CN110455934A - 一种金樱根指纹图谱的建立方法及金樱根的质量检测方法 - Google Patents

一种金樱根指纹图谱的建立方法及金樱根的质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金樱根指纹图谱的建立方法及金樱根的质量检测方法。所述构建方法包括供试品溶液制备和经HPLC分析检测过程，即可得到所述金樱根指纹图谱。本发明通过大量实验摸索得到的构建方法，操作简单、供试品溶液制备耗时短、精密度好、重复性好、稳定性好、特征峰多、检测准确可靠，可用于金樱根药材的质量检测，为药品生产及检测提供了质量控制的高标准，以确保产品质量的稳定性，保证药品使用的安全有效。同时，刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸和委陵菜酸均为金樱根中的重要三萜类活性成分，对于金樱根的药效影响较大，可通过检测金樱根中这5种重要三萜类活性成分含量，控制其含量，从而达到控制金樱根药材的质量和药效。

Description

一种金樱根指纹图谱的建立方法及金樱根的质量检测方法
技术领域
本发明涉及中药材分析领域，更具体地，涉及一种金樱根指纹图谱的建立方法及金樱根的质量检测方法。
背景技术
金樱根别名金樱蔃、脱骨丹等，为双子叶蔷薇科植物金樱子RosalaevigataMichx.的根，始见于《日华子本草》，其载“金樱东行根，平，无毒。治寸白虫，止泻血及崩中带下”。其味苦、酸、涩，平。归脾、肝、肾经，具有清热利湿、解毒消肿、活血止血，收敛固涩的作用。金樱根中主要含有三萜、黄酮、鞣质类成分，可治疗遗精、遗尿、痢疾泄泻、崩漏带下、子宫脱垂、痔疮、烫伤等，为妇科千金片、金鸡胶囊及广东凉茶等临床常用中药和凉茶中的主要药物。
金樱子可药食两用，在保健食品及饮品方面有较大的开发价值，为固阴养阴之佳品，但有实火，邪热者忌服，明·缪希雍《本草经疏》：泄泻由于火热暴注者，不宜用；小便不禁及精气滑脱，因于阴虚火炽而得者，不宜用。在药用方面，金樱根主要入复方用药，广泛应用于临床，主要用于治疗前列腺炎、妇科疾病、遗精遗尿、泌尿系统感染、烧烫伤等疾病，在妇科千金片、三金片、金鸡胶囊及其片剂等畅销中成药中用量较大。
因金樱子是蔓生植物，茎部相对根部较多，随着市场上需求量的增大，金樱根的实际来源为蔷薇属多种植物的根并伴有大量茎的混入，因此其质量参差不齐。但至今尚未见完善的金樱根的质量控制标准，尤其是缺乏活性成分的定性和含量测定标准。而现行标准对金樱根质量控制相对薄弱，2015版《中国药典》第四部中仅收录了金樱根基原为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigataMichaux、小果蔷薇Rosa cymosaTratt.和粉团蔷薇Rosa.multifloraThunb.var.cathayensis Rehd.et Wils.的干燥根。两广的中药材标准中仅规定了金樱根性状、粉末和薄层鉴别标准，《湖南省中药材标准》中规定金樱根药材中茎的含量不得过40％，水分不得过14.0％，总灰分不得过6.0％，酸不溶性灰分不得过1.5％，70％乙醇浸出物(热浸法)含量不得少于10.0％。由此可见，金樱根的质量控制较为欠缺，因此为保证金樱根药材及其制剂的临床疗效，对其有效成分建立其恰当的质量控制标准、含量控制的方法是十分必要的。
目前有相关文献报道了金樱根中的部分成分的HPLC检测方法，但通常都是针对特定成分的单一组分或较少组分的同时检测，难以保证同时多种成分的准确检测，且检测结果中特征峰少等缺点，因此，有必要提供一种可快速、简单、准确且稳定建立金樱根的标准指纹图谱。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的金樱根的质量参差不齐、且质量控制相对薄弱，导致金樱根药材药效差异较大的问题，提供一种金樱根指纹图谱的建立方法。本发明所述金樱根指纹图谱的建立方法操作简单、供试品溶液制备耗时短、精密度好、重复性好、稳定性好、特征峰多、检测准确可靠，可用于金樱根药材的质量检测，为药品生产及检测提供了质量控制的高标准，以确保产品质量的稳定性，保证药品使用的安全有效。
本发明的另一目的在于提供一种金樱根指纹图谱。
本发明的再一目的在于提供上述方法建立的金樱根指纹图谱在金樱根质量检测方面的应用。
本发明的还一目的在于提供一种金樱根的质量检测方法。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种金樱根指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
