CN104535676B

CN104535676B - 葎草药材hplc指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

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Publication number: CN104535676B
Application number: CN201410797690.8A
Authority: CN
Inventors: 朱红霞; 李慧; 刘强
Original assignee: TCM-INTEGRATED HOSPITAL OF SOUTHERN MEDICAL UNIVERSITY
Current assignee: TCM-INTEGRATED HOSPITAL OF SOUTHERN MEDICAL UNIVERSITY
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2034-12-18
Also published as: CN104535676A

Abstract

本发明公开了一种葎草药材HPLC指纹图谱的建立方法，包括步骤为：含有大波斯菊苷、牡荆素、木犀草素、芹菜素的对照品溶液的制备；葎草药材供试品溶液的制备；按照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。本发明所建立的葎草药材HPLC标准指纹图谱能有效地表征葎草药材的质量，有利于全面监控药材的质量，可应用于葎草药材的真伪鉴别、基源鉴别，为葎草药材的质量控制、临床正确使用提供依据，为建立规范化的葎草种植基地提供有效的质量控制和品种选育手段。

Description

葎草药材HPLC指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

技术领域

本发明涉及中药药材的质量控制方法，具体涉及葎草药材高效液相色谱法指纹图谱的构建方法和标准指纹图谱。

背景技术

葎草为桑科葎草属植物葎草Humulus scandens(Lour.)Merr.的全草。甘、苦，寒。功效清热解毒，利尿消肿。用于肺结核潮热，肠胃炎，痢疾，感冒发热，小便不利，肾盂肾炎，急性肾炎，膀胱炎，泌尿系结石；外用治痈疖肿毒，湿疹，毒蛇咬伤。用葎草外洗方法治疗婴幼儿腹泻86例，痊愈85例(症状和体征消失，大便1次，质成形)。此外，葎草口服可以治疗痢疾，沐足可以治疗慢性结肠炎。葎草目前的研究与开发，在化学成分主要集中黄酮类成分及多糖类成分的提取、分离方面，在开发方面主要集中在饲料添加剂的开发方面。为保证和提高药材质量，促进中药标准化，应该对质量标准进行提高，建立多成分控制的指纹图谱技术控制药材质量，为临床用药的安全、有效提供准确可靠的依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葎草药材HPLC指纹图谱的建立方法，为葎草药材的质量控制和真伪鉴别提供一个新的方法，通过建立葎草药材指纹图谱的方法，并由此方法得到葎草药材共有模式的指纹图谱。

为达到本发明的目的所采用的技术方案是：一种葎草药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于包括如下步骤：

①对照品溶液的制备取大波斯菊苷对照品、牡荆素对照品、木犀草素对照品、芹菜素对照品，精密称定，加甲醇制成各对照品的混合溶液；

②供试品溶液的制备精密称定葎草药材粉末，精密加入70％乙醇，摇匀，滤过，作为供试品溶液；

③测定精密吸取供试品溶液、对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱，其中测定使色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲醇-磷酸组成的梯度洗脱液，紫外检测波长为300～370nm。

所述的步骤①中，取大波斯菊苷对照品、牡荆素对照品、木犀草素对照品、芹菜素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含大波斯菊苷对照品0.0169mg、牡荆素对照品0.00836mg、木犀草素对照品0.01032mg、芹菜素对照品0.00904mg的混合溶液。

所述的步骤②中，取葎草药材粉末1.0g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇20mL,称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为样品溶液；

所述的步骤③中，色谱条件为：Agilent HC C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％磷酸溶液，进行梯度洗脱条件；检测波长为340nm，流速为1.0mL·min^-1，柱温为35℃，进样量10μL。

所述的梯度洗脱条件为：

0min时，流动相A：流动相B＝10:90

5min时，流动相A：流动相B＝25:75

15min时，流动相A：流动相B＝30:70

20min时，流动相A：流动相B＝33:67

28min时，流动相A：流动相B＝35:65

30min时，流动相A：流动相B＝40:60

42min时，流动相A：流动相B＝42:68

47min时，流动相A：流动相B＝45:55

80min时，流动相A：流动相B＝45:55。

所述的指纹图谱标记出15个峰，其中7号峰为牡荆素峰，11号峰为大波斯菊苷峰并记为参照峰(S)，14号峰为木犀草素峰，15号峰为芹菜素峰。

由上述建立方法得到的葎草药材HPLC标准指纹图谱。

所述的葎草药材HPLC标准指纹图谱应用于葎草药材的真伪鉴别、基源鉴别。

本发明的有益效果如下：

(1)用本发明所提供的方法所建立的HPLC指纹图谱，能有效地表征葎草药材的质量，有利于全面监控药材的质量。同时本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

