CN107632082B - 竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，该方法包括步骤(1)对照品溶液制备；步骤(2)供试品溶液制备和步骤(3)UFLC‑MS/MS检测。本发明根据竹叶椒中活性成分和杂质成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，洗脱程序、流速，柱温和色谱柱等分析条件，经多次实验验证表明。本发明以盐酸小檗碱为内标化合物，可同时测定6种生物碱的含量。该方法检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确的评价竹叶椒药材的质量，对控制药材的质量和保证临床疗效具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，特别涉及同时测定竹叶椒药材中六种生物碱类成分的方法。
背景技术
竹叶椒(Zanthoxylum armatumDC.)系芸香科花椒属植物，分布于华东、中南、西南及陕西、甘肃、台湾等地，生长于海拔2300米以下的山坡疏林、灌木丛中及路旁，产量丰富，具有镇痛、抗炎、增强细胞免疫及抗菌作用、降血糖作用、保肝作用、抑制血小板聚集活性等药理活性。其主要化学成分有生物碱、木脂素、挥发油、香豆素、微量元素等，其中生物碱为其主要活性成分，且已有研究表明isodecaline及dictamine具有显著止痛作用。目前竹叶椒质量检测方法有化学滴定法测定总生物碱的方法和高效液相法对白藓碱和茵芋碱的定量分析方法。竹叶椒含有多种生物碱活性成分，如Isodecaline、6–acetonyldihydrochelerythrine、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A、escholidine perchlorate、别隐品碱和白鲜碱。目前尚未有同时测定竹叶椒药材中六种生物碱类成分方法的报道。
因此，为了更加全面、客观、准确的控制竹叶椒药材的质量，很有必要在现有技术的基础之上，设计研发一种检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确地评价竹叶椒药材质量的检测方法。
发明内容：
发明目的：本发明的目的就是针对竹叶椒药材检测现状，为有效的控制竹叶椒药材质量，提供一种同时测定竹叶椒药材中六种生物碱类成分的方法，有助于对竹叶椒药材质量控制及保证临床疗效。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
分别精密称取Isodecaline、6–acetonyldihydrochelerythrine、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A、escholidine perchlorate、别隐品碱，白鲜碱对照品和盐酸小檗碱为内标化合物，精确吸取乙醇或甲醇，超声溶解，摇匀，制得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
竹叶椒药材供试品溶液的制备：精密称取一定质量竹叶椒药材，置于锥形瓶中，加入提取溶剂，超声提取，放冷，称重，加入相同提取溶剂补重，摇匀，离心，取上清液，即得竹叶椒药材供试品溶液；
(3)UFLC-MS/MS检测：
吸取步骤(1)对照品溶液，依次稀释成6个不同浓度的对照品溶液，分别注入UFLC-MS/MS系统进行分析制定标准曲线；然后取步骤(2)供试品溶液注入UFLC-MS/MS系统，根据标准曲线计算供试品溶液中生物碱含量；
其中，UFLC条件为：采用C18反相色谱柱，流动相A为0-0.1‰甲酸水溶液，B为含0-0.1‰甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速0.35-0.45mL·min－1，柱温35-45℃；采用电喷雾离子源(ESI)，多反应监测(MRM)，对化合物Isodecaline、6–acetonyldihydrochelerythrine、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A、escholidine perchlorate、别隐品碱、白鲜碱及内标物盐酸小檗碱在正、负离子模式下进行检测。
作为优选方案，以上所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，步骤(1)对照品溶液的制备方法为：分别精密称取Isodecaline对照品、6–acetonyldihydrochelerythrine对照品、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A对照品、escholidine perchlorate对照品、别隐品碱对照品、白鲜碱对照品和盐酸小檗碱为内标化合物，精密加入乙醇或体积浓度50％-100％甲醇，超声溶解，摇匀，制成浓度分别为0.5mg/mL，0.5mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL和1mg/mL的对照品溶液。
作为优选方案，以上所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，步骤(2)供试品溶液的制备方法为：
称取0.5mg竹叶椒药材，置于锥形瓶中，加入药材重量25～100倍体积量的提取溶剂，称重，超声提取10～30min，放冷，称重，加入相同提取溶剂，补重，摇匀，离心，取上清，即竹叶椒药材供试品溶液；所述的提取溶剂为甲醇、体积浓度50％甲醇或乙醇。