S1.供试品溶液制备：用体积分数为80～100％的甲醇浸泡并加热回流提取，过滤后即得供试品溶液；
S2.HPLC分析的色谱条件：将S1所得供试品溶液经HPLC技术进行检测，检测过程中：色谱柱为ACE Excel 3 C18-PFP(150mm×4.6mm，3μm)；柱温25～35℃；流速为1.0mL/min；检测波长为210nm；流动相A为甲醇，流动相B为乙腈，流动相C为0.1％磷酸水溶液，以流动相A-B-C进行梯度洗脱；
在梯度洗脱过程中，流动相的比例持续性的变化，具体变化节点为：开始洗脱时，流动相的体积比为A:B:C＝5:15:80；第10min时，流动相体积比变为A:B:C＝5:23:72；在第55min时，流动相体积比为A:B:C＝5:35:60；在第62min时，流动相的体积比为A:B:C＝5:39:56；在第65min时，流动相体积比为A:B:C＝5:43:52；在第80min时，流动相体积比为A:B:C＝5:55:40；在第90min时，流动相体积比为A:B:C＝5:70:25，持续洗脱至结束；即可得到金樱根指纹图谱。
在指纹图谱的建立方法中，为了使操作更为简便，耗时更短，并使指纹图谱中的各特征峰具有较好的分离度、峰形，同时需要合理的控制指纹图谱的检测时间，对于供试品的制备方法和梯度洗脱条件的选择至关重要。同时，又由于不同的中药材中的化学成分千差万别，不同的药材及制剂的提取条件及指纹图谱的洗脱条件相互之间并无参考价值，供试品制备条件的选择，不仅影响着指纹图谱的峰的多少，同时也对整个指纹图谱操作过程的耗时长短具有很大的影响，且流动相比例的微小变化都会对指纹图谱造成很大的影响，如会影响特征峰的分离度和峰形。因此，发明人对于对供试品制备方法和梯度洗脱条件进行大量的试验摸索，最终确定了上述供试品制备方法和梯度洗脱条件。
金樱根还含有大量的鞣质类成分，其紫外吸收强，对三萜类成分的检测存在一定的干扰。因此，在供试品溶液制备过程中，本发明在研究初期考察了利用明胶、大孔树脂、C18固相萃取小柱等方法对样品进行前处理，虽然去除鞣质的效果明显，但都导致部分成分有所损失，并不适用于含量测定的建立，因此最后选择了直接放大图谱的方式。
金樱根中主要活性成分为三萜类化合物，且三萜类成分化学结构多样且类似，使其同时检测时难以很好的分离开，也无法准确的计算各种组分的含量，无法得到准确、有效的图谱；同时三萜类化合物的紫外吸收较弱，容易受到紫外吸收强的鞣质类成分的干扰，因此本发明综合各方面的因素，选择ACE Excel 3 C18-PFP为色谱柱，同时对于流动相的种类和比例进行了大量的摸索和调整，最终试验得到流动相的梯度洗脱变化过程，可以很好的分离各种组分，同时检测得到的特征峰数量较多，保证了检测结果的准确。
本发明所述构建方法可快速、准确地鉴别产品的质量优劣，具有操作简便、耗时短、稳定、精密度高、重复性好等优点。利用该构建方法检测到的金樱根HPLC指纹图谱化学成分峰相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。
优选地，步骤S1中所述金樱根药粉与80～100％的甲醇的质量体积比为1:50。
优选地，步骤S1中金樱根提取采用的溶剂为100％甲醇。
优选地，步骤S1中所述加热回流的时间为0.5～1.5h；更优选地，所述加热回流的时间为1h。
优选地，供试品溶液制备的具体过程为：取金樱根药粉，按质量体积比为1:50加入甲醇，加热回流提取，冷却后用甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液。
在步骤S2检测过程中，可以刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸、冬青苷B、24-deoxy-sericoside、2-氧代-坡模醇酸、坡模醇酸或熊果酸中的一种或多种的甲醇溶液为对照样品进行检测。
优选地，步骤S2中所述柱温为30℃。
本发明通过上述建立方法得到的金樱根指纹图谱中，有16个共有峰，与对照品比较，指认了其中10个共有峰，分别为刺梨苷、24-deoxy-sericoside、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸、冬青苷B、2-氧代-坡模醇酸、坡模醇酸、熊果酸。
由上述建立方法所建立的金樱根指纹图谱同样也在本发明的保护范围内，所述指纹图谱由10共有峰构成，所述10共有峰的相对保留时间范围及相对标准偏差如下：
1号峰：0.372～0.374，RSD为0.28％；
2号峰：0.387～0.390，RSD为0.27％；
