CN116818918B - 粗壮女贞的指纹图谱构建方法与高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法及其应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明提供了一种粗壮女贞的指纹图谱构建方法，包括如下步骤：取紫茎女贞苷B、紫茎女贞苷C、粗壮女贞苷N、毛蕊花糖苷和异类叶升麻苷对照品，制备混合对照品溶液；取粗壮女贞样品，与质量分数为45％～55％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液，制备供试品溶液；将混合对照品溶液与供试品溶液分别进行超高效液相色谱测定。本发明还提供了一种粗壮女贞的高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法，包括如下步骤：取粗壮女贞样品，与质量分数为45％～55％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液，制备供试品溶液；将供试品溶液进行超高效液相色谱与质谱联用测定。本发明提供的方法获得的信息全面、稳定、分离效果好且专属性强。
Description
技术领域
本发明涉及中药鉴别和药物成分基础研究领域，特别是涉及一种粗壮女贞的指纹图谱构建方法与高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法及其应用。
背景技术
苦丁茶在中国是仅次于茶叶的一大类传统代茶饮料的植物的总称，已有2000年以上的饮用和药用历史，誉为“益寿茶”、“减肥茶”和“绿色金子”。其中以粗壮女贞(Ligustrumrobustum subsp.chinense P.S.Green)为代表的木樨科苦丁茶和以苦丁茶冬青(Ilexkudingcha C.J.Tseng)为代表的冬青科苦丁茶已得到大规模的种植和生产化，产生了较大的经济价值和社会收益，开发前景较好。然而目前苦丁茶的市场应用具有盲目性，缺乏统一的质量控制体系，亟需针对市场主流品种苦丁茶建立系统的质量控制研究，以推动其基源的规范化应用和阐明其药效物质基础。
粗壮女贞为木樨科女贞属植物粗壮女贞(Ligustrum robustum subsp.chinenseP.S.Green)的成熟叶，在中国四川、贵州和云南等西南地区被广泛用作苦丁茶，是一种传统的药食同源民族药。研究表明苯丙素苷类成分是粗壮女贞的主要药效活性物质。现代药理学证明，粗壮女贞的苯丙素苷类成分具有降酶保肝、抗甲型H1N1流感、抑制甘油三酯合成和促进胆固醇分解代谢、抗氧化应激、抗肿瘤和抗炎等生理活性作用，是一种具有良好开发潜力的药材。2020年版《中国药典》未收录粗壮女贞品种，且现行的四川省和贵州省中药材标准的质量控制项仅限于显微和薄层鉴别，缺乏能够体现药材内在品质的含量测定指标。近年来，粗壮女贞的研究主要集中在营养评价、化学成分分离纯化和药理活性等方面，但对其整体成分基础却未见系统性报道。
指纹图谱技术是一种常用于表征中药化学成分整体性的质量评价方法，且可以应用于基源鉴别的质量控制，已被国内外广泛认可。然而，目前关于粗壮女贞指纹图谱的研究很少，且已有的指纹图谱研究分离度和不对成度较差，整体谱图质量效果不高，难重现。
发明内容
基于此，本发明提供了一种粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其获得的信息全面、稳定、分离效果好且专属性强，为粗壮女贞药材的质量控制提供了快速、有效的评价手段。
本发明通过如下技术方案实现。
一种粗壮女贞的指纹图谱构建方法，包括如下步骤：
取紫茎女贞苷B、紫茎女贞苷C、粗壮女贞苷N、毛蕊花糖苷和异类叶升麻苷对照品，制备混合对照品溶液；
取粗壮女贞样品，与质量分数为45％～55％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液，制备供试品溶液；
将所述混合对照品溶液与所述供试品溶液分别进行超高效液相色谱测定；
其中，所述超高效液相色谱采用的条件包括：流动相A为甲醇，流动相B为体积分数为0.15％～0.25％的磷酸水溶液。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱采用的条件包括：采用梯度洗脱方式；所述梯度洗脱方式为：0min～10min，流动相A的体积百分数为30％；10min～26min，流动相A的体积百分数从30％变化至36％；26min～33min，流动相A的体积百分数从36％变化至41％；33min～37min，流动相A的体积百分数从41％变化至48％；37min～40min，流动相A的体积百分数从48％变化至52％；40min～45min，流动相A的体积百分数从52％变化至62％；45min～63min，流动相A的体积百分数从62％变化至65％。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱采用的流速为0.20mL/min～0.30mL/min。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱采用的柱温为25℃～35℃。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱采用的检测波长为326nm±10nm。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱采用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
