制的判定、抑制剂类型判断及Ki值测定及半数有效抑制浓度IC50测定，结果显示，所述的小檗碱为可逆抑制剂，抑制常数Ki为8μM；所述的盐酸药根碱和盐酸巴马汀为不可逆抑制剂，半数有效抑制浓度IC₅₀分别为123μM和126μM。本发明公开的小檗碱及其衍生物作为IDO抑制剂，有广阔的应用前景，可以用于具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病，包括癌症、艾滋病、阿尔茨海默病、抑郁症、白内障等重大疾病的治疗。

Description

小檗碱及其衍生物在制备吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂中的用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及小檗碱及其衍生物在制药中的新用途，具体涉及小檗碱及其衍生物在制备吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)抑制剂中的用途。

背景技术

现有技术公开了吲哚胺2，3-双加氧酶(Indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)是一种细胞内含有亚铁血红素的酶，是肝脏以外唯一可催化色氨酸代谢使其沿犬尿氨酸途径分解生成包括喹啉酸在内的一系列代谢产物的限速酶^[1]。

IDO与很多生理病理过程有关。有关对怀孕小鼠模型的研究发现母胎界面的合胞体滋养层细胞和抗原提呈细胞可以合成IDO，并且IDO表达的动态变化与胚胎形成一致，如果特异性阻断IDO的作用，则可导致小鼠流产，表明IDO可以使胎儿免于母体的排斥，维持母胎界面免疫偏离的形成^[2]。该研究结果说明IDO与机体免疫系统的免疫耐受有关，是一种免疫调节酶。IDO与肿瘤细胞逃避机体免疫系统对其监视和杀伤的免疫逃逸现象有关。Uyttenhove等发现多种人实体肿瘤细胞(宫颈癌、胃癌、结肠癌、黑素瘤和胰腺癌等)高表达的IDO使局部T细胞增殖受抑，从而介导肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击^[3]。IDO参与调节T细胞的反应。T细胞对色氨酸耗竭特别敏感，当色氨酸浓度较低时，T细胞增殖就会静止在G1期，IDO通过降解色氨酸，可切断T细胞的活化。基于这种机制，IDO保护胎儿免受母体排斥，也介导了肿瘤免疫逃逸。

研究显示，色氨酸代谢的犬尿氨酸途径异常，通常伴随着IDO活性的提高和喹啉酸水平的上调，与神经系统炎症和神经退行性紊乱密切相关^[4]。直接和间接地证据都表明IDO和犬尿氨酸途径在阿尔茨海默病的发病机制中发挥重要作用^[5-6]。阿尔茨海默病患者血液中的色氨酸浓度与其认知缺陷的程度成负相关^[7]，血清中犬尿氨酸浓度高于正常人，而且升高的程度与认知缺陷的水平密切相关^[8-9]。阿尔茨海默病患者大脑中IDO含量比正常人丰富：IDO和喹啉酸在阿尔茨海默病患者海马体皮质层的小胶质细胞、星形细胞及神经元细胞中均有表达，在老年斑周围的小胶质细胞、星形细胞中含量最高^[10].β淀粉样多肽Aβ(1-42)能够激活原代培养的人小胶质细胞，诱导IDO的表达^[11-12]。

干扰素γ可诱导IDO的表达，在高水平干扰素γ刺激的持续活化期间，IDO降低了游离血清色氨酸的利用度。因而，也降低了5-羟色胺的产生。与诸如喹啉酸的具有神经活性的犬尿氨酸代谢物的蓄积相结合的这些变化有助于神经病学、精神病学病症的发生，而且是多种心境障碍的因素，也是具有IDO活化和色氨酸降解特征的一些慢性病相关症状的因素，所述慢性病例如获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、多种类型抑郁症、阿尔茨海默病和癌症^[13]。

IDO活性还涉及与年龄相关的核性白内障的发生。IDO是晶状体中紫外线滤器生物合成中的第一个酶，并且是限速酶。来自色氨酸降解的紫外线滤器化合物(犬尿氨酸和3-羟基犬尿氨酸葡萄苷)修饰存在于人晶状体中的蛋白质。这些紫外线滤器化合物的量随年龄而增加并且已经报道了这些紫外线滤器化合物会导致称为与年龄相关的核性白内障的晶状体逐渐浑浊^[14]。

