CN106198782A - 一种可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价的质量控制方法 - Google Patents

一种可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价的质量控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价的质量控制方法。以芦丁、异绿原酸A和苦丁冬青甙A为内参物，计算芦丁对6‑羟基‑7,7a‑二氢‑2（6H）‑苯并呋喃、羟基酪醇葡萄糖苷，异绿原酸A对原儿茶酸、苦丁冬青甙E、苦丁冬青甙D、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸C，及苦丁冬青甙A对大叶冬青苷G、苦丁冬青甙G、苦丁茶冬青苷T和大叶冬青苷H的校正因子，作为常数用于含量测定，仅需3种常见对照品即可同时测定苦丁茶中18种成分的含量，快速、经济、科学的控制苦丁茶的质量，进一步可利用18种成分含量进行药材的聚类分析、主成份分析和相似度计算，全面控制苦丁茶质量。

Description

一种可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价 的质量控制方法
技术领域
本发明属于中药分析技术领域。更具体地，涉及一种可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价的质量控制方法。
背景技术
苦丁茶是冬青科冬青属的干燥叶子，广泛分布在中国的海南、湖北、广东、广西和湖南等省份。它作为预防脂代谢异常相关性疾病的民族药，在民间已经应用了上千年，目前研究表明其对心血管类疾病和代谢综合症具有显著药理活性，已成为当前药食同源研究的热点。基于其抗氧化和免疫调节的特点，苦丁茶通常被应用临床辅助治疗糖尿病、高血压、肥胖、高脂血症，并且已经开发出各种保健产品。
苦丁茶中的药物活性成分被认为是酚酸、三萜皂苷和黄酮类化合物，它们也被认为是化学分析和质量评价的主要成分。为了更有效的利用该药材资源，亟须一种准确、可靠并能够进行多成分同时含量测定的方法。
但是，目前报道的大部分定量方法由于受限于对照品的瓶颈问题，特别其大部分三萜皂苷类成分多来源于实验室自制，传统的测定方法难以普及。因此，苦丁茶的质量检验和监督仍然是一个挑战。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价的质量控制方法。利用“一测多评”法、指纹图谱、化学模式识别以及相似度分析、主成分分析和聚类分析，基于18种成分(包括8种酚酸，7种三萜类、1种黄酮类和2个其它类别成分)的含量数据，对来自中国不同产地的15批药材进行了模式识别分析，同时进行含量测定。
本发明的目的是提供一种可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价的质量控制方法。
本发明另一目的是提供上述方法的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价的质量控制方法，包括如下步骤：
S1.色谱条件：
柱温：30℃；
检测波长：210nm，260nm，326nm；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl；
流动相：A为0.05％磷酸-H2O，B为乙腈，C为甲醇；
S2.对照品溶液的制备：
称取芦丁、异绿原酸A和苦丁冬青甙A标准品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成含芦丁、异绿原酸A和苦丁冬青甙A的混合对照品溶液，绘制标准曲线；
S3.供试品溶液的制备：
精密称定苦丁茶细粉，甲醇室温浸渍后冰浴超声提取，0.45μm滤过，即得供试品溶液；
S4.成分含量计算：
进样供试品溶液，记录苦丁茶中18个组分在相应波长处的峰面积，用标准曲线计算出三个内参物的浓度，再结合相对校正因子RCFx按下式即可计算出其他15种组分的浓度，继而计算出其在苦丁茶中的含量：
待测组分的浓度Cx由下式计算得出：
其中，Ax为内参物对照品峰面积，Ai为待测成分对照品峰面积；Ci为待测成分对照品浓度；
每个组分所对应的RCFx分别为：
其中，优选地，步骤S1所述色谱条件为：
色谱柱：Phenomenex Synergi Hydro-RPC18columns，4.6mm×250mm,5μm；
柱温：30℃；
检测波长：210nm，254nm，326nm；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl；
