CN105030914A - 粗壮女贞苦丁茶提取物在α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

一种利用粗壮女贞苦丁茶制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，是将自然晾干的粗壮女贞苦丁茶粉碎，取筛下物，放入醇-水混合溶液中，在搅拌状态下，水浴提取，过滤，重复提取3次，合并3次滤液，得到粗壮女贞苦丁茶提取液，低温真空浓缩，浓缩液经大孔吸附树脂D101和葡聚糖凝胶Sephadex？LH-20色谱柱分离，采用体积浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%的醇-水混合溶液分步洗脱，收集具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的组分洗脱液，低温真空浓缩，浓缩液冷冻干燥，得到粗壮女贞苦丁茶中的α-葡萄糖苷酶抑制剂。所得α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的催化活性展现出良好的抑制作用。

Description

粗壮女贞苦丁茶提取物在α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用

技术领域

本发明涉及一种利用粗壮女贞苦丁茶制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，属于天然产物加工技术领域。

背景技术

糖尿病是一组由遗传和环境因素相互作用，导致体内胰岛素分泌绝对和（或）相对不足以及周围靶组织、细胞对胰岛素敏感性降低，从而引起人体代谢紊乱，表现出“多饮、多食、多尿、体重减轻”等典型症状，进一步诱发多器官和组织的慢性损害与功能障碍，并以持续高血糖为主要生化特征的代谢综合征，其中II型糖尿病是流行主体，其患病人数约占糖尿病患者总数的90~95%。随社会经济的发展，人们饮食结构和生活方式的改变，糖尿病的发病率日益升高，逐渐演变为危害人类健康和导致死亡的又一全球性公共健康问题。因此，通过有效途径和技术，预防、控制和治疗糖尿病及其并发症已成为相关领域的研究热点。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类新型的口服降糖试剂，可通过调节小肠α-葡萄糖苷酶的活性，有效阻止糖类在小肠的消化和吸收，从而抑制血糖水平的升高，控制餐后高血糖，预防和治疗糖尿病。目前，临床治疗中使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要是阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等源于微生物发酵的物质，但这些物质对人体肠道均表现出一定程度的毒副作用。因此，从具有显著降糖功能的天然植物资源中提取安全、高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂已成为相关科研人员的研究热点。中国专利CN101156908B蕨麻提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用；中国专利CN103751269A冬凌草提取物在α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用；中国专利CN1037055℃93A种从矮生二裂叶委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，公开了从天然植物资源中制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的技术，而关于利用粗壮女贞苦丁茶制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究国内外的专利文献和非专利文献均未见有报道。

粗壮女贞苦丁茶（Ligustrumrobustum(Rxob.)Blume），为木犀科（Oleaceae）女贞属（Ligustrum）灌木粗壮女贞的干燥嫩叶，是我国一种有着悠久食用历史的传统植物代用茶，具有清热解毒、生津止渴、提神醒脑、杀菌消炎、健胃强身、祛暑利尿等功效，对人体无毒性，已被正式批准为普通食品。粗壮女贞苦丁茶中富含多种特殊结构的活性植物多酚和生物黄酮类物质，具有良好的食用价值和保健作用，是一种优良的药食同源植物资源。通过利用粗壮女贞苦丁茶开发天然、安全、高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂不仅能丰富人们对粗壮女贞苦丁茶加工利用基础理论及相关科学问题的认识，也能带来巨大的社会效益和经济效益。

本发明的目的在于提供一种利用粗壮女贞苦丁茶制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，该制备方法工艺简单，操作方便，采用传统的代用茶资源粗壮女贞苦丁茶为原料，既进一步挖掘了粗壮女贞苦丁茶对人体健康的保护作用，促进了活性植物多酚资源的综合利用，又实现了传统药食同源资源的高值转化。所得α-葡萄糖苷酶抑制剂能显著调节小肠α-葡萄糖苷酶对糖类的分解速度，有效控制餐后血糖水平的升高，对餐后高血糖症及糖尿病的控制及治疗具有优良的辅助作用。

本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。

粗壮女贞苦丁茶提取物为坡模酸、委陵菜酸、3-氧-顺式-香豆酰-委陵菜酸、3-氧-反式-香豆酰-委陵菜酸中的一种或多种。所述粗壮女贞苦丁茶提取物为以下制备方法制得：按重量份数计为：

（1）将自然晾干的粗壮女贞苦丁茶粉碎，过200~400目筛，取100份筛下物，放入体积浓度45℃~85%的醇-水混合溶液500~2000份中，在搅拌状态下，于温度35~55℃水浴提取10~24小时，过滤，重复提取3次，合并3次滤液，得到粗壮女贞苦丁茶提取液；