IDO抑制剂可以治疗肿瘤。已有研究表明目前公认的IDO抑制剂1-甲基色氨酸(1-MT)在体外能增强肿瘤细胞对T细胞的免疫刺激的敏感性，在体内的动物模型中能延缓肿瘤细胞的生长并增强化疗药物的抗肿瘤效果，而且对几乎所有的自发性肿瘤起作用^[15]。IDO抑制剂可以治疗心境障碍以及其他具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病，包括：AIDS、神经退行性疾病(阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病)、抑郁症、白内障、与年龄相关的黄化以及自身免疫性疾病。

目前世界上尚无可以作为药物使用的IDO抑制剂，IDO抑制剂的研发多以有机合成为主，天然提取的工作尚少见。从中草药中分离得到的许多活性天然产物往往有比较丰富的生理功能，其中的若干活性天然产物已经广泛使用，小檗碱是其中使用最多的天然产物之一。小檗碱(berberine)又名黄连素，是中药黄连中的主要生物碱。近十年来，已经有若干文献报道了小檗碱及其衍生物临床用于治疗肿瘤、糖尿病、心血管疾病、高血脂、炎症、细菌和病毒感染等疾病，但，迄今未见有小檗碱及其衍生物在制备IDO抑制剂中的用途。

与本发明相关的现有技术有：

[1]MacKenzie，C.R.Et.al.Current Drug Metabolism，2007，8：237-244.

[2]David，H.M.；et al.，Science，1998，281：5380.

[3]Uyttenhov，C，et al.Nat Med，2003，9：1269-1274.

[4]Heyes，M.P.，et al.，Brain，1992，115：1249-1273.

[5]Guillemin，G.J.et al..Redox Rep 2002，7，199-20.

[6]Stone，T.W.，et al.，J.Alzheimers Dis.2001，3：355-66.

[7]Widner B，et al.，Adv Exp Med Biol 1999，467：133-8.

[8]Baran H，et al.，J.Neural Transm 1999，106：165-81.

[9]Widner B，et al.，J Neural Transm 2000，107：343-53.

[10]Guillemin，G.J.Et al.，Neuropathology and Applied Neurobiology 2005，31：395-404.

[11]Guillemin G.J.，et al.，Neuro Report 2003，14：2311-2315.

[12]Walker D.G.，et al.，J.Leukoc.Biol.2006，79：596-610.

[13]Schroecksnadel K.，et al.，.Clin Exp Immunol.2005，140(1)：41-45.

[14]Takikawa O，et al.，Exp Eye Res.2001，72(3)：271-7.

[15]Friberg M，et al.Int J Cancer，2002，101：151-155.

发明内容

本发明的目的是提供小檗碱及其衍生物在制药中的新用途，具体涉及小檗碱及其衍生物在制备吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)抑制剂中的用途。

本发明所述的小檗碱及其衍生物具有如下结构式：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄为-OCH₃，-OH，或-OCH₂O。

本发明中所述小檗碱及其衍生物分别为下述结构的小檗碱，药根碱和巴马汀：

本发明中，优选的小檗碱及其衍生物为小檗碱及其衍生物的盐酸盐或其他盐，其中的小檗碱及其衍生物的盐酸盐为如下结构的盐酸小檗碱，盐酸药根碱和盐酸巴马汀：

本发明经IDO抑制活性检测，以及可逆抑制的判定、抑制剂类型判断及Ki值测定及半数有效抑制浓度IC50测定，结果显示，所述的小檗碱为可逆抑制剂，抑制常数Ki为8μM；所述的盐酸药根碱和盐酸巴马汀为不可逆抑制剂，半数有效抑制浓度IC₅₀分别为123μM和126μM。

本发明所述的小檗碱及其衍生物，及其盐酸盐均为市购产品。

实验结果证实，本发明公开的小檗碱及其衍生物盐酸药根碱及盐酸巴马汀具有吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)抑制活性，可作为吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)抑制剂，用于治疗或预防具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病，包括癌症、艾滋病、阿尔茨海默病、抑郁症、白内障等重大疾病的治疗。本发明的小檗碱及其衍生物在抑制IDO介导的色氨酸代谢途径的疾病领域有者广阔的应用前景

为了便于理解，以下结合具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考。

附图说明

图1为小檗碱，盐酸药根碱，盐酸巴马汀，1-MT在100μM浓度下的IDO抑制活性。

具体实施方式

实施例1

1)IDO抑制活性检测：

反应条件：将50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，40mM维生素C，400ug/ml过氧化氢酶，20uM亚甲基蓝，底物L-色氨酸和待测样品混合，混合液37℃保温5分钟，再向上述混合液内加入IDO酶，反应在37℃下进行30分钟，加入30％(w/v)三氯乙酸200ul使反应终止，反应体系在65℃加热15分钟，使之完成从甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000rpm旋转10分钟，取上清与等体积2％(w/v)对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，犬尿氨酸与之反应产生的黄颜色可使用酶标仪在490nm观测。