作为更加优选方案，以上所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，步骤(2)供试品溶液的制备方法为：
称取0.5mg竹叶椒药材，置于锥形瓶中，加入药材重量100倍体积量的甲醇，称重，超声提取10min，放冷，称重，加入甲醇，补重，摇匀，离心，取上清，即竹叶椒药材供试品溶液。
以上所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，所述步骤(3)中Isodecaline、6–acetonyldihydrochelerythrine、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A、escholidine perchlorate、别隐品碱和白鲜碱的线性方程分别为y＝0.00438x+0.00315、y＝0.083x+0.00241、y＝0.0235x+0.0747、y＝0.00379x+0.00442、y＝0.00443x+0.013和y＝0.018x+0.0659。
作为优选方案，以上所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，所述步骤(3)中的色谱柱为柱长50mm的C18反相色谱柱。优选Phenomenex Kinetex 2.6u XB–C18 100A色谱柱。
作为优选方案，以上所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，所述步骤(3)中的流动相A为0.1‰甲酸水溶液。流动相B为含0.1‰甲酸的乙腈溶液。
作为优选方案，以上所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，其特征在于：步骤(3)中所述的洗脱梯度为0.00–0.50min，2％B；0.51–5.00min，40–75％B；5.01–6.00min，2％B。
本发明根据竹叶椒药材中生物碱类各成分的理化性质，由于生物碱类化合物极性接近，在色谱柱上难以分离，本发明通过大量实验筛选流动相的组成和洗脱顺序，实验结果表明，采用本发明优选的酸性洗脱液(流动相A为0.1‰甲酸水溶液，流动相B为含0.1‰甲酸的乙腈溶液)和最佳的梯度洗脱程序能很好的将7个生物碱类化合物及其它杂质化合物分离。并且本发明可实现在6分钟以内实现分离，大大提高分离检测效率，取得了非常好的技术效果！。
作为优选方案，以上所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，其特征在于：步骤(3)中所述的流速为0.45mL·min－1。步骤(3)中所述的柱温为45℃。
同时本发明对色谱柱的柱温进行了筛选，考察了色谱柱在20℃、25℃、28℃、30℃，35℃和45℃条件下化合物的分离效果，实验结果表明，色谱柱在45℃条件下分离效果最好，分离重复性和稳定性最好。因此本发明采用色谱柱的柱温为45℃。本发明筛选实验表明，45℃的柱温对分离度有较大的影响，且该45℃的柱温，并非常规选择的柱温。
同时本发明对流速进行了筛选，考察了在0.3mL·min－1、0.45mL·min－1、0.5mL·min－1、0.6mL·min－1、0.8mL·min－1和1.0mL·min－1、条件下化合物的分离效果，实验结果表明，色谱柱在0.45mL·min－1条件下分离效果最好，分离重复性和稳定性最好。因此本发明采用最佳的流速为0.45mL·min－1。
本发明所述竹叶椒药材部位有：根、茎、叶和枝。
有益效果：本发明提供的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法和现有技术相比具有以下优点：
本发明根据竹叶椒中活性成分和杂质成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，洗脱程序、流速，柱温和色谱柱等分析条件，经多次实验验证表明。本发明以盐酸小檗碱为内标化合物，可同时测定Isodecaline、6–acetonyldihydrochelerythrine、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A、escholidine perchlorate、别隐品碱和白鲜碱(结构式如图1)的含量。该方法检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确的评价竹叶椒药材的质量，且可解决因对照品缺乏而无法客观合理地控制药材及其制剂质量的问题，对控制质量和保证临床疗效具有重要意义。
附图说明
图1为6种生物碱化合物的结构示意图。
具体实施方法
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，这些具体实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法
1.仪器与材料
Shimadzu LC–20AD型超快速液相色谱仪(日本Shimadzu公司)串联AB–SCIEXAPI4000+质谱仪(美国AB SCIEX公司)；Cascada IV超纯水系统(美国Pall公司)；KQ-100V型超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；5922型冷冻离心机(日本KUBOTA公司)；XS105分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；Kinetex 2.6u XB–C18100A色谱柱(2.1×50mm，美国Phenomenex公司)。