3号峰：0.4330～0.4333，RSD为0.29％；
4号峰：0.669～0.671，RSD为0.02％；
5号峰：1.0，RSD为0；
6号峰：1.023～1.024，RSD为0.02％；
7号峰：1.062～1.063，RSD为0.02％；
8号峰：1.205～1.206，RSD为0.04％；
9号峰：1.281～1.282，RSD为0.05％；
10号峰：1.526～1.528，RSD为0.06％。
本发明同时还保护所述金樱根指纹图谱在金樱根质量检测方面的应用。
本发明还保护一种金樱根的质量控制方法，包括如下步骤：将待检样品的HPLC检测图谱与标准指纹图谱进行对比，按中药指纹图谱相似度评价系统计算，18分钟以后的色谱图，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度应不得低于0.90，则判断为合格样品；
其中待检样品的HPLC图谱通过如下步骤获得：
S1.供试品溶液制备：取金樱根药粉，用体积分数为80～100％的甲醇浸泡并加热回流提取，过滤后即得供试品溶液；
S2.HPLC分析的色谱条件：将S1所得供试品溶液经HPLC技术进行检测，检测过程中：色谱柱为ACE Excel 3 C18-PFP(150mm×4.6mm，3μm)；柱温25～35℃；流速为1.0mL/min；检测波长为210nm；流动相A为甲醇，流动相B为乙腈，流动相C为0.1％磷酸水溶液，以流动相A-B-C进行梯度洗脱；
在梯度洗脱过程中，流动相的比例持续性的变化，具体变化节点为：开始洗脱时，流动相的体积比为A:B:C＝5:15:80；第10min时，流动相体积比变为A:B:C＝5:23:72；在第23min时，流动相体积比为A:B:C＝5:35:60；在第62min时，流动相的体积比为A:B:C＝5:39:56；在第65min时，流动相体积比为A:B:C＝5:43:52；在第80min时，流动相体积比为A:B:C＝5:55:40；在第90min时，流动相体积比为A:B:C＝5:70:25，持续洗脱至结束；即可得到金樱根指纹图谱。
优选地，当供试品溶液中刺梨苷的含量为1.19～3.86mg/g、野蔷薇苷的含量为0.99～5.89mg/g、千花木酸的含量为0.72～2.02mg/g、蔷薇酸的含量为2.52～5.82mg/g和委陵菜酸的含量为1.36～2.85mg/g时，则为合格样品。
更优选地，以干燥品计，所述金樱根药粉中刺梨苷含量不得低于0.9mg/g、野蔷薇苷不得低于0.8mg/g、千花木酸不得低于0.5mg/g、蔷薇酸不得低于2mg/g、委陵菜酸不得低于1.1mg/g。
优选地，以干燥品计，所述金樱根的水分不超过其质量的12％；总灰分不超过其质量的5％，50％乙醇浸出物不低于其质量的10％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过大量实验摸索得到的构建方法，操作简单、供试品溶液制备耗时短、精密度好、重复性好、稳定性好、特征峰多、检测准确可靠，可用于金樱根药材的质量监控，为药品生产及检测提供了质量控制的高标准，以确保产品质量的稳定性，保证药品使用的安全有效。
同时，刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸和委陵菜酸均为金樱根中的重要三萜类活性成分，且相较于其他的活性成分，其含量也较多，对于金樱根的药效影响较大，因此可通过检测金樱根中这5种重要三萜类活性成分含量，控制其含量，从而达到控制金樱根药材的质量和药效，有利于金樱根药材的应用。
附图说明
图1为实施例1中测定金樱根的HPLC检测图谱。
图2为实施例1中20批金樱根药材HPLC色谱峰匹配图。
图3为实施例2中测定金樱根中的5种成分含量测定的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
以下实施例中所采用的金樱根样品共有20个批次，每个批次的来源、以及收集时间如表1所示。
表1金樱根样品信息
以下实施例所采用的实验仪器与试剂如下：
Ultimate 3000高效液相色谱仪，包括LPG-3400分析泵、WPS-3000SL自动进样器、TCC-300柱温箱和DAD-3000二极管阵列检测器；FW135粉碎机；XS105SB-1100型1/10万电子天平；KQ-250DB型数控超声波清洗仪；电热鼓风燥箱、电热恒温水浴锅；茂福电阻炉；分析天平、电陶炉。
