CN104042594A - 蒽醌类化合物在制备抗补体药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属制药领域，涉及蒽醌类化合物在制备抗补体药物中的新用途。本发明从蓼科植物虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）根的乙酸乙酯提取部位制备蒽醌类化合物,并通过体外抗补体活性评价试验证实其对补体系统的经典途径和旁路途径具有强的抑制作用。所述化合物对补体系统经典途径抑制作用的CH50为6±2～500±25μg/ml，对旁路途径抑制作用的AP50为50±5～350±20μg/ml。所述化合物可用于制备抗补体药物。
Description
技术领域
本发明属中药制药领域，涉及蒽醌类化合物在制备抗补体药物中的新用途。
背景技术
补体系统是体内重要的免疫防御系统，参与体内多数病理生理过程。补体系统是一把双刃剑，它的正常激活对抵御外来微生物的入侵和维持机体平衡有重要作用，但补体系统的过度激活会引发系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病。目前对此类疾病尚无理想的治疗药物，因此临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。直接从天然产物中研究开发补体抑制剂的成本较低且安全性好，因此近年来从天然来源中寻找新的具有抗补体活性的药物受到人们越来越多的关注。国内外的学者已从天然产物中分离得到不少具有补体抑制作用的单体化合物，为抗补体药物的研究与开发提供了广阔的前景。
虎杖（Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.）为蓼科（Polygonaceae）蓼属（Polygonum）植物，多年生灌木状草本。虎杖的干燥根及根茎味微苦，性微寒。具祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰之功效，主要用于关节痹痛、湿热黄疸、经闭、癥瘕、咳嗽痰多、水火烫伤、跌扑损伤、痈肿疮毒等症。现代研究表明虎杖具有多种药理作用，包括保肝、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂等。临床可用于治疗肺炎、痛风、黄疸、痤疮等疾病。近年从虎杖中分离得到了一系列蒽醌、萘醌、二苯乙烯及黄酮类成分，但未见抗补体活性化合物的报道。
发明内容
本发明的目的是提供新的具有抗补体活性的物质，具体涉及蒽醌类化合物，包括化合物大黄素（1）、大黄素-8-甲醚（2）、Emodin-8-O-β-D-glucoside（3）、Fallacinol（4）、Citreorosein（5）和Xanthorin（6）。
本发明的进一步目的是提供上述蒽醌类化合物在制备抗补体药物中的用途。
本发明应用现代药理筛选方法，对植物药中的抗补体活性物质进行研究，从虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）干燥根的醇提取物的乙酸乙酯部位分离得到蒽醌类化合物,并证实这些化合物对补体系统的经典途径和旁路途径均有抑制作用。
本发明涉及的蒽醌类化合物具有下述结构通式的化学结构：
其中，R1为：OH,OCH3,Oglu;
R2为：CH3,OH,OCH3;
R3为：OH,CH3,CH2OH;
R4为：H,OH。
本发明涉及的蒽醌类化合物为：
本发明所述的蒽醌类化合物通过下述方法制备：
虎杖根粗粉16kg，以5倍量95％乙醇50°C提取3次，每次2小时。减压回收溶剂，得到浸膏950g，浸膏悬浮于蒸馏水中，以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取物400g。取乙酸乙酯萃取物200g经硅胶柱色谱，以二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、甲醇梯度洗脱，所得流分经重结晶或不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱，聚酰胺、RP-18制备色谱和SephadexLH-20纯化，分离得到化合物大黄素（1）、大黄素-8-甲醚（2）、Emodin-8-O-β-D-glucoside（3）、Fallacinol（4）、Citreorosein（5）、和Xanthorin（6）。
其中，大黄素（1）：桔红色针晶，mp.263-265°C；分子式:C15H10O5；分子量:270；核磁（DMSO-d6）：1H-NMR(400MHz)：δ7.06(1H,s,H-2),7.52(1H,s,H-4),7.15(1H,d,J=2.3Hz,H-5),6.54(1H,d,J=2.3Hz,H-7),2.41(3H,s,CH3)；13C-NMR(100MHz)：δ164.3(C-1),120.3(C-2),148.1(C-3),124(C-4),108.8(C-5),161.3(C-6),107.8(C-7),165.5(C-8),189.6(C-9),181.2(C-10),132.6(C-4a),108.7(C-8a),113.2(C-9a),134.9(C-10a),21.4(CH3)。
大黄素-8-甲醚（2）：黄色针晶，mp.300-302°C；分子式:C16H12O5；分子量:284；核磁（DMSO-d6）：1H-NMR(400MHz)：δ7.04(1H,d,J=0.8Hz,H-2),7.47(1H,d,J=0.8Hz,H-4),7.19(1H,d,J=2.3Hz,H-5),6.67(1H,d,J=2.3Hz,H-7),2.41(3H,s,CH3),3.95(3H,s,OCH3),12.37,10.38(各1H,s,OH)；13C-NMR(100MHz)：δ161.7(C-1),124.2(C-2),146.7(C-3),119.2(C-4),107(C-5),164.5(C-6),105(C-7),163.5(C-8),186.4(C-9),182.3(C-10),132(C-4a),112.7(C-8a),114.4(C-9a),136.8(C-10a),21.4(CH3),56.4(OCH3)。