乙腈(色谱纯)购于德国Merck公司；甲酸(色谱纯)购于德国Riedel公司；实验室用水为超纯水。
竹叶椒根于2016年收集于广西天峨、江西、湖南。
六种生物碱化合物对照品(Isodecaline、6–acetonyldihydrochelerythrine、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A、escholidine perchlorate、别隐品碱和白鲜碱)均为实验室分离制备，结构经波谱数据鉴定，峰面积归一化法质量分数均大于98％。盐酸小檗碱(110713-201212，含量测定用，中检所)。
2.方法与结果
2.1提取工艺的优化
称取竹叶椒根药材0.5g，采用正交试验法优选提取溶剂(乙醇、50％甲醇、甲醇)、料液比(1:25、1:50、1:100，w/v)及提取时间(10min、20min、30min)。以总生物碱产率为实验指标，考察实验因素的各实验水平对其影响，从极差结果得知，3个因素对竹叶椒总生物碱提取率的影响大小依次为：溶剂>提取时间>料液比。三种因素中，溶剂种类对提取率影响显著，其中甲醇提取率最优。料液比对提取率的影响仅次于溶剂种类，最终选择料液比1:100。提取时间影响最小，选择10min为最优条件。
表1通过L9(33)正交试验结果得出，最优提取条件为：50ml甲醇超声提取10min。经后期验证，此提取条件所得竹叶椒生物碱产率高且稳定。
表1超声提取竹叶椒总生物碱工艺L9(33)正交试验设计及结果
2.2色谱条件
通过考察分析时间、流动相体系、柱温、流速等色谱条件，经反复优化，最终确定Shimadzu LC–20AD型超快速液相色谱仪(日本Shimadzu公司)分析竹叶椒药材中六种生物碱类成分的色谱条件为：采用Phenomenex Kinetex 2.6u XB–C18100A色谱柱(2.1×50mm)，以0.1‰甲酸水(A)-含0.1‰甲酸乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱，柱温40℃，流速0.45mL/min，进样量5μl，洗脱程序为：0.00–0.50min，2％B；0.51–5.00min，40–75％B；5.01–6.00min，2％B，检测时间6min。
2.3质谱条件
AB-SCIEXAPI 4000+质谱仪(美国AB SCIEX公司)通过Turbo V离子源与ShimadzuLC–20AD型超快速液相色谱系统(Kyoto，Japan)连接。AB-SCIEX Analyst软件包用于控制UFLC-MS/MS系统，以及数据采集和处理。质谱仪以正离子ESI模式运行，扫描方式多反应检测模式(MRM)。喷射电压为5.0kV，离子源温度500℃，雾化气，辅助气，气帘气分别为：35，45，45psi。内部碰撞气体(CAD)流量为8级。
表2六种生物碱成分和内标化合物的MRM参数及保留时间
2.4供试品溶液制备
精密称取竹叶椒根药材粉末0.5g，精密加入50ml甲醇，称重，超声10min，放冷，补重，13,000rmp离心10min取上清，备用。
2.5对照品溶液制备
分别称取Isodecaline对照品、6–acetonyldihydrochelerythrine对照品、N-MethylanhydrotetrahydroberberrubineA对照品、escholidine perchlorate对照品、别隐品碱对照品、白鲜碱对照品，精密吸取加甲醇，超声溶解，摇匀，制成浓度分别为0.5mg/mL，0.5mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL和1mg/mL的混合对照品溶液。
2.6线性关系、检测限与定量限考察
取混合对照品依次稀释6倍，得到6个不同浓度的混合对照品溶液，进样5μl，以内标法绘制标准曲线。
得Isodecaline、6–acetonyldihydrochelerythrine、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A、escholidine perchlorate、别隐品碱和白鲜碱的线性方程。结果见表3。
取一定浓度混合对照品，进样测定各成分信噪比，以信噪比为3为检测限(LOD)，10为定量限(LOQ)确定各成分检测限及定量限。结果见表3。
由表3可知，该方法测得的各成分线性良好。
表3六种生物碱的线性回归方程、检测限和定量限
2.7精密度、重现性、稳定性及加样回收试验
取广西天峨产竹叶椒根提取液于1天内重复进样6次，连续进样三天，将浓度变化作为精密度测量值，并以相对标准偏差(RSD)表示，考察日内、日间精密度。
取广西天峨产竹叶椒根提药材，分别制备6份，进行测定，计算RSD％，以考察方法重现性。
分别在0,2,4,8,12和24h对同一供试品溶液进行测定，计算RSD％，以考察方法稳定性。
取已知含量竹叶椒根提取液，分别加入低(已知量的80％)、中(已知量的100％)、高(已知量的120％)三个水平已知浓度混合对照溶液，进行测定，计算回收率。结果见表4。
由表4可知，该方法精密度、重现性、稳定性和回收率RSD％均在可接受范围内。
表4精密度、重现性、稳定性和回收率结果
2.8样品含量测定
取不同产地竹叶椒根药材，按2.1项下确定最优提取条件制备样品溶液，进样测定，结果见表5。
表5不同产地竹叶椒根药材中六种生物碱及总生物碱含量
实施例2竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法
1.仪器与材料