去离子水，色谱甲醇和乙腈(均为分析纯)，娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯，白桦脂酸、熊果酸、蔷薇酸、委陵菜酸、千花木酸、冬青苷B、刺梨苷对照样品均为实验室分离自制，经HPLC测定纯度，核磁检测确定，纯度为＞96％。
实施例1金樱根指纹图谱的建立方法
一种金樱根指纹图谱的建立方法，具体包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：按质量体积比为1:50加入甲醇，加热回流提取，冷却后用甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液；
(2)对照品的配置
对照品为：刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸、冬青苷B、24-deoxy-sericoside、2-氧代-坡模醇酸、坡模醇酸、熊果酸。
制备过程：分别取刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mL含刺梨苷0.094mg、野蔷薇苷0.1mg、千花木酸0.11mg、蔷薇酸0.156mg、委陵菜酸0.102mg的混合溶液，即得1#混合对照品溶液。
将1#混合对照品溶液倍比稀释，得2倍、4倍和8倍，16倍，32倍稀释液，制备得2#、3#、4#、5#和6#混合对照品溶液，6#混合对照品溶液稀释5倍得7#混合对照品溶液。
取冬青苷B、24-deoxy-sericoside、2-氧代-坡模醇酸、坡模醇酸、熊果酸适量，精密称定，加入加甲醇分别制成1mL含冬青苷B 0.078mg、24-deoxy-sericoside 0.098mg、2-氧代-坡模醇酸0.166mg、坡模醇酸0.268mg、熊果酸0.194mg的单标溶液；再精密移取取1#混合对照品溶液、冬青苷B单标溶液、24-deoxy-sericoside单标溶液2mL，2-氧代-坡模醇酸、坡模醇酸、熊果酸单标溶液1mL，定容至10mL容量瓶即得8#混合对照品溶液。
(3)HPLC分析的色谱条件：将S1所得供试品溶液经HPLC技术进行检测，检测过程中：色谱柱为ACE Excel 3 C18-PFP；柱温25～35℃；流速为1mL/min；检测波长为210nm；流动相A为甲醇，流动相B为乙腈，流动相C为0.1％磷酸水溶液，以流动相A-B-C进行梯度洗脱；
在梯度洗脱过程中，流动相的比例持续性的变化，具体变化节点为：开始洗脱时，流动相的体积比为A:B:C＝5:15:80；第10min时，流动相体积比变为A:B:C＝5:23:72；在第23min时，流动相体积比为A:B:C＝5:35:60；在第62min时，流动相的体积比为A:B:C＝5:39:56；在第65min时，流动相体积比为A:B:C＝5:43:52；在第80min时，流动相体积比为A:B:C＝5:55:40；在第90min时，流动相体积比为A:B:C＝5:70:25，持续洗脱至结束；即可得到金樱根指纹图谱。
(4)共有峰的确定
按照上述试验优化后的供试品溶液制备方法制备20个批次的金樱根供试品溶液，并按照上述优化后的色谱检测条件进行检测，记录HPLC图谱，与对照样品进行比较。20个批次金樱根药材的指纹图谱中共获得16个共有峰，与对照品比较，对其中10个共有峰进行了指认，按保留时间依次分别为刺梨苷、24-deoxy-sericoside、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸、冬青苷B、2-氧代-坡模醇酸、坡模醇酸、熊果酸，图谱见图1所示(其中1～16号峰归属分别为刺梨苷(1)、24-deoxy-sericoside(2)、野蔷薇苷(3)、千花木酸(4)、蔷薇酸(7)、委陵菜酸(8)、冬青苷B(10)、2-氧代-坡模醇酸(11)、坡模醇酸(13)、熊果酸(15))。
20个批次金樱根药材的检测结果中，鉴于蔷薇酸的相对含量较高，化学结构相对稳定、保留时间居中，且在本实施例的色谱分离中，其分离度、色谱峰纯度等方面均符合含量测定的要求，因此确定以蔷薇酸(7)为参照峰，其余各共有峰的保留时间和峰面积与参照峰的比值定义为其余各峰的相对保留时间和相对峰面积。按以上方法计算20批不同产地金樱根药材的16个共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，见表2～表5。
表2 S1～S10批次金樱根药材指纹图谱共有峰的相对保留时间
表3 S11～S20批次金樱根药材指纹图谱共有峰的相对保留时间
表4 S1～S10批次金樱根药材指纹图谱共有峰的相对峰面积
表5 S11～S20批次金樱根药材指纹图谱共有峰的相对峰面积
(5)精密度试验