Emodin-8-O-β-D-glucoside（3）：桔红色针晶，mp.192-193°C；分子式:C21H20O10；分子量:432；核磁（DMSO-d6）：δ7.09(1H,s,H-2),7.38(1H,s,H-4),7.23(1H,d,J=2.3Hz,H-5),6.97(1H,d,J=2.3Hz,H-7),2.39(3H,s,CH3),13.19(1H,s,OH)；13C-NMR(100MHz)：δ164.3(C-1),119.2(C-2),146.9(C-3),124.2(C-4),108.4(C-5),161.1(C-6),108.4(C-7),161.7(C-8),186.4(C-9),182.1(C-10),132.1(C-4a),113.2(C-8a),114.5(C-9a),136.5(C-10a),21.4(CH3),葡萄糖C1-6的δ值分别为：100.8,73.3,76.4,69.4,77.3,60.6。
Fallacinol（4）：黄色针晶，mp.232-234°C；分子式:C16H12O6；分子量:300；核磁（DMSO-d6）：1H-NMR(400MHz)：δ7.22(1H,s,H-2),7.60(1H,s,H-4),7.10(1H,d,J=2.3Hz,H-5),6.79(1H,d,J=2.3Hz,H-7),3.89(3H,s,OCH3),4.60(2H,d,J=5.5Hz,CH2),5.58(1H,t,J=5.5Hz,CH2OH),12.10,11.94(各1H,s,OH)；13C-NMR(100MHz)：δ164.4(C-1),117.2(C-2),153.2(C-3),120.9(C-4),107.7(C-5),161.6(C-6),106.6(C-7),166.2(C-8),190(C-9),181.2(C-10),132.9(C-4a),109.9(C-8a),114.4(C-9a),134.8(C-10a),56.4(OCH3),62(CH2OH)。
Citreorosein（5）：桔红色针晶，mp.286-288°C；分子式:C15H10O6；分子量:286；核磁（DMSO-d6）：1H-NMR(400MHz)：δ6.69(1H,d,J=2.4Hz,H-2),7.26(1H,d,J=2.4Hz,H-4),7.78(1H,s,H-5),7.32(1H,s,H-7),4.80(2H,d,J=5.5Hz,CH2),4.62(1H,t,J=5.5Hz,CH2OH),12.24,12.17,10.20(各1H,s,OH)；13C-NMR(100MHz)：δ165.7(C-1),107.9(C-2),161.5(C-3),108.9(C-4),120.7(C-5),152.9(C-6),117.1(C-7),164.5(C-8),189.7(C-9),181.3(C-10),135.1(C-4a),114(C-8a),108.9(C-9a),132.8(C-10a),62(CH2OH)。
Xanthorin（6）：红色针晶，mp.244-246°C；分子式:C16H12O6；分子量:300；核磁（CDCl3）：1H-NMR(400MHz)：δ6.61(1H,s,H-2),7.62(1H,s,H-5),7.04(1H,s,H-7),4.01(3H,s,OCH3),2.42(3H,s,CH3),13.60,12.79,12.26(各1H,s,OH)；13C-NMR(100MHz)：δ160.1(C-1),106.6(C-2),150.3(C-3),157.6(C-4),120.4(C-5),147.9(C-6),124.4(C-7),162.3(C-8),188.2(C-9),187(C-10),114(C-4a),112.3(C-8a),105.4(C-9a),132.8(C-10a),56.5(OCH3),22(CH3)。
上述蒽醌类化合物经体外经典途径和旁路途径抗补体活性评价试验，结果证实所述化合物对补体系统的经典途径和旁路途径有不同程度的抑制作用（见表1）。其中，Fallacinol（4）对补体系统的经典途径和旁路途径有最强的抑制作用，抑制50%溶血所需供试品浓度经典途径(CH50)为6±2μg/ml、旁路途径(AP50)为50±5μg/ml，均大大强于阳性对照肝素；大黄素（1）、Citreorosein（5）对补体系统的经典途径也有较强的抑制作用，其CH50值分别为47±3μg/ml和20±10μg/ml，均稍强于阳性对照肝素。表1是化合物1～6对补体系统经典途径（CH50）和旁路途径抑制作用（AP50）的数据。
表1蒽醌类化合物对补体系统的抑制作用
NA：无活性。
附图说明：
图1是从虎杖乙酸乙酯部位中分离化合物1-6的提取分离流程图。
具体实施方式
实施例1蒽醌类化合物的制备
虎杖根粗粉16kg，以5倍量95％乙醇50°C提取3次，每次2小时。减压回收溶剂，得到浸膏950g，浸膏悬浮于蒸馏水中，以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取物400g。取乙酸乙酯萃取物200g经硅胶柱色谱，以二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、甲醇梯度洗脱，所得流分经重结晶或不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱，聚酰胺、RP-18制备色谱和SephadexLH-20纯化，分离得到化合物大黄素（1）、大黄素-8-甲醚（2）、Emodin-8-O-β-D-glucoside（3）、Fallacinol（4）、Citreorosein（5）、和Xanthorin（6）。
具体步骤如下：
1、二氯甲烷-甲醇（40:1）洗脱所得流份，经重结晶，得到化合物1（50mg）。