在其中一个实施例中，所述十八烷基硅烷键合硅胶柱的尺寸包括：柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm。
在其中一个实施例中，制备对照品溶液包括如下步骤：
将紫茎女贞苷B、紫茎女贞苷C、粗壮女贞苷N、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷对照品与甲醇混合。
在其中一个实施例中，超声提取的条件包括：功率为400W～450W；时间为15min～45min。
本发明还提供一种如上所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法所构建获得的指纹图谱在鉴别粗壮女贞与苦丁茶冬青中的应用。
本发明还提供一种粗壮女贞的高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法，包括如下步骤：
取粗壮女贞样品，与质量分数为45％～55％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液，制备供试品溶液；
将所述供试品溶液进行超高效液相色谱与质谱联用测定；
其中，所述超高效液相色谱采用的条件与如上所述的超高效液相色谱采用的条件一致。
在其中一个实施例中，所述质谱采用正离子模式和/或负离子模式；
所述正离子模式中，离子源为加热电喷雾离子源，喷雾电压为+3kV，辅助气加热器温度为350℃，毛细管温度为350℃，鞘气流速为35arb，辅助气流速为12arb；一级质谱采用全扫描模式，分辨率为70000，自动增益控制目标为1e6，离子的采集范围为120m/z～1000m/z；二级质谱采用数据依赖扫描模式，分辨率为17500，自动增益控制目标为5e4；碰撞解离方式为碰撞诱导解离，二级碰撞能量为+40eV；
所述负离子模式中，离子源为加热电喷雾离子源，喷雾电压为-3.2kV，辅助气加热器温度为350℃，毛细管温度为350℃，鞘气流速为35arb，辅助气流速为12arb；一级质谱采用全扫描模式，分辨率为70000，自动增益控制目标为1e6，离子的采集范围为120m/z～1000m/z；二级质谱采用数据依赖扫描模式，分辨率为17500，自动增益控制目标为5e4；碰撞解离方式为碰撞诱导解离，二级碰撞能量为-20eV。
与现有技术相比较，本发明所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法具有如下有益效果：
本发明所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法采用超高效液相色谱技术，限定提取溶剂为45％～55％的甲醇、提取方法为超声提取，并限定流动相为甲醇与体积分数为0.15％～0.25％的磷酸水溶液，最终所获得的图谱分离效果好，所有主峰均处于基线分离状态，纯度高，且能够充分反映绝大部分活性成分的化学信息，展示了粗壮女贞药材的化学成分特征，可以直接应用于粗壮女贞药材的定性和定量控制。
附图说明
图1为本发明实施例提供的粗壮女贞指纹图谱190nm～400nm全波长扫描图；
图2为本发明实施例提供的有机相组成考察对比图谱；
图3为本发明实施例提供的水相组成考察对比图谱；
图4为本发明实施例提供的柱温考察对比图谱；
图5为本发明实施例提供的流速考察对比图谱；
图6为本发明实施例提供的粗壮女贞的指纹图谱构建方法的专属性考察图；其中，1代表毛蕊花糖苷，2代表异类叶升麻苷，3代表粗壮女贞苷N，4代表紫茎女贞苷B，5代表紫茎女贞苷C；
图7为本发明实施例提供的24批粗壮女贞的指纹图谱叠加图；
图8为本发明实施例提供的粗壮女贞药材的对照指纹图谱；其中，2代表毛蕊花糖苷，4代表异类叶升麻苷，7代表粗壮女贞苷N，11代表紫茎女贞苷B；
图9为本发明实施例提供的粗壮女贞与苦丁茶冬青药材的指纹图谱对比；
图10为本发明实施例提供的粗壮女贞总离子流图；其中，A代表正离子模式，B代表负离子模式；
图11为本发明实施例提供的紫茎女贞苷B的MS2图；其中，A代表正离子模式，B代表负离子模式；
图12为本发明实施例提供的紫茎女贞苷B的裂解规律图；其中，A代表正离子模式，B代表负离子模式；
图13为本发明实施例提供的粗壮女贞苷N的MS2图；其中，A代表正离子模式，B代表负离子模式；
图14为本发明实施例提供的粗壮女贞苷N的裂解规律图；其中，A代表正离子模式，B代表负离子模式；
图15为本发明实施例提供的紫茎女贞苷C的MS2图；其中，A代表正离子模式，B代表负离子模式；
图16为本发明实施例提供的紫茎女贞苷C的裂解规律图；其中，A代表正离子模式，B代表负离子模式。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种粗壮女贞的指纹图谱构建方法，包括如下步骤：
取紫茎女贞苷B、紫茎女贞苷C、粗壮女贞苷N、毛蕊花糖苷和异类叶升麻苷对照品，制备混合对照品溶液；
取粗壮女贞样品，与质量分数为45％～55％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液，制备供试品溶液；
将混合对照品溶液与供试品溶液分别进行超高效液相色谱测定；
其中，超高效液相色谱采用的条件包括：流动相A为甲醇，流动相B为体积分数为0.15％～0.25％的磷酸水溶液。
可以理解地，在本发明中，磷酸水溶液中，磷酸的体积分数包括但不限于0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％、0.20％、0.21％、0.22％、0.23％、0.24％与0.25％。