取金樱根药材(S10批次)约1.0g，按2)中优化后的方法制备供试品溶液，按1)中优化后的色谱检测条件连续进样6次，记录HPLC图谱。以蔷薇酸为参照峰，分别计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD。结果各共有峰相对保留时间的RSD均＜2.0％，相对峰面积的RSD均＜3.0％，测定结果符合中药指纹图谱的要求，表明仪器的精密度良好，检测结果见表6。
表6精密度试验结果
(6)稳定性试验
取金樱根药材(S10批次)约1.0g，按2)中优化后的方法制备供试品溶液，分别于供试品溶液制备后的第2、5、8、12、24、33h后，按1)中优化后的色谱检测条件连续进样，记录HPLC图谱。以蔷薇酸为参照峰，分别计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD。结果各共有峰相对保留时间的RSD均＜2.0％，相对峰面积的RSD均＜3.0％，测定结果符合中药指纹图谱的要求，表明33h内供试品溶液的稳定性良好，见表7。
表7稳定性试验结果
6)重复性试验
取金樱根药材(S10批次)约1.0g，平行6份，按2)中优化后的方法制备供试品溶液，分别按1)中优化后的色谱检测条件连续进样，记录HPLC图谱。以蔷薇酸为参照峰，分别计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD。结果各共有峰相对保留时间的RSD均＜2.0％，相对峰面积的RSD均＜3.0％，测定结果符合中药指纹图谱的要求，表明本方法的重复性良好，见表8。
表8重复性试验结果
(7)相似度评价
将所得到的20批金樱根药材HPLC色谱图的数据导入国家药典委员会“中药指纹图谱评价系统”(2004A版)，通过软件分析得到金樱根药材的HPLC指纹图谱。结果显示20批金樱根药材相似度在0.750～0.998，与对照图谱的相似度在0.913～0.992，平均相似度为0.974，RSD为2.34％，表明20批金樱根药材相似度良好，建立的金樱根药材的HPLC指纹图谱较合理，见图2和表9～表10。
表9 S1～S10批次金樱根药材指纹图谱相似度评价结果
表10 S11～S20批次金樱根药材指纹图谱相似度评价结果
综上，本实施例采用大量的试验检测和分析，20个批次金樱根样品中有16个共有峰，指认了其中10个共有峰，分别为刺梨苷、24-deoxy-sericoside、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸、冬青苷B、2-氧代-坡模醇酸、坡模醇酸、熊果酸，20批药材无明显差异，相似度均在0.9以上，同时上述方法中，供试品溶液制备耗时短、精密度好、重复性好、稳定性好、特征峰多、检测准确可靠，可用于金樱根药材的质量监控，为药品生产及检测提供了质量控制的高标准，以确保产品质量的稳定性，保证药品使用的安全有效。
实施例2金樱根成分及含量的测定
金樱根中含有的三萜类化合物种类较多，经过实施例1的测试，可知其中重要三萜类活性成分为刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸和委陵菜酸，因此，按照实施例1中确定的HPLC的检测条件测定20个批次金樱根药材中刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸的含量，用以评价金樱根的质量。
1、线性关系测定
1)对照品溶液的制备
对照品为：刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸。
制备过程：分别取刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mL含刺梨苷0.094mg、野蔷薇苷0.1mg、千花木酸0.11mg、蔷薇酸0.156mg、委陵菜酸0.102mg的混合溶液，即得1#混合对照品溶液。
将1#混合对照品溶液倍比稀释，得2倍、4倍和8倍，16倍，32倍稀释液，制备得2#、3#、4#、5#和6#混合对照品溶液，6#混合对照品溶液稀释5倍得7#混合对照品溶液。
测试过程：分别精密移取上述1#～6#混合对照品溶液6μL、1#混合对照品溶液8μL、10μL注入高效液相色谱仪，测定刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸的峰面积。以测得的峰面积和被测物的量进行线性回归，得到各个成分的回归方程以及线性范围，绘制标准曲线。其线性范围上限野蔷薇苷为1#混标进样10μL的量，除野蔷薇苷外，均为1#混标进样6μL的量，线性范围下限均为6#混标进样6μL的量。