流动相：A为0.05％磷酸-H2O，B为乙腈，C为甲醇，按下面进行梯度洗脱：
时间0.0min，A相94％，B相6％；
时间5min，A相94％，B相6％；
时间15min，A相88％，B相12％；
时间25min，A相84％，B相16％；
时间26min，A相77％，B相20％，C相3％；
时间45min，A相77％，B相20％，C相3％；
时间50min，A相74％，B相26％；
时间70min，A相74％，B相26％；
时间85min，A相71％，B相29％；
时间110min，A相54％，B相46％；
时间110.01min，A相10％，B相90％；
时间120min，A相10％，B相90％。
优选地，步骤S2所述对照品溶液的制备方法为：称取芦丁、异绿原酸A和苦丁冬青甙A标准品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成含芦丁100.0μg·ml-1，异绿原酸A 1000μg·ml-1、苦丁冬青甙A 1000μg·ml-1、的混合对照品溶液；以此作为标准曲线的最高浓度，分别稀释2、4、8和20倍，用作绘制标准曲线。
优选地，步骤S3所述供试品溶液的制备方法为：取苦丁茶细粉0.2g，精密称定，20.0ml甲醇室温浸渍30min；冰浴超声提取30min，放冷至室温，补足重量，摇匀，0.45μm滤过，即得供试品溶液。
优选地，步骤S4所述苦丁茶中18个组分在相应波长处是指：
260nm，以芦丁为内参物，对应：6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃，相对保留时间0.3253；羟基酪醇葡萄糖苷，相对保留时间0.385；原儿茶酸，相对保留时间0.420；苦丁冬青甙E，相对保留时间3.026；苦丁冬青甙D，相对保留时间3.116；
210nm，以苦丁冬青甙A为内参物，对应：大叶冬青苷G，相对保留时间0.803；苦丁冬青甙G，相对保留时间0.912；苦丁茶冬青苷T，相对保留时间1.208；大叶冬青苷H，相对保留时间1.215；
326nm，以异绿原酸A为内参物，对应：新绿原酸，相对保留时间0.401；绿原酸，相对保留时间0.551；隐绿原酸，相对保留时间0.574；咖啡酸，相对保留时间0.629；异绿原酸B，相对保留时间0.948；异绿原酸C，相对保留时间1.105。
即如下表所示：
注：a代表以芦丁为内参物；b代表以异绿原酸A为内参物；
c代表以苦丁冬青甙A为内参物。
另外，上述方法在苦丁茶的质量控制方面的应用也在本发明保护范围之内。
本发明上述方法主要基于本发明研究得到的各组分的相对校正因子，获得方法如下：是以芦丁、异绿原酸A和苦丁冬青甙A为内参物，计算芦丁对6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃、羟基酪醇葡萄糖苷，异绿原酸A对原儿茶酸、苦丁冬青甙E、苦丁冬青甙D、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸C，以及苦丁冬青甙A对大叶冬青苷G、苦丁冬青甙G、苦丁茶冬青苷T和大叶冬青苷H的相对校正因子，将其作为常数用于含量测定。具体地，包括如下步骤：
(1)确定色谱条件；
(2)对照品溶液的制备；
(3)供试品溶液的制备；
(4)校正因子的计算。
更具体地，上述可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价的质量控制方法，步骤如下：
(1)色谱条件：
色谱柱：Phenomenex Synergi Hydro-RPC18columns(4.6mm×250mm,5μm)
柱温：30℃；检测波长：210nm，254nm，326nm；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl；
流动相：A为0.05％磷酸-H2O，B为乙腈，C为甲醇，按下面进行梯度洗脱：
时间0.0min，A相94％，B相6％；
时间5min，A相94％，B相6％；
时间15min，A相88％，B相12％；
时间25min，A相84％，B相16％；
时间26min，A相77％，B相20％，C相3％；
时间45min，A相77％，B相20％，C相3％；
时间50min，A相74％，B相26％；
时间70min，A相74％，B相26％；
时间85min，A相71％，B相29％；
时间110min，A相54％，B相46％；
时间110.01min，A相10％，B相90％；
时间120min，A相10％，B相90％；
(2)对照品的制备：