（2）将上述提取液在温度35~55℃、真空度0.05~0.1MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液经大孔吸附树脂D101色谱柱分离，采用体积浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%的醇-水混合溶液各200~500份分步洗脱，收集洗脱液A；

（3）将上述洗脱液A，在温度35~55℃、真空度0.05~0.1MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液经葡聚糖凝胶SephadexLH-20色谱柱分离，采用体积浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%的醇-水混合溶液各100~300份分步洗脱，收集洗脱液B；

（4）将上述洗脱液B在温度35~55℃，真空度0.05~0.1MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液再在温度-65~-45℃，真空度2~10Pa条件下冷冻干燥12~48小时，得到粗壮女贞苦丁茶提取物。

一种利用粗壮女贞苦丁茶制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法步骤如下：

（1）将自然晾干的粗壮女贞苦丁茶粉碎，过200~400目筛，取100份筛下物，放入体积浓度45℃~85%的醇-水混合溶液500~2000份中，在搅拌状态下，于温度35~55℃水浴提取10~24小时，过滤，重复提取3次，合并3次滤液，得到粗壮女贞苦丁茶提取液；

（2）将上述提取液在温度35~55℃、真空度0.05~0.1MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液经大孔吸附树脂D101色谱柱分离，采用体积浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%的醇-水混合溶液各200~500份分步洗脱，收集具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的组分洗脱液；

（3）将上述洗脱液，在温度35~55℃、真空度0.05~0.1MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液经葡聚糖凝胶SephadexLH-20色谱柱分离，采用体积浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%的醇-水混合溶液各100~300份分步洗脱，收集具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的组分洗脱液；

（4）将上述洗脱液在温度35~55℃，真空度0.05~0.1MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液再在温度-65~-45℃，真空度2~10Pa条件下冷冻干燥12~48小时，得到粗壮女贞苦丁茶中的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

所述醇-水混合溶液中的醇为乙醇和甲醇中的任一种。

性能测试

采用高效液相色谱、质谱和核磁共振的方法测定本发明产品中主要的化学成分；按照文献方法测定本发明产品对α-葡萄糖苷酶催化活性的抑制作用。所用测定方法均为常规检测手段，具体操作如下：

①高效液相色谱、质谱和核磁共振法测定粗壮女贞苦丁茶中α-葡萄糖苷酶抑制剂的主要化学成分（Zengetal.TheantioxidantactivityandactivecomponentofGnaphaliumaffineextract.FoodandChemicalToxicology,2013,58:311-317）

用甲醇配制浓度为2mg/mL的样品溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤用于高效液相色谱分析。所用色谱柱为InertsilPREP-ODS-3（4.6×250mm,5μm，日本GL-Science公司），高效液相色谱仪为Agilent1100HPLC系统。色谱条件如下：进样量20μL；洗脱液流速0.8mL/min；柱温25℃；检测波长254nm。梯度洗脱程序：0%甲醇（0min），70%甲醇（5min），80%甲醇（10min），90%甲醇（15min），100%甲醇（20min）。通过质谱及核磁共振测定高效液相色谱分析中主要化学物质的分子量及相关化学结构信息，根据分子量及核磁数据确定样品中主要含有的化学成分。

测试结论：经高效液相色谱、质谱及核磁共振分析，粗壮女贞苦丁茶中的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要含有4种活性成分，分别为坡模酸（成分1）、委陵菜酸（成分2）、3-氧-顺式-香豆酰-委陵菜酸（成分3）和3-氧-反式-香豆酰-委陵菜酸（成分4）。

②测定粗壮女贞苦丁茶中α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶催化活性的抑制作用（Lordanetal.Thea-amylaseanda-glucosidaseinhibitoryeffectsofIrishseaweedextracts.FoodChemistry,2013,141:2170-2176）

用磷酸盐缓冲液（100mM，pH6.9）配制不同浓度（0.01~0.1mg/mL）的样品溶液，取0.1mL样品溶液与0.1mL邻硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液（5mM）混合，37°C孵育5min，加入活力0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液0.2mL，37°C条件下测定反应混合物在30min内于波长405nm处的吸光度变化，根据吸光度变化计算样品对α-葡萄糖苷酶催化活性的抑制作用，抑制率按下式计算：

抑制率（%）=（1-A_样品/A_空白）×100%

测试结论：实验条件下，不同浓度（0.01~0.1mg/mL）的受试样品均对α-葡萄糖苷酶的生物催化活性具有显著的抑制作用，且随受试浓度的增加，其抑制作用明显增强，展现出较好的浓度-计量效应。测试结果说明受试样品能有效地抑制α-葡萄糖苷酶的生物催化活性。由此可知，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以用于制备抑制餐后高血糖的食品、医药产品等。