表11 5个待测成分的标准曲线及检测限、定量限测定结果
从上述结果中可知，5种成分的线性相关系数较好，可用于计算待测样品中5种成分的含量。
2)精密度试验
取金樱根药材(S10批次)约1.0g，按实施例1中第2)中优选后的方法制备供试品溶液，按实施例1中第1)优选后的方法连续进样6次，测定供试品溶液中刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸的峰面积，计算RSD。结果显示各成分峰面积的RSD分别为0.4％、0.2％、1.4％、0.4％、0.6％，表明仪器精密度良好。
3)稳定性试验
取金樱根药材(S10批次)约1.0g，按实施例1中第2)中优化后的方法制备供试品溶液，分别于供试品溶液制备后的第2、5、8、12、24、33h后，按实施例1中第1)中优化后的色谱检测条件连续进样，测定供试品溶液中刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸的峰面积，计算RSD。结果显示各成分峰面积的RSD分别为0.5％、0.6％、0.8％、0.9％、1.1％，表明33h内供试品溶液的稳定性良好。
4)重复性试验
取金樱根药材(S10批次)约1.0g，平行6份，按实施例1中第2)中优选后的方法制备供试品溶液，按实施例1中第1)优选后的方法进样，测定供试品溶液中刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸的峰面积，计算RSD。结果显示各成分含量(扣除水分后值)分别为2.63mg/g、3.10mg/g、1.27mg/g、3.96mg/g、2.10mg/g，RSD分别为0.5％、0.6％、0.8％、0.9％、1.1％，表明本方法的重复性良好。
5)加样回收实验
精密称取刺梨苷6.09mg、野蔷薇苷7.04mg、千花木酸2.09mg、蔷薇酸9.18mg、委陵菜酸4.94mg，用甲醇溶解并定容至250mL量瓶中，摇匀，记作9#混合对照品溶液，备用。
取金樱根药材粉末(S10批次)约0.25g，精密称定，分别按药材含量∶对照品大致1∶1的比例加入25mL 9#混合对照品溶液，按实施例1中第2)步优化后的方法平行制备6份，按实施例1中第1)步优化后的方法测定刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸在供试品溶液中的峰面积，计算加样回收率及RSD。结果测得各成分加样回收率的平均值分别为99.46％、101.8％、99.67％、101.9％、98.45％，RSD分别为2.6％、1.8％、2.7％、2.1％、1.0％。结果见表16。
表12加样回收实验结果(n＝6)
6)含量测定
取20批金樱根药材，分别按实施例2中第2)步优化后的方法制备供试品溶液，按实施例2中第1)步优化后的方法测定刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸的峰面积，结合标准曲线计算各个化合物含量。结果见表13。
表13 20批金樱根中5种成分的含量测定结果(以干燥品计，mg/g)
一测多评方法中，在标准曲线Y＝aX+b中，当a/b大于100时，b可以忽略不计，此时可以X＝Y/a直接计算含量。故校正因子可以二者的斜率a之比计算，公式为fi/s＝ai/as。除内参物之外的其他成分的含量计算公式为：mi＝msAx/(Asfi/s)，其中f为相对校正因子，a为斜率，m为质量，A为峰面积；s为内参物对照品，i为其他对照组分。以蔷薇酸为内参物，通过各成分的斜率比计算得刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、委陵菜酸相对于蔷薇酸的相对校正因子分别为0.766、0.791、1.024、0.984。通过此校正因子计算出的其他四个成分的含量见表13。
由表13可知，外标法和一测多评法计算所得结果的相对误差在5％以内，表明利用一测多评法计算具有较好的准确性和可行性，所得结果可靠。为节约对照品，简化检测方法，可利用蔷薇酸为内参，同步测定其余四个成分的含量。
上述测定结果中，刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸5种成分的含量，其含量范围分别为1.19～3.86mg/g、0.99～5.89mg/g、0.72～2.02mg/g、2.52～5.82mg/g、1.36～2.85mg/g。因此，暂定本品按干燥品计，刺梨苷含量不得低于0.9mg/g、野蔷薇苷不得低于0.8mg/g、千花木酸不得低于0.5mg/g、蔷薇酸不得低于2mg/g、委陵菜酸不得低于1.1mg/g。