精密称取芦丁(R4)标准品1.580mg、6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃(R1)标准品1.550mg、羟基酪醇葡萄糖苷(R2)标准品0.760mg、原儿茶酸(R3)标准品0.225mg、苦丁冬青甙E(R5)标准品1.000mg、苦丁冬青甙D(R6)标准品1.010mg，异绿原酸A(K6)标准品2.730mg、新绿原酸标准品(C1)2.260mg、绿原酸(C2)标准品1.510mg、隐绿原酸(C3)标准品1.010mg、咖啡酸(C4)标准品1.060mg、异绿原酸B(C5)标准品1.640mg、异绿原酸C(C7)标准品0.970mg、苦丁冬青甙A(K3)标准品2.130mg、大叶冬青苷G标准品2.090mg、苦丁冬青甙G标准品1.830mg、苦丁茶冬青苷T标准品1.300mg和大叶冬青苷H标准品1.210mg，分别置于容量瓶中，先加甲醇溶解再定容，摇匀，即得对照品溶液储备液；
吸取各对照品储备液，制成含芦丁31.6μg·ml-1、6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃62.0μg·ml-1、羟基酪醇葡萄糖苷380.0μg·ml-1、原儿茶酸10.13μg·ml-1、苦丁冬青甙E 60.0μg·ml-1、苦丁冬青甙D 50.0μg·ml-1，异绿原酸A 1365.0μg·ml-1、新绿原酸101.7μg·ml-1、绿原酸755.0μg·ml-1、隐绿原酸101.0μg·ml-1、咖啡酸106.0μg·ml-1、异绿原酸B 106.6μg·ml-1、异绿原酸C 485.0μg·ml-1、苦丁冬青甙A 1065.0μg·ml-1、大叶冬青苷G 1045.0μg·ml-1、苦丁冬青甙G 915.0μg·ml-1、苦丁茶冬青苷T 39.0μg·ml-1和大叶冬青苷H 199.7μg·ml-1的混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：
取苦丁茶细粉0.2g，精密称定，20.0ml甲醇室温浸渍30min；冰浴超声提取30min，防冷至室温，补足重量，摇匀，0.45μm滤过，即得供试品溶液；
(4)校正因子计算：
以芦丁(R4)、异绿原酸A(C6)和苦丁冬青甙A(K3)为内参物，计算芦丁(R4)对6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃(R1)、羟基酪醇葡萄糖苷(R2)、原儿茶酸(R3)、苦丁冬青甙E(R5)、苦丁冬青甙D(R6)，异绿原酸A(C6)对新绿原酸(C1)、绿原酸(C2)、隐绿原酸(C3)、咖啡酸(C4)、异绿原酸B(C5)、异绿原酸C(C7)，以及苦丁冬青甙A(K3)对大叶冬青苷G(K1)、苦丁冬青甙G(K2)、苦丁茶冬青苷T(K4)和大叶冬青苷H(K5)的相对校正因子，将其作为常数用于含量测定。
具体地，在线性范围内，苦丁茶中成分的量与检测器的响应成正比，芦丁、异绿原酸A和苦丁冬青甙A为内参物，计算芦丁(R4)对6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃(R1)、羟基酪醇葡萄糖苷(R2)、原儿茶酸(R3)、苦丁冬青甙E(R5)、苦丁冬青甙D(R6)，异绿原酸A(C6)对新绿原酸(C1)、绿原酸(C2)、隐绿原酸(C3)、咖啡酸(C4)、异绿原酸B(C5)、异绿原酸C(C7)，以及苦丁冬青甙A(K3)对大叶冬青苷G(K1)、苦丁冬青甙G(K2)、苦丁茶冬青苷T(K4)和大叶冬青苷H(K5)的相对校正因子，根据校正因子(RCF，f)的计算公式：
RCF x = f x f i = A x / C x A i / C i - - - ( 1 )
C x = C i RCF x × A x A i - - - ( 2 )
C x × RCF x = A x ( A i / C i ) - - - ( 3 )
其中Ax为内参物对照品峰面积，Cx为内参物对照品浓度，Ai为待测成分对照品峰面积；Ci为待测成分对照品浓度。
试验得到芦丁对6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃、羟基酪醇葡萄糖苷、原儿茶酸、苦丁冬青甙E、苦丁冬青甙D，异绿原酸A对新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸C以及苦丁冬青甙A对大叶冬青苷G、苦丁冬青甙G、苦丁茶冬青苷T和大叶冬青苷H的相对校正因子，分别为3.194、1.680、1.570、1.039、1.066；0.775、0.836、0.709、1.753、1.731、1.280以及0.423、0.137、0.635、0.349。