Shimadzu LC–20AD型超快速液相色谱仪(日本Shimadzu公司)串联AB–SCIEXAPI4000+质谱仪(美国AB SCIEX公司)；Cascada IV超纯水系统(美国Pall公司)；KQ-100V型超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；5922型冷冻离心机(日本KUBOTA公司)；XS105分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；Kinetex 2.6u XB–C18 100A色谱柱(2.1×50mm，美国Phenomenex公司)。
乙腈(色谱纯)购于德国Merck公司；甲酸(色谱纯)购于德国Riedel公司；实验室用水为超纯水。
竹叶椒叶于2016年收集于广西天峨、江西、湖南。
六种生物碱化合物对照品(Isodecaline、6–acetonyldihydrochelerythrine、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A、escholidine perchlorate、别隐品碱和白鲜碱)均有实验室分离制备，结构经波谱数据鉴定，峰面积归一化法质量分数均大于98％。盐酸小檗碱(110713-201212，含量测定用，中检所)。
2.2色谱条件
采用Phenomenex Kinetex 2.6u XB–C18 100A色谱柱(2.1×50mm)，以0.1‰甲酸水(A)-含0.1‰甲酸乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱，柱温40℃，流速0.45mL/min，进样量5μl，洗脱程序为：0.00–0.50min，2％B；0.51–5.00min，40–75％B；5.01–6.00min，2％B。检测时间6min。
2.3供试品溶液制备
精密称取竹叶椒叶药材粉末0.5g，精密加入50ml甲醇，称重，超声10min，放冷，补重，13,000rmp离心10min取上清，备用。
2.4对照品溶液制备
分别称取Isodecaline对照品7.35mg、6–acetonyldihydrochelerythrine对照品7.56mg、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A对照品6.40mg、escholidineperchlorate对照品6.90mg、别隐品碱对照品6.05mg、白鲜碱对照品10.50mg，精密吸取加甲醇，超声溶解，摇匀，制成浓度分别为0.5mg/mL，0.5mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，1mg/mL，和0.5mg/mL的对照品溶液。
2.5样品含量测定
取不同产地竹叶椒叶药材，按最优提取条件制备样品溶液，进样测定，结果见表6。
表6不同产地竹叶椒叶药材中六种生物碱及总生物碱含量
实施例3竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法
1.仪器与材料
Shimadzu LC–20AD型超快速液相色谱仪(日本Shimadzu公司)串联AB–SCIEXAPI4000+质谱仪(美国AB SCIEX公司)；Cascada IV超纯水系统(美国Pall公司)；KQ-100V型超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；5922型冷冻离心机(日本KUBOTA公司)；XS105分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；Kinetex 2.6u XB–C18100A色谱柱(2.1×50mm，美国Phenomenex公司)。
乙腈(色谱纯)购于德国Merck公司；甲酸(色谱纯)购于德国Riedel公司；实验室用水为超纯水。
竹叶椒茎于2016年收集于广西天峨、江西、武夷山。六种生物碱化合物对照品(Isodecaline、6–acetonyldihydrochelerythrine、N-MethylanhydrotetrahydroberberrubineA、escholidine perchlorate、别隐品碱和白鲜碱)均有实验室分离制备，结构经波谱数据鉴定，峰面积归一化法质量分数均大于98％。盐酸小檗碱(110713-201212，含量测定用，中检所)。
2.2色谱条件
采用Phenomenex Kinetex 2.6u XB–C18 100A色谱柱(2.1×50mm)，以0.1‰甲酸水(A)-含0.1‰甲酸乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱，柱温40℃，流速0.45mL/min，进样量5μl，洗脱程序为：0.00–0.50min，2％B；0.51–5.00min，40–75％B；5.01–6.00min，2％B。检测时间6min。
2.3供试品溶液制备
精密称取竹叶椒茎药材粉末0.5g，精密加入50ml甲醇，称重，超声10min，放冷，补重，13,000rmp离心10min取上清，备用。
2.4对照品溶液制备
分别称取Isodecaline对照品7.35mg、6–acetonyldihydrochelerythrine对照品7.56mg、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A对照品6.40mg、escholidineperchlorate对照品6.90mg、别隐品碱对照品6.05mg、白鲜碱对照品10.50mg，精密吸取加甲醇，超声溶解，摇匀，制成浓度分别为0.5mg/mL，0.5mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，1mg/mL，和0.5mg/mL的对照品溶液。
2.5样品含量测定