实施例3金樱根水分、灰分和浸出物的测定
本实施例采用药典规定的方法，对20个批次的金樱根样品进行了水分、灰分和浸出物的检测，具体的检测过程如下所示。
1、水分测定
参照水分测定法(《中国药典》2015年版四部通则0832第二法)测定，具体过程为：
取金樱根药粉2g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5mm，精密称定，开启瓶盖在105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，放冷30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时，放冷，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。
根据减失的重量，计算供试品中含水量(％)。每个批次平行2份。按公式含水量(％)＝(干燥前的重量-干燥后的重量)/干燥前的重量计算结果。
测得结果如表14所示。
表14金樱根水分测定结果
从表14中可知，20个批次的金樱根样品中，以干燥品计，其水分含量在6.07％～9.57％之间，平均值为8.33％。
2、灰分测定
参照灰分测定法(《中国药典》2015年版四部通则2302)测定，具体测定过程如下：
将金樱根药材粉碎，使能通过二号筛，混合均匀后，取3g，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量(准确至0.0lg)，缓缓炽热，注意避免燃烧，至完全炭化时，逐渐升髙温度至500～600℃，使完全灰化并至恒重。根据残渣重量，计算供试品中总灰分的含量(％)。每个批次平行2份。
测定结果如表15所示。
表15金樱根灰分测定结果
从表15中可知，20个批次的金樱根样品中，以干燥品计，其总灰分含量为1.29％～3.47％，平均值为2.5％。
3、浸出物测定
参照热浸法(按《中国药典》2015年版四部通则2201第二法)测定，具体测定过程如下：
取供试品约2g，精密称定，置100mL的锥形瓶中，分别精密提取溶剂50mL，密塞，称定重量，静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量。除另有规定外，以干燥品计算供试品中浸出物的含量(％)，每个批次平行2份。
为找到合适的溶剂，在20个批次样品中随机抽取一份作为测试样品，参照上述过程进行测定，并将上述过程中的提取溶剂分别采用水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、无水乙醇进行测定，测定采用不同溶剂提取时浸出物的含量，结果如表16所示。
表16不同提取溶剂的浸出物含量
从表16中可知，以干燥品计，当提取溶剂为30％～70％乙醇时，浸出物的含量较高，其中当溶剂为50％的乙醇时，浸出物的含量最高，平均值为12.8％，故选用50％乙醇作为金樱根浸出物的提取溶剂，参照上述方法测定20个批次的浸出物含量，测得结果如表17所示。
表17浸出物含量测定结果
从表17中可知，以干燥品计，当提取溶剂为50％乙醇时，20个批次的金樱根样品中，其浸出物含量为13.58％～25.18％，平均值为20.77％。
通过上述测定，20批金樱根药材中水分含量在6.07％～9.57％之间，平均值为8.33％；总灰分范围1.29％～3.47％，平均值为2.5％；50％乙醇浸出物13.58％～25.18％，平均值为20.77％。基于上述测定结果，考虑到药材样本及差异，建议规定金樱根中水分不超过12％；总灰分不超过5％；50％乙醇浸出物不低于10％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种金樱根指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.供试品溶液制备：取金樱根药粉，用体积分数为80～100％的甲醇浸泡并加热回流提取，过滤后即得供试品溶液；
S2.HPLC分析的色谱条件：将S1所得供试品溶液经HPLC技术进行检测，检测过程中：色谱柱为ACE Excel 3 C18-PFP；柱温25～35℃；流速为1.0mL/min；检测波长为210nm；流动相A为甲醇，流动相B为乙腈，流动相C为0.1％磷酸水溶液，以流动相A-B-C进行梯度洗脱；