进一步地，共有峰的确认方法如下：
S1.按照权利要求3中步骤(2)和(3)分别制备对照品溶液和供试品溶液，按步骤(1)的色谱条件，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪中，测定并记录色谱，即得。
S2.指标的建立及图谱组分色谱峰判断方法
供试品色谱中，呈现18个与苦丁茶指纹图谱共有模式标准图谱相对应的特征峰；按欧氏距离计算，供试品指纹图谱与对照品指纹图谱的相似度不低于0.90。以芦丁峰为对照峰，6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃、羟基酪醇葡萄糖苷、原儿茶酸、苦丁冬青甙E、苦丁冬青甙D共有特征峰相对保留时间分别为：0.325、0.385、0.420、3.066、3.116；以异绿原酸A峰为对照峰，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸C共有特征峰相对保留时间分别为：0.401、0.551、0.574、0.629、0.948、1.105；以苦丁冬青甙A峰为对照峰，大叶冬青苷G、苦丁冬青甙G、苦丁茶冬青苷T、大叶冬青苷H共有特征峰相对保留时间分别为0.803、0.912、1.208、1.215，各峰相对保留时间RSD≤5％，无显著差异。
而不同产地苦丁茶的相似度评价方法如下：
样品聚类与成分分析：将供试品色谱中18个已得到定量特征性成分信息导入SPSS19.0进行样品聚类与主成分分析，可以看到不同产地的苦丁茶的品质以及成分含量与其他产地的差异，可作为区别药材品质的手段之一，18个成分可降维成两个因子综合代表饮片的综合质量。
另外，上述方法在苦丁茶的质量控制方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
在此基础上，本发明方法所涵盖的核心思路还可以应用于其他含有多类组份的中药饮片或药物制剂的质量控制，具有广泛的应用基础。
本发明以苦丁茶中有效活性成分且含量较高的芦丁(K4)、异绿原酸A(C6)和苦丁冬青甙A(K3)作为内参物，计算校正因子，可实现仅需3种常见对照品即可同时测定苦丁茶中18种成分的含量，快速、经济、科学的控制苦丁茶的质量，还可解决因对照品缺乏而无法实现多组分同时含量测定，全面控制苦丁茶质量的问题。此外，利用18个成分的含量进行了药材的聚类分析、主成份分析和相似度计算，与利用不同波长下指纹图谱共有峰峰面积的计算结果相一致，对苦丁茶的全面质量控制有重要意义。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明仅用中药有效成分内在比例关系，以芦丁、异绿原酸A和苦丁冬青甙A为内参物，计算芦丁(R4)对6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃(R1)、羟基酪醇葡萄糖苷(R2)、原儿茶酸(R3)、苦丁冬青甙E(R5)、苦丁冬青甙D(R6)，异绿原酸A(C6)对新绿原酸(C1)、绿原酸(C2)、隐绿原酸(C3)、咖啡酸(C4)、异绿原酸B(C5)、异绿原酸C(C7)，以及苦丁冬青甙A(K3)对大叶冬青苷G(K1)、苦丁冬青甙G(K2)、苦丁茶冬青苷T(K4)和大叶冬青苷H(K5)的相对校正因子，分别为3.194、1.680、1.570、1.039、1.066；0.775、0.836、0.709、1.753、1.731、1.280以及0.423、0.137、0.635、0.349，将其作为常数用于含量测定，并考察了不同仪器、柱子、柱温和流速对于相对校正因子的影响，通过测定芦丁、异绿原酸A和苦丁冬青甙A实现苦丁茶中其它15种成分的含量测定，可用于苦丁茶中成分的全面定量。
2、使用本发明色谱条件所获得的色谱图，不仅可实现18个组分的同时含量测定，还可作为指纹图谱实现模式识别分析及相似度计算。采用欧氏距离计算方法，即可在对苦丁茶下进行相似度评价，即：通过一测多评对供试品进行定量，将结果导入SPSS19.0中进行聚类分析和主成分分析可对不同来源的苦丁茶进行差异性评价，更全面的评价了苦丁茶的质量。
3、同时，试验表明采用相对保留值法对苦丁茶中待测成分进行色谱峰定位，简便可行。具有方法良好，稳定性和重现性好、可操作性强的优点，对苦丁茶的质量控制具有重要意义。
4、中药一般被认为是多成分、多靶点协同发挥药理作用，仅靠单一成分的检测降低了不能全面反映中药材的质量。本发明使用“一测多评”法，快速、便捷，只需一个对照品即可实现多成分的含量测定，从而克服了对照品匮乏和稀缺的问题。化学模式识别能更客观有效的识别特定品种并评价中药之间的相似性和差异性。