在一个具体的示例中，超高效液相色谱采用的条件包括：采用梯度洗脱方式；梯度洗脱方式为：0min～10min，流动相A的体积百分数为30％；10min～26min，流动相A的体积百分数从30％变化至36％；26min～33min，流动相A的体积百分数从36％变化至41％；33min～37min，流动相A的体积百分数从41％变化至48％；37min～40min，流动相A的体积百分数从48％变化至52％；40min～45min，流动相A的体积百分数从52％变化至62％；45min～63min，流动相A的体积百分数从62％变化至65％，如表1所示。
表1
在一个具体的示例中，超高效液相色谱采用的流速为0.20mL/min～0.30mL/min。
可以理解地，在本发明中，超高效液相色谱测定的流速包括但不限于0.20mL/min、0.21mL/min、0.22mL/min、0.23mL/min、0.24mL/min、0.25mL/min、0.26mL/min、0.27mL/min、0.28mL/min、0.29mL/min与0.30mL/min。
在一个具体的示例中，超高效液相色谱采用的柱温为25℃～35℃。
可以理解地，在本发明中，超高效液相色谱测定的柱温包括但不限于25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃与35℃。
在一个具体的示例中，超高效液相色谱采用的检测波长为326nm±10nm。
在一个具体的示例中，超高效液相色谱采用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
在一个具体的示例中，十八烷基硅烷键合硅胶柱的尺寸包括：柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm。
更具体地，超高效液相色谱测定采用的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱。
在一个具体的示例中，超高效液相色谱测定的进样体积为0.8μL～1.2μL。更具体地，超高效液相色谱测定的进样体积为1μL。
在一个具体的示例中，制备对照品溶液包括如下步骤：
将紫茎女贞苷B、紫茎女贞苷C、粗壮女贞苷N、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷对照品与甲醇混合。
更具体地，制备对照品溶液包括如下步骤：
取紫茎女贞苷B、紫茎女贞苷C、粗壮女贞苷N、毛蕊花糖苷和异类叶升麻苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL各含0.1mg对照品的混合溶液。
在一个具体的示例中，制备供试品溶液包括如下步骤：
精密称取样品，过5号筛，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇，称定重量，超声提取，放置室温，再称定重量，用相应的提取溶剂补足减失的质量，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，制备供试样品溶液。
在一个具体的示例中，超声提取的条件包括：功率为400W～450W；时间为15min～45min。
可以理解地，在本发明中，超声提取的功率包括但不限于400W、410W、420W、430W、440W与450W。
可以理解地，在本发明中，超声提取的时间包括但不限于15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min、40min与45min。
本发明还提供一种上述粗壮女贞的指纹图谱构建方法所构建获得的指纹图谱在鉴别粗壮女贞与苦丁茶冬青中的应用。
本发明还提供一种粗壮女贞的高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法，包括如下步骤：
取粗壮女贞样品，与质量分数为45％～55％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液，制备供试品溶液；
将供试品溶液进行超高效液相色谱与质谱联用测定；
其中，超高效液相色谱采用的条件与上述超高效液相色谱采用的条件一致。
在一个具体的示例中，质谱采用正离子模式和/或负离子模式；
正离子模式中，离子源为加热电喷雾离子源，喷雾电压为+3kV，辅助气加热器温度为350℃，毛细管温度为350℃，鞘气流速为35arb，辅助气流速为12arb；一级质谱采用全扫描模式，分辨率为70000，自动增益控制目标为1e6，离子的采集范围为120m/z～1000m/z；二级质谱采用数据依赖扫描模式，分辨率为17500，自动增益控制目标为5e4；碰撞解离方式为碰撞诱导解离，二级碰撞能量为+40eV；
负离子模式中，离子源为加热电喷雾离子源，喷雾电压为-3.2kV，辅助气加热器温度为350℃，毛细管温度为350℃，鞘气流速为35arb，辅助气流速为12arb；一级质谱采用全扫描模式，分辨率为70000，自动增益控制目标为1e6，离子的采集范围为120m/z～1000m/z；二级质谱采用数据依赖扫描模式，分辨率为17500，自动增益控制目标为5e4；碰撞解离方式为碰撞诱导解离，二级碰撞能量为-20eV。
以下结合具体实施例对本发明的粗壮女贞的指纹图谱构建方法做进一步详细的说明。以下实施例中所用的原料，如无特别说明，均为市售产品。
实施例1
本实施例提供一种粗壮女贞的指纹图谱构建方法，具体如下：
一、仪器与试剂
1.1仪器