测试结果表明：小檗碱，盐酸药根碱和盐酸巴马汀对IDO的抑制效力优于目前体内外实验通用的IDO抑制剂1-MT(1-甲基色氨酸，市售)。

2)是否为可逆抑制的判定：

在固定抑制剂浓度的情况下，用一系列不同浓度的酶与抑制剂反应并测定反应速度。以反应速度对酶浓度(v～[E])作图，根据曲线的特征可以判定是否是可逆抑制剂。

反应条件：在500ul的反应体系中，先加入50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，40mM维生素C，400ug/ml过氧化氢酶，20uM亚甲基蓝，300mM底物L-色氨酸或同时加入100mM抑制剂(盐酸药根碱、盐酸巴马汀、小檗碱)，混合液37℃保温5分钟，再向上述混合液内分别加入不同体积的IDO酶(对于盐酸药根碱和盐酸巴马汀，加入酶的体积分别为0.5、1、1.5、2、2.5ul；对于小檗碱，加入的酶的体积分别为5、8、10、15、20ul)，反应在37℃下进行30分钟，加入30％(w/v)三氯乙酸200ul使反应终止，反应体系在65℃加热15分钟，使之完成从甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000rpm旋转10分钟，取上清与等体积2％(w/v)对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，用酶标仪检测490nm波长读数。

测试结果表明：小檗碱是IDO的可逆抑制剂，盐酸药根碱与盐酸巴马汀是IDO的不可逆抑制剂。

3)小檗碱抑制剂类型判断及Ki值测定：

反应条件：在500ul的反应体系中，先加入50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，40mM维生素C，400ug/ml过氧化氢酶，20uM亚甲基蓝，分别加入80、150、300mM底物L-色氨酸，在一个底物浓度下，加入不同浓度的小檗碱(0.5μM，2μM，4μM，6μM，8μM)混合液37℃保温5分钟，再向上述混合液内加入10ul IDO(约20nM)，反应在37℃下进行30分钟，加入30％(w/v)三氯乙酸200ul使反应终止，反应体系在65℃加热15分钟，使之完成从甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000rpm旋转10分钟，取上清与等体积2％(w/v)对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，用酶标仪检测490nm波长读数。以Dixon作图法(1/v～[I])判定小檗碱的抑制剂类型，以S/v～[I]作图，可以得到抑制剂的Ki值。

测试结果表明：小檗碱为IDO的反竞争性抑制剂，Ki值为8μM。

4)半数有效抑制浓度IC50测定：

反应条件：将50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，40mM维生素C，400ug/ml过氧化氢酶，20uM亚甲基蓝，底物L-色氨酸150mM和抑制剂混合。抑制剂浓度选用100，200，400，600，800，1000，1200uM混合液37℃保温5分钟，再向上述混合液内加入IDO酶。反应在37℃下进行30分钟，加入30％(w/v)三氯乙酸200ul使反应终止，反应体系在65℃加热15分钟，使之完成从甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000rpm旋转10分钟，取200ul上清与等体积2％(w/v)对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，犬尿氨酸与之反应产生的黄颜色可使用酶标仪在490nm观测，所得结果利用IC50计算器计算。

表1.为小檗碱及其衍生物对IDO的IC₅₀(μM)结果。

表1.

化合物	IC50
		1-MT	380
小檗碱	9.3
		盐酸巴马汀	126
盐酸药根碱	123

Claims (5)

1.小檗碱及其衍生物在制备吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂中的用途；所述的小檗碱及其衍生物具有如下结构式：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄为-OCH₃，-OH，或-OCH₂O。

2.按权利要求1所述的用途，其中所述的小檗碱及其衍生物具有如下结构式：

3.按权利要求1或2所述的用途，其中所述的小檗碱及其衍生物为具有如下结构式的小檗碱及其衍生物的盐酸盐：

4.权利要求3所述的小檗碱及其衍生物的盐酸盐在制备治疗或预防具有吲哚胺2，3-双加氧酶介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病药物中的用途。

5.按权利要求5所述的用途，其中所述的具有吲哚胺2，3-双加氧酶介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病包括但不限于肿瘤性疾病、癌症、阿尔茨海默病、自身免疫性疾病、白内障、心境障碍、抑郁症或焦虑症。

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