附图说明
图1为15个产地药材中各类组分含量总和(A-卢丁和其它两组分了；B-酚酸类；C-皂苷类)。
图2为本发明混合对照品和供试品不同波长下的色谱图(A代表混合对照品260nm的色谱图，A′代表供试品在260nm下的色谱图)。
图3为本发明混合对照品和供试品不同波长下的色谱图(B代表混合对照品326nm的色谱图，B′代表供试品在326nm下的色谱图)。
图4为本发明混合对照品和供试品不同波长下的色谱图(C代表混合对照品210nm的色谱图，C′代表供试品在210nm下的色谱图)。
图5为15批苦丁茶样品的聚类分析(A)和主成分分析(B)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1可同时实现苦丁茶中18个组份含量分析和相似度评价的质量控制方法
1.仪器与试药
1.1仪器:
Waters Alliance高效液相色谱仪，Agilent 1260高效液相色谱仪，Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪，Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色谱柱，Waters Symmetry C18色谱柱and ACCHROM C18色谱柱。
1.2试剂和药品:
芦丁对6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃、羟基酪醇葡萄糖苷、苦丁冬青甙E、苦丁冬青甙D，苦丁冬青甙A，大叶冬青苷G、苦丁冬青甙G、苦丁茶冬青苷T和大叶冬青苷H由苦丁茶中分离而得。原儿茶酸，异绿原酸A，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸C购自中国药品生物制品鉴定所或四川维克奇生物科技有限公司；15批苦丁茶来自中国广东、广西、上海、云南、海口；试验中用到的试剂均为色谱纯，水为超纯水。
附图1所示为15个产地药材中各类组分含量总和(A-芦丁和其它两组分；B-酚酸类；C-皂苷类)。
2.方法与结果
2.1溶液的制备：
供试品溶液的制备：取苦丁茶细粉0.2g，精密称定，20.0ml甲醇室温浸渍30min，冰浴超声提取30min，放冷至室温，补足重量，摇匀，0.45μm滤过，即得供试品溶液。
对照品溶液的制备：精密称取芦丁(R4)标准品1.580mg、6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃(R1)标准品1.550mg、羟基酪醇葡萄糖苷(R2)标准品0.760mg、原儿茶酸(R3)标准品0.225mg、苦丁冬青甙E(R5)标准品1.000mg、苦丁冬青甙D(R6)标准品1.010mg，异绿原酸A(C6)标准品2.730mg、新绿原酸(C1)标准品2.260mg、绿原酸(C2)标准品1.510mg、隐绿原酸(C3)标准品1.010mg、咖啡酸(C4)标准品1.060mg、异绿原酸B(C5)标准品1.640mg、异绿原酸C(C7)标准品0.970mg、苦丁冬青甙A(K3)标准品2.130mg、大叶冬青苷G(K1)标准品2.090mg、苦丁冬青甙G(K2)标准品1.830mg、苦丁茶冬青苷T(K4)标准品1.300mg和大叶冬青苷H(K5)标准品1.210mg，分别置于容量瓶中，先加甲醇溶解再定容，摇匀，即得对照品溶液储备液；吸取各对照品储备液，制成含芦丁31.6μg·ml-1、6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃62.0μg·ml-1、羟基酪醇葡萄糖苷380.0μg·ml-1、原儿茶酸10.13μg·ml-1、苦丁冬青甙E 60.0μg·ml-1、苦丁冬青甙D 50.0μg·ml-1，异绿原酸A1365.0μg·ml-1、新绿原酸101.7μg·ml-1、绿原酸755.0μg·ml-1、隐绿原酸101.0μg·ml-1、咖啡酸106.0μg·ml-1、异绿原酸B106.6μg·ml-1、异绿原酸C485.0μg·ml-1、苦丁冬青甙A 1065.0μg·ml-1、大叶冬青苷G 1045.0μg·ml-1、苦丁冬青甙G 915.0μg·ml、苦丁茶冬青苷T 39.0μg·ml-1和大叶冬青苷H 199.7μg·ml-1的混合对照品溶液。
2.2高效液相色谱分析：