UPLC-Q-Exactive Orbitrap-HRMS型高分辨液质联用仪和Vanquish型超高效液相色谱仪(DAD检测器)，美国Thermo Fisher Scientific公司；Agilent 1290 Infinity型超高效液相色谱仪(DAD检测器)，美国Agilent Technologies公司等。Waters ACQUITY UPLCBEH C18(2.1mm×150mm，1.7μm)色谱柱；ME204E型万分之一分析天平，梅特勒-托利多公司；XP26型百万分之一分析天平，梅特勒-托利多公司；KQ500D型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q Direct型超纯水系统，默克股份有限公司。
1.2试剂
甲醇(分析纯)，天津市富宇精细化工有限公司；磷酸(色谱纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇(色谱纯)，默克股份有限公司。
1.3试药
紫茎女贞苷B对照品(成都德思特生物技术有限公司，HPLC≥95.14％，批号：DST201119-094)；粗壮女贞苷N对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，HPLC≥95％，批号：wkq21020303)；毛蕊花糖苷对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，HPLC≥95.20％，批号：111530-201914)；异类叶升麻苷对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司，HPLC≥98％，批号：5120)和紫茎女贞苷C(成都德思特生物技术有限公司，HPLC≥92.29％，批号：DST201201-095)。24批苦丁茶(粗壮女贞)药材经广东一方制药有限公司罗文汇主任中药师鉴定为木樨科植物粗壮女贞Ligustrum robustum subsp.chinense P.S.Green的干燥叶，6批苦丁茶(苦丁茶冬青)鉴定为冬青科植物苦丁茶冬青Ilex kudingcha C.J.Tseng的干燥叶。产地及批次见表2。
表2
二、实验过程
2.1、色谱条件
采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×150mm，1.7μm)色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.25mL；柱温为30℃；检测波长为326nm。理论塔板数按毛蕊花糖苷峰计算不低于5000。
表3
2.2、对照品溶液的配制
取紫茎女贞苷B、紫茎女贞苷C、粗壮女贞苷N、毛蕊花糖苷和异类叶升麻苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL各含0.1mg对照品的混合溶液。
2.3、供试品溶液的制备
精密称取样品(过5号筛)0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50mL，称定重量。超声提取(功率450W，频率50kHz)30min，放置室温，再称定重量，用提取溶剂补足减失的质量。用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试样品溶液。
2.4、最佳吸收波长考察
在190-400nm范围内采用光电二极管阵列检测器(DAD)对粗壮女贞指纹图谱供试品溶液进行全波长扫描，确定其最大吸收为最佳波长。
2.5、流动相的考察
以色谱峰的个数、分离度和峰型(不对称度)为指纹图谱质量判定指标，按照2.3项的供试品制备及2.1项的色谱条件考察甲醇-0.2％磷酸体系，和按以下的优化色谱条件考察乙腈-0.2％磷酸体系的分离效果，确定最佳的有机相。在确定甲醇为最佳有机相的基础上，进一步考察甲醇-0.1/0.2％磷酸，甲醇-0.1/0.2％甲酸和甲醇-0.1/0.2％乙酸的分离效果，确定最佳的水相比例。
优化后的乙腈-0.2％磷酸体系的色谱条件为，流动相0.2％磷酸(A)：乙腈(B)，柱温30℃，流速0.25mL/min，UV检测波长326nm，进样1μL。洗脱梯度为0-10min，15％(B)；10-26min，15-21％(B)；26-33min，21-26％(B)；33-37min，26-33％(B)；37-40min，33-37％(B)；40-45min，37-47％(B)；45-63min，47-50％(B)；63-68min，50-90％(B)；68-73min，90-90％(B)；73-75min，90-15％(B)。后平衡10min。
2.6、柱温的考察
以色谱峰的个数、分离度和峰型(不对称度)为指纹图谱质量判定指标，按照2.3项的供试品制备及2.1项的色谱条件考察柱温25、30和35℃的分离效果，确定最佳分析柱温。
2.7、流速的考察
以色谱峰的个数、分离度和峰型(不对称度)为指纹图谱质量判定指标，按照2.3项的供试品制备及2.1项的液相色谱条件考察流速0.20、0.25和0.30min/mL的分离效果，确定最佳分析柱温。
三、粗壮女贞指纹图谱色谱条件开发及优化
3.1、最佳吸收波长的确定
在优化提取方式和洗脱梯度的基础上，对粗壮女贞供试品溶液进行190-400nm全波长扫描，并提取210、260和326nm特征波长进行对比分析。结果表明，其供试品在326nm处的色谱峰容量较大，响应较高(主峰峰面积>2)，峰型对称(不对称度在0.995-1.02之间)和峰纯度较好，明显优于其他吸收波长，如图1所示。因此，指纹图谱的最佳吸收波长确定为326nm。