(2)综合运用了指纹图谱的共有峰比较、聚类分析和特有峰分析等方法对三个品种葎草HPLC指纹图谱进行鉴别，实现对葎草药材的基源鉴别，为葎草药材的质量控制、临床正确使用提供依据，为建立规范化的葎草种植基地提供有效的质量控制和品种选育手段。

附图说明

图1是本发明葎草的HPLC指纹图谱；

图2是本发明对照品溶液HPLC色谱图；

图3是本发明10批葎草药材的指纹图谱；

图4是本发明葎草药材指纹图谱共有模式。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点与精神，藉由以下结合附图与具体实施方式对本发明的详述得到进一步的了解。

本发明是一种葎草药材HPLC指纹图谱的建立方法，其包括如下步骤：

①对照品溶液的制备取大波斯菊苷对照品、牡荆素对照品、木犀草素对照品、芹菜素对照品，精密称定，加甲醇制成各对照品的混合溶液。优选的，加甲醇制成每1mL含大波斯菊苷对照品0.0169mg、牡荆素对照品0.00836mg、木犀草素对照品0.01032mg、芹菜素对照品0.00904mg的混合溶液。

②供试品溶液的制备精密称定葎草药材粉末，精密加入70％乙醇，摇匀，滤过，作为供试品溶液。优选的，取葎草药材粉末1.0g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇20mL，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为样品溶液；

③测定精密吸取供试品溶液、对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱，其中测定使色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲醇-磷酸组成的梯度洗脱液，紫外检测波长为300～370nm。优选的色谱条件为：Agilent HC C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％磷酸溶液，进行梯度洗脱条件；检测波长为340nm，流速为1.0mL·min^-1，柱温为35℃，进样量10μL。更优选的，梯度洗脱条件为：

0min时，流动相A：流动相B＝10:90

5min时，流动相A：流动相B＝25:75

15min时，流动相A：流动相B＝30:70

20min时，流动相A：流动相B＝33:67

28min时，流动相A：流动相B＝35:65

30min时，流动相A：流动相B＝40:60

42min时，流动相A：流动相B＝42:68

47min时，流动相A：流动相B＝45:55

80min时，流动相A：流动相B＝45:55。

所得指纹图谱标记出15个峰，其中7号峰为牡荆素峰，11号峰为大波斯菊苷峰并记为参照峰(S)，14号峰为木犀草素峰，15号峰为芹菜素峰。

本发明的原理是从葎草的指纹图谱研究发现，其指纹图谱能从色谱的整体面貌上体现出不同种葎草药材的化学成分含量情况。用本方法测定从市面上收集的葎草药材均能得到相同、相近似的指纹图谱。由上述建立方法得到的葎草药材HPLC标准指纹图谱，可应用于葎草药材的质量监控、真伪鉴别、基源鉴别。

实施例1 葎草HPLC指纹图谱建立的方法学考查

1.实验材料

1.1实验仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪(真空脱气机、四元泵、二极管阵列检测器、自动进样器、智能恒温柱温箱、ChemStation化学工作站)；紫外-可见光分光光度仪；BP110S型电子天平；CP2250型电子天平；超声波清洗器。

1.2试剂

大波斯菊苷对照品(中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-1313005)；牡荆素对照品(上海金穗生物科技公司，批号：20140618)；木犀草素对照品(上海金穗生物科技公司，批号：20140422)；芹菜素对照品(中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-13050505)；流动相甲醇用色谱纯；水为二重蒸馏水；其他试剂为分析纯。

2.方法与结果

2.1色谱条件Agilent HC C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流动相A为甲醇，B为0.2％磷酸溶液，梯度洗脱条件见表1；检测波长为340nm；流速为1.0mL·min^-1；柱温为35℃；进样量10μL。上述色谱条件下的对照品及葎草的色谱图见图2、图1。

表1 梯度洗脱程序

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备取大波斯菊苷对照品、牡荆素对照品、木犀草素对照品、芹菜素对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1mL含大波斯菊苷对照品0.0169mg、牡荆素对照品0.00836mg、木犀草素对照品0.01032mg、芹菜素对照品0.00904mg即得。

2.2.2供试品溶液的制备将葎草剪碎，称取样品约1g于50mL锥形瓶中，加入20mL70％乙醇称定质量，超声30min。放冷后，称重，用70％乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过。用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3.1专属性试验取空白溶剂(70％乙醇)和葎草供试品溶液各一份，按2.1项色谱条件，分别进样10μL，记录色谱图。比较两者的色谱图可知，空白溶剂对供试品溶液的测试不存在干扰，专属性良好。