取不同产地竹叶椒茎药材，按最优提取条件制备样品溶液，进样测定，结果见表7。
表7不同产地竹叶椒茎药材中六种生物碱及总生物碱含量
本发明提供的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，灵敏度高，稳定性和重复性好，可以客观、全面、准确地评价竹叶椒药材的质量，对控制竹叶椒药材的质量和保证其临床疗效具有重要的意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
分别精密称取Isodecaline对照品、6–acetonyldihydrochelerythrine对照品、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A对照品、escholidine perchlorate对照品、别隐品碱对照品，白鲜碱对照品和盐酸小檗碱内标化合物，精确吸取乙醇或甲醇，超声溶解，摇匀，制得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
竹叶椒药材供试品溶液的制备：精密称取一定质量竹叶椒药材，置于锥形瓶中，加入提取溶剂，超声提取，放冷，称重，加入相同提取溶剂补重，摇匀，离心，取上清液，即得竹叶椒药材供试品溶液；
(3)UFLC-MS/MS检测：
吸取步骤(1)对照品溶液，依次稀释成6个不同浓度的对照品溶液，分别注入UFLC-MS/MS系统进行分析制定标准曲线；然后取步骤(2)供试品溶液注入UFLC-MS/MS系统，根据标准曲线计算供试品溶液中生物碱含量；
其中，UFLC条件为：采用C18反相色谱柱，流动相A为0-0.1‰甲酸水溶液，B为含0-0.1‰甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱:0.00–0.50min，2％B；0.51–5.00min，40–75％B；5.01–6.00min，2％B；流速0.35-0.45mL·min－1，柱温35-45℃；质谱仪采用电喷雾离子源，扫描方式为多反应监测，对化合物Isodecaline、6–acetonyldihydrochelerythrine、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A、escholidine perchlorate、别隐品碱、白鲜碱及内标物盐酸小檗碱在正、负离子模式下进行检测。
2.根据权利要求1所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，其特征在于，
(1)对照品溶液的制备：分别精密称取Isodecaline对照品、6–acetonyldihydrochelerythrine对照品、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A对照品、escholidine perchlorate对照品、别隐品碱对照品、白鲜碱对照品和盐酸小檗碱内标化合物，精密加入乙醇或体积浓度50％-100％甲醇，超声溶解，摇匀，制成浓度分别为0.5mg/mL，0.5mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL和1mg/mL的混合对照品溶液。
3.根据权利要求2所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，其特征在于，
步骤(2)供试品溶液的制备方法为：
称取0.5mg竹叶椒药材，置于锥形瓶中，加入药材重量25～100倍体积量的提取溶剂，称重，超声提取10～30min，放冷，称重，加入相同提取溶剂，补重，摇匀，离心，取上清，即竹叶椒药材供试品溶液；所述的提取溶剂为甲醇、体积浓度50％甲醇或乙醇。
4.根据权利要求1至3任一项所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中的色谱柱为柱长50mm的C18反相色谱柱。
5.根据权利要求1至3任一项所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，其特征在于：所述步骤(3)中的流动相A为0.1‰甲酸水溶液；流动相B为含0.1‰甲酸的乙腈溶液。
6.根据权利要求1至3任一项所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，其特征在于：所述步骤(3)中Isodecaline、6–acetonyldihydrochelerythrine、N-Methylanhydrotetrahydroberberrubine A、escholidine perchlorate、别隐品碱和白鲜碱的线性方程分别为y＝0.00438x+0.00315、y＝0.083x+0.00241、y＝0.0235x+0.0747、y＝0.00379x+0.00442、y＝0.00443x+0.013和y＝0.018x+0.0659。
7.根据权利要求1至3任一项所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，其特征在于：步骤(3)中所述的流速为0.45mL·min-1；步骤(3)中所述的柱温为45℃。
8.根据权利要求1至3任一项所述的竹叶椒药材中生物碱类成分的测定方法，其特征在于：步骤(3)中质谱仪以正离子ESI模式运行，扫描方式为多反应检测模式，喷射电压为5.0kV，离子源温度500℃，雾化气，辅助气，气帘气分别为：35，45和45psi；内部碰撞气体流量为8级。
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