精密吸取供试品溶液和对照品溶液20μl，进样；色谱条件：色谱柱为PhenomenexSynergi Hydro-RP C18色谱柱4.6mm×250mm,5μm；流动相为0.05％磷酸-H2O(A)，乙腈(B)，甲醇(C)，梯度洗脱方式为：时间0.1min，A相94％，B相6％；时间5min，A相94％，B相6％；时间15min，A相88％，B相12％；时间25min，A相84％，B相16％；时间26min，A相77％，B相20％，C相3％；时间45min，A相77％，B相20％，C相3％；时间50min，A相74％，B相26％；时间70min，A相74％，B相26％；时间85min，A相71％，B相29％；时间110min，A相54％，B相46％；时间110.01min，A相10％，B相90％；时间120min，A相10％，B相90％；检测波长：210nm、260nm、326nm；流速：1.0ml·min-1；分别得到混合对照品的高效液相色谱图和供试品的高效液相色谱图，如附图2～4所示。
2.3共有峰的确定：
将上述15批供试品的高效液相色谱图经不同波长下进行比较，呈现21个共有峰，取具有特征性信息的18个成分峰进行分析，在图2～4中标出。
2.4方法学考察
2.4.1线性关系考察
精密量取混合对照品溶液，逐级稀释，得系列标准品溶液。取系列标准品溶液各进样20μl，记录并分析峰面积，以对照品质量浓度(μg·ml-1)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，以最小二乘法求得回归方程，结果见表1。
表1 线性关系考察
2.4.2精密度、重复性、稳定性考察
精密吸取“2.4.1”项下混合对照品溶液20μl，重复进样测定6次，记录峰面积计算精密度；取同一份供试品溶液分别在1、2、4、6、8、12小时内进样记录分析峰面积；取同一批苦丁茶，制成供试品溶液，平行制备6份，进样计算含量，结果见表2。
2.4.3加样回收率试验
取6份苦丁茶细粉0.1g，精密称定，分别精密加入一定质量浓度的混合对照品溶液，自加入20.0ml甲醇按“供试品溶液制备”项下操作，即得，进样分析后计算待测成分的加样回收率，结果见表2。
表2.精密度、重复性、稳定性、加样回收率考察结果
2.5相对校正因子
2.5.1相对校正因子的测定
在线性范围内，苦丁茶中成分的量与检测器的响应成正比，芦丁、异绿原酸A和苦丁冬青甙A为内参物，计算芦丁(R4)对6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃(R1)、羟基酪醇葡萄糖苷(R2)、原儿茶酸(R3)、苦丁冬青甙E(R5)、苦丁冬青甙D(R6)，异绿原酸A(C6)对新绿原酸(C1)、绿原酸(C2)、隐绿原酸(C3)、咖啡酸(C4)、异绿原酸B(C5)、异绿原酸C(C7)，以及苦丁冬青甙A(K3)对大叶冬青苷G(K1)、苦丁冬青甙G(K2)、苦丁茶冬青苷T(K4)和大叶冬青苷H(K5)的相对校正因子，根据校正因子(RCF，f)的计算公式：
RCF x = f x f i = A x / C x A i / C i - - - ( 1 )
C x = C i RCF x × A x A i - - - ( 2 )
C x × RCF x = A x ( A i / C i ) - - - ( 3 )
其中Ax为内参物对照品峰面积，Cx为内参物对照品浓度，Ai为待测成分对照品峰面积；Ci为待测成分对照品浓度。
试验得到芦丁对6-羟基-7,7a-二氢-2(6H)-苯并呋喃、羟基酪醇葡萄糖苷、原儿茶酸、苦丁冬青甙E、苦丁冬青甙D，异绿原酸A对新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸C以及苦丁冬青甙A对大叶冬青苷G、苦丁冬青甙G、苦丁茶冬青苷T和大叶冬青苷H的相对校正因子，分别为3.194、1.680、1.570、1.039、1.066；0.775、0.836、0.709、1.753、1.731、1.280以及0.423、0.137、0.635、0.349。
2.5.2耐用性和系统适用性评价
(1)温度对RCFx的影响
采用Waters高效液相色谱系统和Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色谱柱，分别考察了不同柱温(25℃，28℃，30℃)对供试品溶液待测成分相对校正因子的影响，结果待测成分相对校正因子RSD<5.31％，表明柱温对各成分RCFx无显著影响，结果见表3。
表3 不同柱温对校正因子的影响
(2)流速对RCFx的影响
采用Waters高效液相色谱系统和Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色谱柱，分别考察了流动相不同流速(0.8ml/min，0.9ml/min，1.0ml/min)对供试品溶液中待测成分相对校正因子的影响，结果待测成分的相对校正因子RSD<6.24％，表明流速对各成分f无显著影响，结果见表4。