本发明及其产品具有以下优点：

（1）原料粗壮女贞苦丁茶为我国传统的代用茶资源，来源广泛，成本低廉，不仅对药食两用资源的开发具有重要意义，而且实现了活性植物多酚的高值转化，促进了农产品的精深加工利用。

（2）产品的制备工艺简单，易于操作，适合大规模生产。

（3）所得α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的催化活性展现出良好的抑制作用，能有效控制糖类的分解速度，维持餐后血糖水平，分子量低，性能稳定，安全性高。可广泛应用于食品及医药等领域，具有显著的社会效益和经济效益。

附图说明

图1为本发明实施例2中所制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的主要化学成分。

图2为本发明实施例2中所制备α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶催化活性的抑制作用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。

实施例1：

（1）将自然晾干的粗壮女贞苦丁茶粉碎，过200~400目筛，取100份筛下物，放入体积浓度50%的乙醇溶液1000份中，在搅拌状态下，于温度40^℃水浴提取12小时，过滤，重复提取3次，合并3次滤液，得到粗壮女贞苦丁茶提取液；

（2）将上述提取液在温度35℃、真空度0.08MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液经大孔吸附树脂D101色谱柱分离，采用体积浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液各300份分步洗脱，收集具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的组分洗脱液；

（3）将上述洗脱液，在温度35℃、真空度0.08MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液经葡聚糖凝胶SephadexLH-20色谱柱分离，采用体积浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液各100份分步洗脱，收集具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的组分洗脱液；

（4）将上述洗脱液在温度35℃，真空度0.08MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液再在温度-45℃，真空度6Pa条件下冷冻干燥24小时，得到粗壮女贞苦丁茶中的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

实施例2：

（1）将自然晾干的粗壮女贞苦丁茶粉碎，过200~400目筛，取100份筛下物，放入体积浓度70%的甲醇溶液2000份中，在搅拌状态下，于温度35℃水浴提取24小时，过滤，重复提取3次，合并3次滤液，得到粗壮女贞苦丁茶提取液；

（2）将上述提取液在温度45℃、真空度0.05MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液经大孔吸附树脂D101色谱柱分离，采用体积浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇溶液各500份分步洗脱，收集具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的组分洗脱液；

（3）将上述洗脱液，在温度45℃、真空度0.05MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液经葡聚糖凝胶SephadexLH-20色谱柱分离，采用体积浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇溶液各200份分步洗脱，收集具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的组分洗脱液；

（4）将上述洗脱液在温度45℃，真空度0.05MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液再在温度-65℃，真空度3Pa条件下冷冻干燥48小时，得到粗壮女贞苦丁茶中的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

我们对实施例2所制得的粗壮女贞苦丁茶中的α-葡萄糖苷酶抑制剂做了如下性能测试：

采用高效液相色谱、质谱和核磁共振的方法测定实施例2所制得产品中主要的化学成分；按照文献方法测定实施例2所制得产品对α-葡萄糖苷酶催化活性的抑制作用。所用测定方法均为常规检测手段，具体操作如下：

①高效液相色谱、质谱和核磁共振法测定实施例2所制得粗壮女贞苦丁茶中α-葡萄糖苷酶抑制剂的主要化学成分（Zengetal.TheantioxidantactivityandactivecomponentofGnaphaliumaffineextract.FoodandChemicalToxicology,2013,58:311-317）

用甲醇配制浓度为2mg/mL的样品溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤用于高效液相色谱分析。所用色谱柱为InertsilPREP-ODS-3（4.6×250mm,5μm，日本GL-Science公司），高效液相色谱仪为Agilent1100HPLC系统。色谱条件如下：进样量20μL；洗脱液流速0.8mL/min；柱温25℃；检测波长254nm。梯度洗脱程序：0%甲醇（0min），70%甲醇（5min），80%甲醇（10min），90%甲醇（15min），100%甲醇（20min）。通过质谱及核磁共振测定高效液相色谱分析中主要化学物质的分子量及相关化学结构信息，根据分子量及核磁数据确定样品中主要含有的化学成分。测试结果如图1所示，由图可知，实施例2的粗壮女贞苦丁茶中的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要含有4种活性成分，分别为坡模酸（成分1）、委陵菜酸（成分2）、3-氧-顺式-香豆酰-委陵菜酸（成分3）和3-氧-反式-香豆酰-委陵菜酸（成分4）。

②测定实施例2所制得粗壮女贞苦丁茶中α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶催化活性的抑制作用（Lordanetal.Thea-amylaseanda-glucosidaseinhibitoryeffectsofIrishseaweedextracts.FoodChemistry,2013,141:2170-2176）