3.2、最佳流动相的确定
基于高分辨质谱成分基础结果表明，粗壮女贞的苯丙素苷类和单萜苷类等主要活性成分多以同分异构体和顺反异构体的形式存在。乙腈有机相体系具有较强的洗脱能力，不利于极性相似的同分异构体化合物的洗脱分离。其指纹图谱在甲醇-0.2％磷酸体系下的分离效果最好，主要的活性化合物均处于基线分离状态，不存在杂峰干扰的情况，甲醇有机相洗脱体系最佳，如图2所示。此外，粗壮女贞所含的苯丙素苷类、单萜苷类和黄酮苷类活性成分均含有较多酚羟基，采用在流动相中添加适量的酸可以抑制化合物电离，改善峰型和防止拖尾现象。在确定甲醇为有机相的基础上，本试验进一步系统考察了甲醇-0.1％磷酸、0.2％磷酸、0.1％甲酸、0.2％甲酸、0.1％乙酸和0.2％乙酸对指纹图谱分离效果的影响，如图3所示。结果表明，磷酸、甲酸和乙酸的种类和浓度对指纹图谱分离效果影响不明显，6种酸体系下的指纹图谱绝大部分峰拖尾因子均在0.98-1.12之间，峰型对称和分离度均较好。其中甲醇-0.2％磷酸体系的指纹图谱分离度最好和出峰时间适中，因此定为最佳的流动相组成。
3.3、最佳柱温的确定
色谱分析过程是靠流动相中的样品和固定相的结合-分离差异达到分离物质的作用，而柱温会显著影响该结合分离过程，从而影响色谱分析效果。高柱温可以加快分析速率和降低流动相的黏度，但会导致分辨率降低和化合物的分离度较差。低柱温可以提高分析的分辨率获得最好的分离度，但也会导致分离时间延长和流动相的黏度增大，进一步导致柱压升高和泵的磨损。结果表明，柱温越高，出峰时间越前，但化合物的分离度降低，不利于粗壮女贞中极性相似的同分异构体分离，如图4所示。柱温25℃和30℃的主峰分离度无明显差异，均处于基线分离且峰型尖锐对称，但30℃的出峰时间较短，有利于保护色谱分析系统，为最佳柱温。
3.4、最佳流速的确定
流速主要影响指纹图谱的出峰时间和分离度。高流速可以缩短分析时间，但可能会导致目标化合物的分离度较差。低流速分析通常可以获得较好的分离度，但分析时间较长且增大洗脱溶剂的消耗。结果表明，0.30mL/min流速出峰时间较快，但部分主峰不能达到基线分离，存在影响峰纯度的小杂包。0.20mL/min流速化合物总体分离度最好，但出峰时间很慢，影响分析效率。0.25mL/min流速出峰时间适中，所有主峰均达到基线分离且稳定性较好，为最佳的流速，如图5所示。
四、方法学考察
4.1、专属性考察
取S1批次苦丁茶(粗壮女贞)样品按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液、“2.2”项下的混合对照品溶液与空白溶剂各1μL，按“2.1”项色谱条件进样分析，结果如图6所示。结果表明，供试品与对照品在相应的保留时间处有相同的色谱峰，且空白溶剂无干扰，说明建立的方法专属性良好。
4.2、精密度考察
取同一批苦丁茶(粗壮女贞)样品(S1)，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件重复进样测定6次，以毛蕊花糖苷峰和紫茎女贞苷B为参照峰(S)，计算16个共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果表明，16个共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3％，说明仪器精密度良好。
4.3、重现性考察
取同一批苦丁茶(粗壮女贞)样品(S1)，按照“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件重复进样测定6次，以毛蕊花糖苷峰和紫茎女贞苷B为参照峰(S)，计算16个共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果表明，16个共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3％，表明建立的方法重现性良好。
4.4、稳定性考察
取同一批苦丁茶(粗壮女贞)样品(S1)，按“2.1”项色谱条件，分别于0，2，4，6，8，12和24h进样，以毛蕊花糖苷峰和紫茎女贞苷B为参照峰(S)，计算16个共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果表明，16个共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3％，表明供试品在24h内稳定。
4.5、中间精密度考察
由不同的分析人员在不同实验室和不同品牌的仪器上操作。取同一批苦丁茶(粗壮女贞)样品(S1)，按照“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件重复进样测定6次，以毛蕊花糖苷峰和紫茎女贞苷B为参照峰(S)，计算16个共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果表明，16个共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3％，表明建立的方法能在不同设备和实验室等不同条件下重现，中间精密度良好。
上述方法学考察结果如表4所示。
表4苦丁茶(粗壮女贞)指纹图谱方法学考察的相对保留时间和相对峰面积RSD(％)
注：峰1，3-10的参照峰(S)为峰2(毛蕊花糖苷)，峰12-16的参照峰(S)为紫茎女贞苷B(峰11)。
五、耐用性考察
5.1、不同批次色谱柱考察