表4 不同流速对校正因子的影响
(3)不同仪器对RCFx的影响
采用WatersE2695、Agilent 1260、Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪和Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色谱柱，考察不同仪器对待测成分相对校正因子的影响，结果整体相对校正因子RSD<5.17％，不同仪器对相对校正因子无显著影响，结果见表5。
表5 不同仪器对校正因子的影响
(4)不同色谱柱对对RCFx的影响
采用Waters高效液相色谱系统和Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色谱柱，Waters Symmetry C18色谱柱and ACCHROM C18色谱柱来考察色谱柱对供试品溶液中待测成分校正因子的影响，结果整体待测成分相对校正因子的RSD<4.86％,表明色谱柱对相对校正因子无显著影响，结果见表6。
表6 色谱柱对相对校正因子的影响
2.6待测组分色谱峰定位
试验中应用Waters Alliance高效液相色谱仪，Agilent 1260高效液相色谱仪，Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪，Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色谱柱，WatersSymmetry C18色谱柱and ACCHROM C18色谱柱来考察了保留时间差和相对保留值的重现性，结果表明采用相对保留值波动较小，因此采用相对保留值法对供试品溶液中待测成分进行色谱峰定位。相对保留值指各待测成分与内参物s之间保留时间的比值，计算公式：ras＝tRa/tRs。(tRa待测成分保留时间，tRs内参物保留时间)
结果待测成分的相对保留值RSD<5％，表明次色谱条件下利用相对保留值对色谱峰定位可行，结果见表7、表8。
表7 QAMS法待测成分色谱峰定位-色谱柱
表8 QAMS法待测成分色谱峰定位-仪器
2.7一测多评法与外表法结果比较
采用外标法(ES)和一测多评法(QAMS)计算待测物成分的含量，结果见表9和表10，显示采用两种方法所得含量无显著差异。注：SMD＝(CQAMS-CES)/CQAMS
表9 一测多评法与外标法结果比较
表10
2.8主成分分析、聚类分析与相似度评价
将15个不同来源计算得到的18个化合物含量信息导入SPSS19.0中，进行聚类分析和主成份分析。结果见图5，表11。
结果显示：1号药材表现出明显的差异性，被单独聚为一类，与各类组分含量总和计算结果相一致；其余14批药材相似度较高，被聚为一类。
采用欧式距离法，可以看到不同产地的苦丁茶相似度≥0.90，1号药材的相似度为0.90，其余产地相似度在0.95以上，1号药材在总体相对一致的趋势下表现出比较明显的差异性。
表11 15批苦丁茶样品的相似度分析结果
3.小结
3.1一测多评法待测峰的定位
一测多评是利用一定线性范围内成分的量与检测器响应成正比的原理，通过测定一个成分实现多个成分的同步测定，能够缓解中药多成分定量中存在的对照品缺乏问题，同时还可以实现多指标同步质量控制。待测成分色谱峰的定位是应用一测多评法的前提，本实验表明采用相对保留值法进行色谱峰的定位较为可行。
3.2相对校正因子重现性
本实验考察了不同柱温、不同流速，不同色谱柱和不同仪器对f的影响，结果表明，相对校正因子有较好的重现性。一测多评法与外标法测得的含量基本一致表明QAMS法较为准确可行，可以对苦丁茶中多成分进行定量测定。
3.3相似度分析
试验中聚类分析、主成分分析和相似度分析结果一致，表明相似度分析方法稳定，可行。采用一测多评法测得的成分含量的同时，也可对药材的相似性进行分析，方法方便、快捷，可以用于苦丁茶质量的综合控制手段。

Claims (6)

1.一种可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价的质量控制方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.色谱条件：
柱温：30℃；
检测波长：210nm，260nm，326nm；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl；
流动相：A为0.05% 磷酸-H2O，B为乙腈，C为甲醇；
S2.对照品溶液的制备：