用磷酸盐缓冲液（100mM，pH6.9）配制不同浓度（0.01~0.1mg/mL）的样品溶液，取0.1mL样品溶液与0.1mL邻硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液（5mM）混合，37℃孵育5min，加入活力0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液0.2mL，37℃条件下测定反应混合物在30min内于波长405nm处的吸光度变化，根据吸光度变化计算样品对α-葡萄糖苷酶催化活性的抑制作用，抑制率按下式计算：

抑制率（%）=（1-A_样品/A_空白）×100%

测试结果如图2所示，由图可知，不同浓度（0.01~0.1mg/mL）的受试样品均对α-葡萄糖苷酶的生物催化活性具有显著的抑制作用，且随受试浓度的增加，其抑制作用明显增强，展现出较好的浓度-计量效应。测试结果说明，粗壮女贞苦丁茶中的α-葡萄糖苷酶抑制剂能有效地抑制α-葡萄糖苷酶的生物催化活性。

同样的，我们对实施例1所制得粗壮女贞苦丁茶中α-葡萄糖苷酶抑制剂也作了与实施例2相同的性能测试，其测试结果与实施例2性能测试结果并无明显差别，故在此不作敷述。

Claims (8)

1.一种粗壮女贞苦丁茶提取物在α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。

2.根据权利要求1所述的粗壮女贞苦丁茶提取物在α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用，其特征在于：所述粗壮女贞苦丁茶提取物为坡模酸、委陵菜酸、3-氧-顺式-香豆酰-委陵菜酸、3-氧-反式-香豆酰-委陵菜酸中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的粗壮女贞苦丁茶提取物在α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用，其特征在于：所述的粗壮女贞苦丁茶提取物为以下制备方法制得：按重量份数计为：

（1）将自然晾干的粗壮女贞苦丁茶粉碎，过200~400目筛，取100份筛下物，放入体积浓度45℃~85%的醇-水混合溶液500~2000份中，在搅拌状态下，于温度35~55℃水浴提取10~24小时，过滤，重复提取3次，合并3次滤液，得到粗壮女贞苦丁茶提取液；

（2）将上述提取液在温度35~55℃、真空度0.05~0.1MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液经大孔吸附树脂D101色谱柱分离，采用体积浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%的醇-水混合溶液各200~500份分步洗脱，收集洗脱液A；

（3）将上述洗脱液A，在温度35~55℃、真空度0.05~0.1MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液经葡聚糖凝胶SephadexLH-20色谱柱分离，采用体积浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%的醇-水混合溶液各100~300份分步洗脱，收集洗脱液B；

（4）将上述洗脱液B在温度35~55℃，真空度0.05~0.1MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液再在温度-65~-45℃，真空度2~10Pa条件下冷冻干燥12~48小时，得到粗壮女贞苦丁茶提取物。

4.如权利要求3所述粗壮女贞苦丁茶提取物在α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用，其特征在于醇-水混合溶液中的醇为乙醇和甲醇中的任一种。

5.一种利用粗壮女贞苦丁茶制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：按重量份数计为：

（1）将自然晾干的粗壮女贞苦丁茶粉碎，过200~400目筛，取100份筛下物，放入体积浓度45℃~85%的甲醇或乙醇与水的混合溶液500~2000份中，在搅拌状态下，于温度35~55℃水浴提取10~24小时，过滤，重复提取3次，合并3次滤液，得到粗壮女贞苦丁茶提取液；

（2）将上述提取液在温度35~55℃、真空度0.05~0.1MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液经大孔吸附树脂D101色谱柱分离，采用体积浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%的醇-水混合溶液各200~500份分步洗脱，收集洗脱液A；

（3）将上述洗脱液A，在温度35~55℃、真空度0.05~0.1MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液经葡聚糖凝胶SephadexLH-20色谱柱分离，采用体积浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇或乙醇与水的混合溶液各100~300份分步洗脱，收集洗脱液B；

（4）将上述洗脱液B在温度35~55℃，真空度0.05~0.1MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液再在温度-65~-45℃，真空度2~10Pa条件下冷冻干燥12~48小时，得到粗壮女贞苦丁茶中的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

6.根据权利要求5所述利用粗壮女贞苦丁茶制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于：所述粗壮女贞苦丁茶提取物为坡模酸、委陵菜酸、3-氧-顺式-香豆酰-委陵菜酸、和3-氧-反式-香豆酰-委陵菜酸中。

7.如权利要求5所述利用粗壮女贞苦丁茶制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法制得的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

8.如权利要求7所述α-葡萄糖苷酶抑制剂在制备抑制餐后高血糖的食品、医药产品中的应用。