取同一份苦丁茶(粗壮女贞)样品(S1)，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件对3个不同批次的色谱柱分别进样测定，以毛蕊花糖苷峰和紫茎女贞苷B为参照峰(S)，计算16个共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果表明，16个共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3％，表明建立的方法能在不同批次色谱柱间稳定重现。
5.2、柱温波动耐用性考察
取同一份苦丁茶(粗壮女贞)样品(S1)，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件的基础上分别改变柱温为28、30和32℃进样分析，以毛蕊花糖苷峰和紫茎女贞苷B为参照峰(S)，计算16个共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果表明，16个共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD范围分别为0.065-2.133％和0.130-2.963％，均小于3％，表明建立的方法耐用性较好，柱温较小的波动能满足系统适用性要求。
5.3、流速波动耐用性考察
取同一份苦丁茶(粗壮女贞)样品(S1)，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件的基础上分别改变流速为0.23、0.25和0.27mL/min进样分析，以毛蕊花糖苷峰和紫茎女贞苷B为参照峰(S)，计算16个共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果表明，16个共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD范围分别为0.209-2.893％和0.176-2.906％，均小于3％，表明建立的方法耐用性较好，流速较小的波动能满足系统适用性要求。
六、指纹图谱的建立
6.1、指纹图谱共有模式的建立
取24批苦丁茶(粗壮女贞)药材，按“2.1”项下色谱条件与“2.3”项下确定的供试品溶液制备方法进样测定，得到苦丁茶(粗壮女贞)指纹图谱，如图7所示。指纹图谱的主峰均达到基线分离(分离度>1.5)，峰型对称(不对称度0.98-1.15)和响应值较高，总体的分离效果较好。使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》按平均数法生成对照图谱，建立苦丁茶(粗壮女贞)药材的对照指纹图谱，如图8所示。对24批苦丁茶(粗壮女贞)药材进行共有峰标识，确定16个共有峰作为苦丁茶(粗壮女贞)药材指纹图谱的特征峰。由图8可得，16个共有峰包含了指纹图谱的所有主峰信息，具有分析的代表性，其中峰2,4,7,11分别经对照品确认为毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷、粗壮女贞苷N和紫茎女贞苷B。
6.2、指纹图谱测定结果
对24批苦丁茶(粗壮女贞)药材指纹图谱进行分析，以特征性苯丙素苷类紫茎女贞苷B为参照峰S，计算各共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，实验结果见表5和表6。结合建立的指纹图谱分析，3个产地苦丁茶(粗壮女贞)的成分种类基本一致，主要表现为部分成分的含量差异。
表5
注：峰11为紫茎女贞苷B，相对保留时间为各共有峰保留时间和紫茎女贞苷B保留时间之比。
表6
注：峰11为紫茎女贞苷B，相对峰面积为各共有峰峰面积和紫茎女贞苷B峰面积的百分比(％)。
6.3、不同基原的鉴别
本发明建立的苦丁茶(粗壮女贞)指纹图谱能够明显区分于苦丁茶的另一个主流品种苦丁茶冬青，可以应用于苦丁茶(粗壮女贞)基源鉴别的质量控制，避免基源误用的情况，如图9所示。木樨科苦丁茶(粗壮女贞)药材的指纹图谱应包含16个共有特征峰，而冬青科苦丁茶(苦丁茶冬青)所含活性成分为咖啡酰奎宁酸及其衍生物，其指纹图谱不具备上述的16个特征峰。
七、UPLC-Q-Exactive Orbitrap-HRMS方法与结果
7.1、液相色谱条件
采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×150mm，1.7μm)色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表7中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.25mL；柱温为30℃；检测波长为326nm。理论塔板数按毛蕊花糖苷峰计算不低于5000。
表7
7.2、质谱条件
正离子模式质谱参数为：质谱分析采用加热电喷雾离子源(HESI)，离子源主要参数：Spray voltage为+3kV，Aux gas heater temperature为350℃，Capillarytemperature为350℃，Sheath gas flow rate为35arb，Aux gas flow rate为12arb。一级质谱采用全扫描模式，Resolution为70000，AGC target 1e6，离子的采集范围为120-1000m/z。二级质谱采用Data dependent scan(DDS)，分辨率为17500，AGC target 5e4。碰撞解离方式为Collision induced dissociation(CID)，优化后的二级碰撞能量为+40eV。