称取芦丁、异绿原酸A和苦丁冬青甙A标准品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成含芦丁、异绿原酸A 和苦丁冬青甙A的混合对照品溶液，绘制标准曲线；
S3.供试品溶液的制备：
精密称定苦丁茶细粉，甲醇室温浸渍后冰浴超声提取，0.45μm滤过，即得供试品溶液；
S4.成分含量计算：
进样供试品溶液，记录苦丁茶中18个组分在相应波长处的峰面积，用标准曲线计算出三个内参物的浓度，再结合相对校正因子RCFx按下式即可计算出其他15种组分的浓度，继而计算出其在苦丁茶中的含量：
待测组分的浓度由下式计算得出：
其中，Ax为内参物对照品峰面积，Ai为待测成分对照品峰面积；Ci为待测成分对照品浓度；
每个组分所对应的RCFx分别为：
6-羟基-7,7a-二氢-2（6H）-苯并呋喃 3.194
羟基酪醇葡萄糖苷 1.68
原儿茶酸 1.57
新绿原酸 0.775
绿原酸 0.836
隐绿原酸 0.709
咖啡酸 1.753
异绿原酸B 1.731
异绿原酸C 1.28
大叶冬青苷G 0.423
苦丁冬青甙G 0.137
苦丁冬青甙E 1.039
苦丁冬青甙D 1.066
苦丁茶冬青苷T 0.635
大叶冬青苷H 0.349。
2.根据权利要求1所述的可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价的质量控制方法，其特征在于，步骤S1所述色谱条件为：
色谱柱：Phenomenex Synergi Hydro-RPC18 columns，4.6mm×250mm, 5μm；
柱温：30℃；
检测波长：210nm，254nm，326nm；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl；
流动相：A为0.05% 磷酸-H2O，B为乙腈，C为甲醇，按下面进行梯度洗脱：
时间0.0 min，A相94%，B相6%；
时间5min，A相94%，B相6%；
时间15min，A相88%，B相12%；
时间25min，A相84%，B相16%；
时间26min，A相77%，B相20%，C相3%；
时间45min，A相77%，B相20%，C相3%；
时间50min，A相74%，B相26%；
时间70min，A相74%，B相26%；
时间85min，A相71%，B相29%；
时间110min，A相54%，B相46%；
时间110.01min，A相10%，B相90%；
时间120min，A相10%，B相90%。
3.根据权利要求1所述的可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价的质量控制方法，其特征在于，步骤S2所述对照品溶液的制备方法为：称取芦丁、异绿原酸A和苦丁冬青甙A标准品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成含芦丁100.0 μg·ml-1，异绿原酸A1000 μg·ml-1、苦丁冬青甙A 1000 μg·ml-1、的混合对照品溶液；以此作为标准曲线的最高浓度，分别稀释2、4、8和20倍，用作绘制标准曲线。
4.根据权利要求1所述的可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价的质量控制方法，其特征在于，步骤S3所述供试品溶液的制备方法为：取苦丁茶细粉0.2g，精密称定，20.0ml甲醇室温浸渍30min；冰浴超声提取30min，放冷至室温，补足重量，摇匀，0.45μm滤过，即得供试品溶液。
5.根据权利要求1所述的可同时实现苦丁茶中18个组份的含量分析和相似度评价的质量控制方法，其特征在于，步骤S4所述苦丁茶中18个组分在相应波长处是指：
260nm，以芦丁为内参物，对应：6-羟基-7,7a-二氢-2（6H）-苯并呋喃，相对保留时间0.3253；羟基酪醇葡萄糖苷，相对保留时间0.385；原儿茶酸，相对保留时间0.420；苦丁冬青甙E，相对保留时间3.026；苦丁冬青甙D，相对保留时间3.116；
210nm，以苦丁冬青甙A为内参物，对应：大叶冬青苷G，相对保留时间0.803；苦丁冬青甙G，相对保留时间0.912；苦丁茶冬青苷T，相对保留时间1.208；大叶冬青苷H，相对保留时间1.215；
326nm，以异绿原酸A为内参物，对应：新绿原酸，相对保留时间0.401；绿原酸，相对保留时间0.551；隐绿原酸，相对保留时间0.574；咖啡酸，相对保留时间0.629；异绿原酸B，相对保留时间0.948；异绿原酸C，相对保留时间1.105。
6.权利要求1～5任一所述的方法在苦丁茶的质量控制方面的应用。
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