2.3.2精密度试验取同一份葎草供试品溶液，连续进样6次，记录80min图谱。以大波斯菊苷峰(号峰)为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.15％，相对峰面积的RSD均小于1.68％，表明本方法精密度良好，符合指纹图谱的检测要求

2.3.3稳定性试验取同一批同一份葎草供试品溶液，在0,2,4,6,8,12,24h检测特征指纹图谱,结果各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.24％,相对峰面积的RSD均小于2.37％,表明供试品溶液在24h内稳定性良好，符合指纹图谱的检测要求。

2.3.4重复性试验平行制备同一批5份葎草供试品溶液，测定，结果各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.14％，相对峰面积的RSD均小于2.96％，表明本方法重复性良好，符合指纹图谱的检测要求。

实施例2 10批葎草药材HPLC指纹图谱的测定与数据分析

取葎草药材10批次，按实施例1条件进行检测，得10批样品的HPLC图谱。

依上述方法测定了10批不同采收时间葎草药材的指纹图谱，采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件导入10批次葎草的HPLC图谱数据，以中位数法生成对照指纹图谱的共有模式，建立对照指纹图谱。10批葎草药材的指纹图谱见图3，指纹图谱共有模式见图4。

根据10批供试品溶液HPLC指纹图谱给出的数据，比较供试品图谱，其中15个峰是各批供试品所共有的。因此，确定这15个峰为10个不同采收时间葎草药材的共有峰。经与对照品图谱(图2)比较，确定其中7号峰为牡荆素，11号峰为大波斯菊苷，14号峰为木犀草素，15号峰为芹菜素，从图1中可知大波斯菊苷的分离较好，保留时间适中，峰面积较大，因此选择11号峰(大波斯菊苷)作为参照峰(S峰)，其他特征峰依次标号为1,2……S……15。根据指纹图谱相似度评价结果得出各样品的相似度，结果见表2。结果表明，各样品相似度均大于>0.90，不同产地药材图谱具有很高的相关性，不同来源的葎草主要成分基本相同。

2.4.2葎草药材各样品指纹图谱共有峰的相对峰面积值以11号峰为参照峰，对葎草药材指纹图谱共有模式中已标定的15共有峰进行计算，各样品的指纹图谱共有峰相对峰面积值数据见表3。由表3可以看出，所建立的鹿茸草药材指纹图谱的15个共有峰非常吻合，可知10不同批次鹿茸草样品各成分的含量则存在明显差异。

以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式，于此所揭示的实施例与所有观点，应被视为用以说明本发明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以权利要求为准，并涵盖合法均等物。

Claims

1.一种葎草药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于包括如下步骤：

③测定精密吸取供试品溶液、对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱，其中测定使色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，紫外检测波长为300～370nm，流动相A为甲醇，流动相B为0.2％磷酸溶液，采用梯度洗脱条件为：

0min时，流动相A：流动相B＝10:90

5min时，流动相A：流动相B＝25:75

15min时，流动相A：流动相B＝30:70

20min时，流动相A：流动相B＝33:67

28min时，流动相A：流动相B＝35:65

30min时，流动相A：流动相B＝40:60

42min时，流动相A：流动相B＝42:68

47min时，流动相A：流动相B＝45:55

80min时，流动相A：流动相B＝45:55。

2.根据权利要求1所述的葎草药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述的步骤①中，取大波斯菊苷对照品、牡荆素对照品、木犀草素对照品、芹菜素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含大波斯菊苷对照品0.0169mg、牡荆素对照品0.00836mg、木犀草素对照品0.01032mg、芹菜素对照品0.00904mg的混合溶液。

3.根据权利要求1所述的葎草药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述的步骤②中，取葎草药材粉末1.0g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇20mL,称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为样品溶液。

4.根据权利要求1所述的葎草药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述的步骤③中，色谱条件为：规格为250mm×4.6mm，5μm的Agilent HC C₁₈色谱柱；检测波长为340nm，流速为1.0mL·min^-1，柱温为35℃，进样量10μL。

5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的葎草药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述的指纹图谱标记出15个峰，其中7号峰为牡荆素峰，11号峰为大波斯菊苷峰并记为参照峰(S)，14号峰为木犀草素峰，15号峰为芹菜素峰。

6.由权利要求1-5中任一权利要求所述建立方法得到葎草药材HPLC标准指纹图谱在葎草药材的真伪鉴别、基源鉴别中的应用。