负离子模式质谱参数为：质谱分析采用加热电喷雾离子源(HESI)，离子源主要参数：Spray voltage为-3.2kV，Aux gas heater temperature为350℃，Capillarytemperature为350℃，Sheath gas flow rate为35arb，Aux gas flow rate为12arb。一级质谱采用全扫描模式，Resolution为70000，AGC target 1e6，离子的采集范围为120-1000m/z。二级质谱采用Data dependent scan(DDS)，分辨率为17500，AGC target 5e4。碰撞解离方式为Collision induced dissociation(CID)，优化后的二级碰撞能量为-20eV。
7.3、供试品的制备同“2.3”项下。
7.4、鉴定结果
7.4.1采用上述液相色谱和质谱分析条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μL，注入液质联用仪测定，得到相应的质谱总离子流图，如图10所示。经UPLC-Q-Exactive Orbitrap-HRMS成分基础研究表明，苦丁茶(粗壮女贞)富含苯丙素苷类、单萜苷类和黄酮苷类活性成分。共鉴定出61个成分，其中苯丙素苷类26种，单萜苷类24种(包含环烯醚萜苷类3种)，黄酮苷类7种和其他类4种。其中经标准品确认13种，且18种化合物为首次从该植物鉴定出，首次实现全谱鉴定。
本研究表明，苦丁茶(粗壮女贞)中的苯丙素苷类和单萜苷类成分普遍以同分异构体的形式存在。采用正负模式分析结合的方法，可以相互补充解析化合物结构和提高同分异构体的鉴定准确率。碰撞能量筛选结果表明，正模式下其特征性苯丙素苷类和单萜苷类主要以[M+Na]+的离子加和形式存在。当碰撞能量为+40eV时，其MS2结构中的糖基、酰基、异戊二烯基等取代基会逐步以整块基团结构脱去，且各特征碎片丰富和稳定存在，可以充分表征化合物结构间的差异。负模式下，其MS/MS2碎片主要以[M-H]-的准分子形式存在，-20eV碰撞能量的特征碎片种类较丰富且响应较好，能从不同的断裂角度补充成分的结构信息。碰撞能量大于-20eV时，MS2特征碎片的种类及相对丰度开始下降，不利于结构鉴定。
7.4.2、苦丁茶(粗壮女贞)特征性成分正负离子模式的结构推断
以33号化合物为例，其准分子为m/z761.26306[M+Na]+和737.26764[M-H]-，推测其分子式为C35H46O17。正离子MS2谱中的特征碎片为m/z615.20709、597.21190、469.14786、315.10455、305.09866和121.06461，如图11所示。基于高分辨质谱的精确碎片(<5ppm)和多级质谱信息推断其裂解规律可能为，其准分子[M+Na]+先脱去一分子鼠李糖基生成m/z615.20709，继续脱去一分子鼠李糖基生成m/z469.14786，进一步中性丢失4-羟基香豆酸产生m/z305.09866，最后中性丢失脱水葡萄糖产生m/z121.06461的对羟基苯乙烯。m/z597.21190为准分子[M+Na]+母离子中性脱去一分子4-羟基香豆酸产生，m/z315.10455为母离子脱去的两分子鼠李糖基产生，但相对丰度均较低。
结合负模式分析，MS2特征离子碎片为m/z591.23083[M-H-香豆酰基]-，163.03931[4-羟基肉桂酸-H]-和145.02850(基峰)，如图12所示。综合正负离子模式的结果推断33号化合物为紫茎女贞苷B，并经标准品确认，裂解规律见图12。
以24号化合物为例，其准分子为m/z777.25806[M+Na]+和753.26263[M-H]-，推测其分子式为C35H46O18。正离子MS2谱中的特征碎片为631.20056[M+Na-鼠李糖基]+,597.21240[M+Na-咖啡酸]+，485.14221[M+Na-2鼠李糖基]+,315.10590[2鼠李糖基+Na]+，305.09967[M+Na-2鼠李糖基-咖啡酸]+和121.06504，如图13所示。结合负模式分析，MS2特征离子碎片为m/z591.23004[M-H-咖啡酰基]-和161.02364(基峰)，如图14所示。综合正负离子模式的结果推断24号化合物为粗壮女贞苷N，并经标准品确认，裂解规律见图14。
以37号化合物为例，其准分子为m/z761.26343[M+Na]+和737.26782[M-H]-，推测其分子式为C35H46O17。正离子MS2谱中的特征碎片为615.20819[M+Na-鼠李糖基]+和469.14685[M+Na-2鼠李糖基]+，如图15所示。结合负模式分析，MS2特征离子碎片为m/z591.22919[M-H-香豆酰基]-,163.03915[4-羟基肉桂酸-H]-和145.02847(基峰)，如图16所示。综合正负离子模式的结果推断37号化合物为紫茎女贞苷C，并经标准品确认，裂解规律见图16。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (12)
1.一种粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
取紫茎女贞苷B、紫茎女贞苷C、粗壮女贞苷N、毛蕊花糖苷和异类叶升麻苷对照品，制备混合对照品溶液；
取粗壮女贞样品，与质量分数为45%~55%的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液，制备供试品溶液；
将所述混合对照品溶液与所述供试品溶液分别进行超高效液相色谱测定；
其中，所述超高效液相色谱采用的条件包括：流动相A为甲醇，流动相B为体积分数为0.15%~0.25%的磷酸水溶液；
所述超高效液相色谱采用的条件包括：采用梯度洗脱方式；所述梯度洗脱方式为：0min~10min，流动相A的体积百分数为30%；10min~26min，流动相A的体积百分数从30%变化至36%；26min~33min，流动相A的体积百分数从36%变化至41%；33min~37min，流动相A的体积百分数从41%变化至48%；37min~40min，流动相A的体积百分数从48%变化至52%；40min~45min，流动相A的体积百分数从52%变化至62%；45min~63min，流动相A的体积百分数从62%变化至65%；
所述超高效液相色谱采用的检测波长为326nm±10nm；
所述超高效液相色谱采用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
2.根据权利要求1所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用的流速为0.20mL/min~0.30mL/min。
3.根据权利要求2所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，超高效液相色谱测定的流速为0.20 mL/min、0.21 mL/min、0.22 mL/min、0.23 mL/min、0.24 mL/min、0.25mL/min、0.26 mL/min、0.27 mL/min、0.28 mL/min、0.29 mL/min或0.30 mL/min。
4.根据权利要求1所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用的柱温为25℃~35℃。
5.根据权利要求4所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，超高效液相色谱测定的柱温为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃。
6.根据权利要求1所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用的检测波长为326nm。
7.根据权利要求1所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶柱的尺寸包括：柱长为150mm，内径为2.1mm，十八烷基硅烷键合硅胶填料的粒径为1.7μm。
8.根据权利要求1~7任一项所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，制备对照品溶液包括如下步骤：
将紫茎女贞苷B、紫茎女贞苷C、粗壮女贞苷N、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷对照品与甲醇混合。
9.根据权利要求1~7任一项所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，超声提取的条件包括：功率为400W~450W；时间为15min~45min。
10.权利要求1~9任一项所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法所构建获得的指纹图谱在鉴别粗壮女贞与苦丁茶冬青中的应用。
11.一种粗壮女贞的高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
取粗壮女贞样品，与质量分数为45%~55%的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液，制备供试品溶液；
将所述供试品溶液进行超高效液相色谱与质谱联用测定；
其中，所述超高效液相色谱采用的条件与权利要求1~9任一项所述的超高效液相色谱采用的条件一致。
12.根据权利要求11所述的粗壮女贞的高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法，其特征在于，所述质谱采用正离子模式和/或负离子模式；
所述正离子模式中，离子源为加热电喷雾离子源，喷雾电压为+2.5kV~+3.5kV，辅助气加热器温度为300℃~400℃，毛细管温度为300℃~400℃，鞘气流速为30arb~40arb，辅助气流速为10arb~14arb；一级质谱采用全扫描模式，分辨率为60000~80000，自动增益控制目标为1e6，离子的采集范围为120m/z~1000m/z；二级质谱采用数据依赖扫描模式，分辨率为17000~18000，自动增益控制目标为5e4；碰撞解离方式为碰撞诱导解离，二级碰撞能量为+35eV~+45eV；
所述负离子模式中，离子源为加热电喷雾离子源，喷雾电压为-3.4kV~-3.0kV，辅助气加热器温度为300℃~400℃，毛细管温度为300℃~400℃，鞘气流速为30arb~40arb，辅助气流速为10arb~14arb；一级质谱采用全扫描模式，分辨率为60000~80000，自动增益控制目标为1e6，离子的采集范围为120m/z~1000m/z；二级质谱采用数据依赖扫描模式，分辨率为17000~18000，自动增益控制目标为5e4；碰撞解离方式为碰撞诱导解离，二级碰撞能量为-25eV~-15eV。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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