在梯度洗脱过程中，流动相的比例持续性的变化，具体变化节点为：开始洗脱时，流动相的体积比为A:B:C＝5:15:80；第10min时，流动相体积比变为A:B:C＝5:23:72；在第55min时，流动相体积比为A:B:C＝5:35:60；在第62min时，流动相的体积比为A:B:C＝5:39:56；在第65min时，流动相体积比为A:B:C＝5:43:52；在第80min时，流动相体积比为A:B:C＝5:55:40；在第90min时，流动相体积比为A:B:C＝5:70:25，持续洗脱至结束；即可得到金樱根指纹图谱。
2.根据权利要求1所述金樱根指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤S1中所述金樱根药粉与80～100％的甲醇的质量体积比为1:40～60；步骤S1中所述加热回流的时间为0.5～1.5h。
3.根据权利要求1所述金樱根指纹图谱的建立方法，其特征在于，在步骤S2检测过程中，可以刺梨苷、野蔷薇苷、千花木酸、蔷薇酸、委陵菜酸、冬青苷B、24-deoxy-sericoside、2-氧代-坡模醇酸、坡模醇酸或熊果酸中的一种或多种的甲醇溶液为对照样品进行检测。
4.根据权利要求1所述金樱根指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤S2中所述柱温为30℃。
5.一种权利要求1至4任一所述建立方法所建立的金樱根指纹图谱，其特征在于，所述指纹图谱由10共有峰构成，所述10共有峰的相对保留时间范围及相对标准偏差如下：
1号峰：0.372～0.374，RSD为0.28％；
2号峰：0.387～0.390，RSD为0.27％；
3号峰：0.4330～0.4333，RSD为0.29％；
4号峰：0.669～0.671，RSD为0.02％；
5号峰：1.0，RSD为0；
6号峰：1.023～1.024，RSD为0.02％；
7号峰：1.062～1.063，RSD为0.02％；
8号峰：1.205～1.206，RSD为0.04％；
9号峰：1.281～1.282，RSD为0.05％；
10号峰：1.526～1.528，RSD为0.06％。
6.权利要求5所述金樱根指纹图谱在金樱根质量检测方面的应用。
7.一种金樱根的质量控制方法，其特征在于，包括如下步骤：将待检样品的HPLC检测图谱与标准指纹图谱进行对比，按中药指纹图谱相似度评价系统计算，18分钟以后的色谱图，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度应不得低于0.90，则判断为合格样品；
其中待检样品的HPLC图谱通过如下步骤获得：
S1.供试品溶液制备：取金樱根药粉，用体积分数为80～100％的甲醇浸泡并加热回流提取，过滤后即得供试品溶液；
S2.HPLC分析的色谱条件：将S1所得供试品溶液经HPLC技术进行检测，检测过程中：色谱柱为ACE Excel 3 C18-PFP；柱温25～35℃；流速为1.0mL/min；检测波长为210nm；流动相A为甲醇，流动相B为乙腈，流动相C为0.1％磷酸水溶液，以流动相A-B-C进行梯度洗脱；
在梯度洗脱过程中，流动相的比例持续性的变化，具体变化节点为：开始洗脱时，流动相的体积比为A:B:C＝5:15:80；第10min时，流动相体积比变为A:B:C＝5:23:72；在第55min时，流动相体积比为A:B:C＝5:35:60；在第62min时，流动相的体积比为A:B:C＝5:39:56；在第65min时，流动相体积比为A:B:C＝5:43:52；在第80min时，流动相体积比为A:B:C＝5:55:40；在第90min时，流动相体积比为A:B:C＝5:70:25，持续洗脱至结束；即可得到金樱根指纹图谱。
8.根据权利要求7所述金樱根的质量控制方法，其特征在于，当供试品溶液中刺梨苷的含量为1.19～3.86mg/g、野蔷薇苷的含量为0.99～5.89mg/g、千花木酸的含量为0.72～2.02mg/g、蔷薇酸的含量为2.52～5.82mg/g和委陵菜酸的含量为1.36～2.85mg/g时，则为合格样品。
9.根据权利要求7所述金樱根的质量控制方法，其特征在于，以干燥品计，所述金樱根药粉中刺梨苷含量不得低于0.9mg/g、野蔷薇苷不得低于0.8mg/g、千花木酸不得低于0.5mg/g、蔷薇酸不得低于2mg/g、委陵菜酸不得低于1.1mg/g。
10.根据权利要求7所述金樱根的质量控制方法，其特征在于，以干燥品计，所述金樱根的水分不超过其质量的12％；总灰分不超过其质量的5％，50％乙醇浸出物不低于其质量的10％。
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