2.二氯甲烷-甲醇（30:1）洗脱所得流份，以石油醚-丙酮梯度洗脱，经SephadexLH-20纯化得到化合物2（14mg）。
3.二氯甲烷-甲醇（10:1）洗脱所得流份，再经RP-18制备色谱，以甲醇-水（40:60）为洗脱剂，所得流份经SephadexLH-20纯化得化合物3（20mg）。
4.二氯甲烷-甲醇（10:1）洗脱所得流份，反复硅胶柱色谱，流份经薄层制备色谱，以氯仿-甲醇（10:1）为展开剂，得到化合物4（8mg）。
5.二氯甲烷-甲醇（10:1）洗脱所得流份，反复硅胶柱色谱，流份经薄层制备色谱，以氯仿-甲醇（10:1）为展开剂，经SephadexLH-20纯化得到化合物5（15mg）。
6.二氯甲烷-甲醇（10:1）洗脱所得流份，反复硅胶柱色谱，流份经薄层制备色谱，以氯仿-甲醇（8:1）为展开剂，得到化合物6（2mg）。
实施例2体外抗补体经典途径试验
取补体（豚鼠血清）0.1ml，加入BBS缓冲液配制成1:5溶液，用BBS对倍稀释成1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640溶液。取1:1000溶血素、2%SRBC各0.1ml，各浓度补体0.2ml溶于0.2mlBBS中，混匀，37°C水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4°C条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。同时设置全溶血组（0.1ml2%SRBC溶于0.5ml三蒸水中）。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。
取临界浓度的补体与供试品混匀，于37°C预水浴10min后，加入适量BBS、溶血素和2%SRBC。将每管37°C水浴30min后放入低温高速离心机，5000rpm、4°C条件下离心10min后分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定吸光度。同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组。将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率。以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图,计算CH50值(表1)。
实施例3体外抗补体旁路途径试验
取补体（人血清）0.2ml，加入AP稀释液配制成1:5稀释溶液，并对倍稀释成1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640溶液。取各浓度补体0.15ml、AP稀释液0.15ml及0.5%RE0.20ml，混匀，37°C水浴30min后放置入低温高速离心机，在5000rpm、4°C条件下离心10min。分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。同时设置全溶血组（0.20ml0.5%RE溶于0.3ml三蒸水中）。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为Y轴作图。选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。
取确定的临界浓度的补体与供试品混匀，于37°C预水浴10min后，加入0.2ml0.5%RE。将每管37°C水浴30min后放置入低温高速离心机，5000rpm、4°C，离心10min后分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定其吸光度。同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组。将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率。以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算AP50值(表1)。
Claims (3)
1.具有下述结构通式的蒽醌类化合物在制备抗补体药物中的用途，
其中，R1为：OH,OCH3,Oglu;
R2为：CH3,OH,OCH3;
R3为：OH,CH3,CH2OH;
R4为：H,OH。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蒽醌类化合物分别为：
3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蒽醌类化合物通过下述方法制备：虎杖根粗粉，以5倍量95％乙醇50°C提取3次，每次2小时；减压回收溶剂，得浸膏，浸膏悬浮于蒸馏水中，以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取物；取乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，以二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、甲醇梯度洗脱，所得流分经重结晶或不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱，聚酰胺、RP-18制备色谱和SephadexLH-20纯化，分离得到化合物大黄素、大黄素-8-甲醚、Emodin-8-O-β-D-glucoside、Fallacinol、Citreorosein、和Xanthorin。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140917 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |