CN112666277A - 一种香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒hplc特征图谱的构建及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建及检测方法，属于中药分析、质量鉴别及控制技术领域。在本技术方案中，基于高效液相色谱法建立特征图谱，以及根据香附中多含倍半萜等脂溶性物质，水溶性物质较少，以及通过已知成分指认，未找到已知的特征成分峰，故在新建特征图谱方法基础上，加入一种内标物芦丁作为参照物S峰来对所有特征峰进行监控，以及特定供试品溶液制备和特定色谱条件等设置，对其整体质量进行控制。本方法操作简单，具有精密度高、稳定性好、重复性好及准确度高等优势，为中药材质量鉴别提供有效依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药特征图谱的构建及检测方法，尤其涉及一种香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建及检测方法，属于中药分析、质量鉴别及控制技术领域。
背景技术
香附为莎草科植物莎草Cyperus rotundus L.的干燥根茎，具有疏肝解郁，理气宽中，调经止痛的功效。香附标准汤剂是由该药材经炮制后按固定的制备工艺水煎煮而成的冻干粉，为确保香附标准汤剂质量的均一性、稳定性，需建立一种新的特征图谱方法对其质量进行把控。
于2018年08月21日公开了一种公开号为CN108426963A，名称为“一种醋香附HPLC指纹图谱的构建方法”的专利文献，其中，具体公开：将醋香附饮片粉末以甲醇提取获得供试品溶液；以α-香附酮、香附烯酮、5-羟甲基糠醛为对照品；测定10批以上醋香附并进行分析比较，得到由12个共有特征峰构成的醋香附HPLC指纹图谱。
于20141119公开了一种公开号为CN104155399A，名称为“一种四制香附饮片的质量控制方法”的专利文献，其中，建立四制香附HPLC指纹图谱，以活性成分α-香附酮为基准峰，计算基准峰中α-香附酮的含量，其它主要活性成分的指纹峰以α-香附酮为参照，计算每个活性成分指纹峰以α-香附酮计的相对含量。本发明的方法具有可操作性，仅需用一个已知的对照品α-香附酮成分含量即可控制其他未知主要有效成分的相对含量，达到控制四制香附饮片质量的一种科学方法。
发明内容
本发明旨在克服现有技术问题的不足，而提出了一种香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建及检测方法。在本技术方案中，基于香附中多含倍半萜等脂溶性物质，水溶性物质较少，以及通过已知成分指认，未找到已知的特征成分峰，故在新建特征图谱方法基础上，加入一种内标物芦丁作为参照物S峰来对所有特征峰进行监控，从而对其整体质量进行控制。
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
一种香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
A.内标溶液的制备：取芦丁对照品，加70％甲醇溶解，制成每1mL含330μg的溶液，即得；
B.对照药材参照物溶液的制备：取香附对照药材2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对照药材提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加对照药材提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C.供试品溶液的制备：称取本品0.5～2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
D.建立：分别取所得对照药材参照物溶液和所得供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，建立HPLC特征图谱；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：325nm；
理论板数按芦丁峰计算应不低于10000；
流动相按下表进行梯度洗脱，具体为：
进一步的，所述香附药材HPLC特征图谱包括九个特征峰，其中，峰9为芦丁，并以芦丁参照物峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.272、峰2为0.455、峰3为0.493、峰4为0.544、峰5为0.637、峰6为0.844、峰7为0.887及峰8为0.920，相对保留时间在规定值的±10％之内。
进一步的，所述香附饮片HPLC特征图谱包括九个特征峰，其中，峰9为芦丁，并以芦丁参照物峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.240、峰2为0.412、峰3为0.448、峰4为0.495、峰5为0.587、峰6为0.860、峰7为0.907及峰8为0.932，相对保留时间在规定值的±10％之内。
进一步的，所述香附标准汤剂HPLC特征图谱包括九个特征峰，其中，峰9为芦丁，并以芦丁参照物峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.212、峰2为0.425、峰3为0.463、峰4为0.513、峰5为0.607、峰6为0.825、峰7为0.873及峰8为0.914，相对保留时间在规定值的±10％之内。
进一步的，所述香附配方颗粒HPLC特征图谱包括九个特征峰，其中，峰9为芦丁，并以芦丁参照物峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.210、峰2为0.420、峰3为0.456、峰4为0.511、峰5为0.606、峰6为0.821、峰7为0.871及峰8为0.913，相对保留时间在规定值的±10％之内。
一种香附标准汤剂HPLC特征图谱的检测方法，包括如下步骤：
S1.供试品溶液的制备：称取本品0.5～2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S2.检测：取经步骤S1所得供试品溶液注入至高效液相色谱仪，测定，并将所得高效液相色谱图与所得HPLC特征图谱进行比较，检测香附药材、饮片、标准汤剂或/和配方颗粒的质量及真伪；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：325nm；
理论板数按芦丁峰计算应不低于10000
流动相按下表进行梯度洗脱，具体为：
采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
在本发明中，基于高效液相法，以及特定的对照品种类、供试品溶液提取以及向匹配的色谱条件，建立特征图谱检测方法，整体控制香附标准汤剂中的特征成分，并保证色谱峰多以及理论板数、分离度、对称性均较好，特征峰信息量丰富，确保香附标准汤剂整体质量的稳定，且方法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高。
在本发明中，以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，有效保证成分峰的峰型较好，且减少拖尾，进而提高检测的准确度和稳定性。
附图说明
图1为实施例1中香附标准汤剂对照特征图谱(峰9(S)：芦丁；色谱柱：Agilent TC-C18(250×4.6mm,5μm)；
图2为实施例3中提取溶剂浓度考察结果色谱图；
图3为实施例3中提取方式考察结果色谱图；
图4为实施例3中提取时间考察结果色谱图；
图5为实施例4中流动相考察结果色谱图；
图6为实施例4中波长考察的香附标准汤剂3D色谱图；
图7为实施例4中香附标准汤剂不同波长色谱图；
图8为实施例4中流速考察结果色谱图；
图9为实施例4中柱温考察结果色谱图；
图10为实施例4中延迟性考察结果色谱图；
图11为实施例5中香附对照药材色谱图；
图12为实施例5中香附标准汤剂特征图谱色谱峰指认结果图；
图13为实施例5中中间精密度考察色谱图；
图14为实施例5中色谱柱耐用性考察色谱图；
图15为实施例5中香附标准汤剂特征图谱(一)(其中：S1(9)-S11(9)为：XFBT180801、XFBT180802、XFBT180803、XFBT180804、XFBT180805、XFBT180806、XFBT180807、XFBT180808、XFBT1809、XFBT180810、XFBT180811)；
图16为实施例5中香附标准汤剂特征图谱(二)(其中：S1(9)-S11(9)为：XFBT180812、XFBT180813、XFBT180814、XFBT180815、XFBT180816、XFBT180817、XFBT180818、XFBT180819、XFBT180820、XFBT180821、XFBT180822)；
图17为实施例5中香附标准汤剂对照特征图谱(其中，峰9(S)：芦丁)；
图18为实施例6中香附药材特征图谱(一)(其中：S1-S11为：XLS201808901、XLS201808902、XLS201808903、XLS201808904、XLS201808905、XLS201808906、XLS201808907、XLS201808908、XLS201808909、XLS201808910、XLS201808911)；
图19为实施例6中香附药材特征图谱(二)(其中：S1-S11为：XLS201808912、XLS201808913、XLS201808914、XLS201808915、XLS201808916、XLS201808917、XLS201808918、010479-1605001、010479-1606001、010479-1612001、010479-1612002)；
图20为实施例7中香附饮片特征图谱(一)(其中：S1(9)-S11(9)为：XF180801、XF180802、XF180803、XF180804、XF180805、XF180806、XF180807、XF180808、XF180809、XF180810、XF180811)；
图21为实施例7中香附饮片特征图谱(二)(其中：S1(9)-S11(9)为：XF180812、XF180813、XF180814、XF180815、XF180816、XF180817、XF180818、XF180819、XF180820、XF180821、XF180822)；
图22为实施例8中香附配方颗粒特征图谱；
图23为实施例9中香附药材、标汤、标准汤剂、配方颗粒对照特征图谱对比图(其中，峰9(S)：芦丁)。
具体实施方式
下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下实施例中，所涉及的仪器包括：
高效液相色谱仪：Waters e2695型高效液相色谱仪、Agilent 1260型高效液相色谱仪、岛津-20AD型高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：Agilent TC-C18(250×4.6mm,5μm)、Agilent SB-C18(250×4.6mm,5μm)、Kromasil(250×4.6mm,5μm)。
在以下实施例中，所涉及的试剂包括：
甲醇(色谱纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司；流动相A)、磷酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)、70％甲醇(分析纯、成都市科隆化学试剂有限公司；提取溶剂)、流动相用水为实验室自制超纯水，其余均为实验室自制纯水。
在以下实施例中，所涉及的供试品包括：
香附药材批号：XLS201808901、XLS201808902、XLS201808903、XLS201808904、XLS201808905、XLS201808906、XLS201808907、XLS201808908、XLS201808909、XLS201808910、XLS201808911、XLS201808912、XLS201808913、XLS201808914、XLS201808915、XLS201808916、XLS201808917、XLS201808918、010479-1605001、010479-1606001、010479-1612001、010479-1612002；
香附饮片批号：XF180801、XF180802、XF180803、XF180804、XF180805、XF180806、XF180807、XF180808、XF180809、XF180810、XF180811、XF180812、XF180813、XF180814、XF180815、XF180816、XF180817、XF180818、XF180819、XF180820、XF180821、XF180822；
香附标准汤剂批号：XFBT180801、XFBT180802、XFBT180803、XFBT180804、XFBT180805、XFBT180806、XFBT180807、XFBT180808、XFBT180809、XFBT180810、XFBT180811、XFBT180812、XFBT180813、XFBT180814、XFBT180815、XFBT180816、XFBT180817、XFBT180818、XFBT180819、XFBT180820、XFBT180821、XFBT180822；
香附配方颗粒批号：SY1809001、SY1809002、SY18090031。
在以下实施例中，所涉及的对照药材包括：
香附对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121059-201407)。
在以下实施例中，所涉及的对照品包括：
芦丁(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18012501)。
实施例1
一种香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
A.内标溶液的制备：取芦丁对照品，加70％甲醇溶解，制成每1mL含330μg的溶液，即得；
B.对照药材参照物溶液的制备：取香附对照药材2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对照药材提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加对照药材提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C.供试品溶液的制备，包括：
香附药材供试品溶液：称取本品粉末2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对应的供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
香附饮片供试品溶液：称取本品2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对应的供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
香附标准汤剂供试品溶液：称取本品0.5g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对应的供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
香附配方颗粒供试品溶液：称取本品0.5g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对应的供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
D.建立：分别取所得对照药材参照物溶液和所得供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，建立HPLC特征图谱；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：325nm；
理论板数按芦丁峰计算应不低于10000；
流动相按下表1进行梯度洗脱，具体为：
表1梯度洗脱
其中，香附药材HPLC特征图谱包括九个特征峰，其中，峰9为芦丁，并以芦丁参照物峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.272、峰2为0.455、峰3为0.493、峰4为0.544、峰5为0.637、峰6为0.844、峰7为0.887及峰8为0.920，相对保留时间在规定值的±10％之内。
香附饮片HPLC特征图谱包括九个特征峰，其中，峰9为芦丁，并以芦丁参照物峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.240、峰2为0.412、峰3为0.448、峰4为0.495、峰5为0.587、峰6为0.860、峰7为0.907及峰8为0.932，相对保留时间在规定值的±10％之内。
香附标准汤剂HPLC特征图谱包括九个特征峰，其中，峰9为芦丁，并以芦丁参照物峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.212、峰2为0.425、峰3为0.463、峰4为0.513、峰5为0.607、峰6为0.825、峰7为0.873及峰8为0.914，相对保留时间在规定值的±10％之内。
香附配方颗粒HPLC特征图谱包括九个特征峰，其中，峰9为芦丁，并以芦丁参照物峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.210、峰2为0.420、峰3为0.456、峰4为0.511、峰5为0.606、峰6为0.821、峰7为0.871及峰8为0.913，相对保留时间在规定值的±10％之内。
实施例2
基于实施例1，本实施例提出一种香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的检测方法，包括如下步骤：
S1.香附药材供试品溶液的制备：称取本品粉末2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对应的供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S2.香附饮片供试品溶液的制备：称取本品2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对应的供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S3.香附标准汤剂供试品溶液的制备：称取本品0.5g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对应的供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S4.香附配方颗粒供试品溶液的制备：称取本品0.5g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对应的供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S5.检测：取经步骤S1-S4所得供试品溶液分别注入至高效液相色谱仪，测定，并将所得高效液相色谱图与所得HPLC特征图谱进行比较，检测香附药材、饮片、标准汤剂或/和配方颗粒的质量及真伪；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：325nm；
理论板数按芦丁峰计算应不低于10000；
流动相按下表2进行梯度洗脱，具体为：
表2梯度洗脱
实施例3
基于实施例1-2，本实施例对供试品溶液制备中的提取溶剂浓度、提取方式、提取时间进行考察，以本技术方案作进一步的说明。
一、提取溶剂浓度考察
取香附标准汤剂(批号：XFBT180806)0.5g，三份，分别置具塞锥形瓶中，分别加入供试品提取溶剂30％甲醇25mL、50％甲醇25mL、70％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对照药材提取液，然后同实施例1中步骤操作测定，所得结果如图2所示。
结果表明：在供试品提取溶剂为70％甲醇时，对应的色谱峰信息量大，峰型和分离度均较好，因此，选择70％甲醇为香附标准汤剂特征图谱构建及检测中的供试品溶液制备的提取溶剂。
二、提取方式考察
取香附标准汤剂(批号：XFBT180806)0.5g，两份，分别置具塞锥形瓶中，均加入供试品提取溶剂70％甲醇25mL，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)45min、加热回流处理45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对照药材提取液，然后同实施例1中步骤操作测定，所得结果如图3所示。
结果表明：超声提取与加热回流提取的终效果无显著差异，故，选择操作更简便的超声处理，以为香附标准汤剂特征图谱构建及检测中的供试品溶液制备的提取方式。
三、提取时间考察
取香附标准汤剂(批号：XFBT180806)0.5g，三份，分别置具塞锥形瓶中，均加入供试品提取溶剂70％甲醇25mL，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)15min、30min、45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对照药材提取液，然后同实施例1中步骤操作测定，所得结果如图4所示。
结果表明：超声提取时间为45min时，色谱峰分离更好，故，选择45min为香附标准汤剂特征图谱构建及检测中的供试品溶液制备的提取时间。
综上所述，在供试品溶液制备中，将具体方案限定为：取本品0.5g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例4
基于实施例1-2，本实施例对测定中的色谱条件(流动相、波长、流速、柱温)进行考察，以本技术方案作进一步的说明。
一、流动相考察
将流动相分别设置为甲醇-0.2％磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.2％磷酸水溶液、甲醇-水四种混合溶剂，其余色谱条件同实施例1，测定。考察香附标准汤剂供试品溶液中色谱峰的分离效果，选择较优的组合溶剂作为香附标准汤剂特征图谱测定的流动相，结果如图5所示。
结果表明：当流动相为甲醇-0.2％磷酸水溶液混合溶剂时，对香附标准汤剂供试品溶液中的色谱峰分离效果较好，因此，选择甲醇-0.2％磷酸水溶液混合溶剂作为香附标准汤剂特征图谱测定的流动相。
二、波长考察
利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并将波长分别设置为280nm、300nm、325nm、360nm，其余色谱条件同实施例1，测定，所得结果如图6-7所示。
结果表明：在检测波长为325nm时，对应的色谱峰信息量较大，色谱图基线平稳，故，确定检测波长为325nm。
三、流速考察
将流速分别设定为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min，其余色谱条件同实施例1，测定，考察供试品溶液中色谱峰的分离效果，所得结果如图8所示。
结果表明：在1.0mL/min的流速下，色谱峰峰型对称，分离度较好，故，选择1.0mL/min作为香附标准汤剂特征图谱的测定流速。
四、柱温考察
将柱温分别设定为28℃、30℃、32℃，其余色谱条件同实施例1，测定，考察供试品溶液中色谱峰的分离效果，所得结果如图9所示。
结果表明：在30℃的柱温下，色谱峰峰型对称，分离度较好，故，选择30℃作为香附标准汤剂特征图谱的测定柱温。
五、延迟性考察
将分析时间延长65min，观察130min后是否有色谱峰，结果如图10。
结果表明：延长65min后基本无色谱峰，最终，确定香附标准汤剂特征图谱方法的分析时间为65min。
综上所述，特征图谱色谱条件确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸为流动相B，按下表3进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；检测波长为325nm；理论板数以芦丁峰计算应不低于1000。
表3梯度洗脱
实施例5
本实施例以香附标准汤剂为供试品，提出一种香附标准汤剂HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
A.内标溶液的制备：取芦丁对照品，加75％甲醇溶解，制成每1mL含330μg的溶液，即得；
B.对照药材参照物溶液的制备：取香附对照药材2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对照药材提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加对照药材提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C.供试品溶液的制备：称取本品粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
D.建立：分别取所得对照药材参照物溶液和所得供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，建立HPLC特征图谱；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：325nm；
理论板数按芦丁峰计算应不低于10000；
流动相按下表4进行梯度洗脱，具体为：
表4梯度洗脱
此外，基于上述香附标准汤的HPLC特征图谱的构建方法，本实施例还进行了如下的方法学考察，具体包括：
一、色谱峰指认
1.内标溶液的制备：取芦丁对照品，加70％甲醇溶解，制成每1mL含330μg的溶液，即得；
2.对照药材参照物溶液的制备：取香附对照药材2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对照药材提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加对照药材提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
3.供试品溶液的制备：称取本品粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
4.阴性对照溶液的制备：取70％甲醇25mL，置具塞锥形瓶中，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
对香附标准汤特征图谱峰进行指认，所得结果如图11-12。
二、精密度考察
取香附标准汤剂供试品(批号XFBT180806)溶液，按前述的香附标准汤剂的特征图谱的构建方法连续进样六次，每次10μL，计算保留时间及峰面积，所得结果如下表5-6。
表5精密度考察—特征峰相对保留时间
表6精密度考察—特征峰相对峰面积
结果表明：各特征峰相对保留时间的RSD在0～0.09％，各特征峰相对峰面积的RSD在2.45～6.68％，说明该仪器精密度良好。
三、重复性考察
取香附标准汤剂供试品(批号XFBT180806)，六份，按前述的香附标准汤剂的特征图谱的构建方法进行供试品溶液制备及测定，所得结果如下表7-8。
表7重复性考察—特征峰相对保留时间
表8重复性考察—特征峰相对峰面积
结果表明：各特征峰相对保留时间的RSD在0.01～0.16％，各特征峰相对峰面积的RSD在1.85～9.69％，说明该方法重复性良好。
四、中间精密度考察
取同一香附标准汤剂供试品(批号：XFBT180806)由不同人员(A、B)在不同时间(Ⅰ、Ⅱ)下制备供试品溶液，并分别在仪器a、b(a：waters e2695型高效液相色谱；b：岛津LC～20AD型高效液相色谱仪；Ⅰ：2018.09.05，Ⅱ：2018.09.09)上进样测定，所得结果如下表9-10及图13。
表9中间精密度-相对保留时间
表10中间精密度-相对峰面积
结果表明：在不同人员和不同时间下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.466～5.397％，各特征峰相对峰面积的RSD在3.117～13.697％，说明本方法适用性较好。
五、耐用性考察
基于前述香附标准汤剂特征图谱的构建方法，分别对色谱柱为Agilent TC-C18(250×4.6mm,5μm)、Agilent SB-C18(250×4.6mm，5μm)、Kromasil(250×4.6mm，5μm)进行考察，测定，所得结果如下表11-12及图14。
表11色谱柱耐用性考察-相对保留时间比值
表12色谱柱耐用性考察-相对峰面积比值
结果表明：用上述三种色谱柱对供试品进行检测，各特征峰相对保留时间的RSD在1.18～6.10％，各特征峰相对峰面积的RSD在7.24～27.90％，说明本方法对不同色谱柱耐用性较好。
六、稳定性考察
基于前述香附标准汤剂特征图谱的构建方法，取同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h时测定，所得结果如下表13-14。
表13稳定性考察-相对保留时间
表14稳定性考察-相对保留峰面积
结果表明：各特征峰相对保留时间的RSD在0.01～0.32％，各特征峰相对峰面积的RSD1.30～16.19％，说明供试品溶液的稳定性良好，在12h内可供检测。
七、香附标准汤剂特征图谱中特征峰的确定及对照图谱的建立
采用前述的香附标准汤剂的特征图谱的构建方法，对二十二批供试品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间和相对峰面积，结果如下表15-16及图15-16所示。
表15二十二批香附标准汤剂相对保留时间
表16二十二批香附标准汤剂相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了九个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰9作为S峰时，二十二批次香附标准汤剂特征峰相对峰面积RSD在19.88～85.59％，差异太大，因此不列入质量标准正文，二十二批次香附标准汤剂九个特征峰相对保留时间RSD在0.01～0.21％，均小于10％。
因此，最终规定：供试品特征图谱中应呈现九个特征峰，并应与对照药材参照物中的九个特征峰保留时间相对应，其中与芦丁参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.212(峰1)、0.425(峰2)、0.463(峰3)、0.513(峰4)、0.607(峰5)、0.825(峰6)、0.873(峰7)、0.914(峰8)。
此外，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对二十二批香附标准汤剂的特征图谱进行合成，建立了香附标准汤剂特征图谱的对照图谱，如图17(其中，峰9(S)：芦丁)。
实施例6
本实施例以香附药材为供试品，提出一种香附药材的HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
A.内标溶液的制备：取芦丁对照品，加70％甲醇溶解，制成每1mL含330μg的溶液，即得；
B.对照药材参照物溶液的制备：取香附对照药材2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对照药材提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加对照药材提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C.香附药材供试品溶液：称取本品粉末2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对应的供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
D.建立：分别取所得对照药材参照物溶液和所得供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，建立HPLC特征图谱；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：325nm；
理论板数按芦丁峰计算应不低于10000；
流动相按下表17进行梯度洗脱，具体为：
表17梯度洗脱
基于上述的香附药材的HPLC特征图谱的构建方法，本实施例还进行了香附药材特征图谱验证，包括：对二十二批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积，验证结果如图18-19所示。
最终规定：供试品特征图谱中应呈现九个特征峰，并应与对照药材参照物中的九个特征峰保留时间相对应，其中与芦丁参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.272(峰1)、0.455(峰2)、0.493(峰3)、0.544(峰4)、0.637(峰5)、0.844(峰6)、0.887(峰7)、0.920(峰8)。
实施例7
本实施例以香附饮片为供试品，提出一种香附饮片的HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
A.内标溶液的制备：取芦丁对照品，加70％甲醇溶解，制成每1mL含330μg的溶液，即得；
B.对照药材参照物溶液的制备：取香附对照药材2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对照药材提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加对照药材提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C.香附饮片供试品溶液：称取本品2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对应的供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
D.建立：分别取所得对照药材参照物溶液和所得供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，建立HPLC特征图谱；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：325nm；
理论板数按芦丁峰计算应不低于10000；
流动相按下表18进行梯度洗脱，具体为：
表18梯度洗脱
基于上述的香附饮片的HPLC特征图谱的构建方法，本实施例还进行了香附饮片特征图谱验证，包括：对二十二批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积，验证结果如图20-21所示。
最终规定：供试品特征图谱中应呈现九个特征峰，并应与对照药材参照物中的九个特征峰保留时间相对应，其中与芦丁参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.240(峰1)、0.412(峰2)、0.448(峰3)、0.495(峰4)、0.587(峰5)、0.860(峰6)、0.907(峰7)、0.932(峰8)。
实施例8
本实施例以香附配方颗粒为供试品，提出一种香附配方颗粒的HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
A.内标溶液的制备：取芦丁对照品，加70％甲醇溶解，制成每1mL含330μg的溶液，即得；
B.对照药材参照物溶液的制备：取香附对照药材2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对照药材提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加对照药材提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C.香附配方颗粒供试品溶液的制备：称取本品0.5g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对应的供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
D.建立：分别取所得对照药材参照物溶液和所得供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，建立HPLC特征图谱；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：325nm；
理论板数按芦丁峰计算应不低于10000；
流动相按下表19进行梯度洗脱，具体为：
表19梯度洗脱
基于上述的香附配方颗粒的HPLC特征图谱的构建方法，本实施例还进行了香附配方颗粒特征图谱验证，包括：对三批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积，验证结果如图22所示。
最终规定：供试品特征图谱中应呈现九个特征峰，并应与对照药材参照物中的九个特征峰保留时间相对应，其中与芦丁参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.210(峰1)、0.420(峰2)、0.456(峰3)、0.511(峰4)、0.606(峰5)、0.821(峰6)、0.871(峰7)、0.913(峰8)。
实施例9
基于实施例5-8，本实施例对香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒对应特征图谱的相关性结果进行讨论，以对本技术方案作进一步的说明。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)分别将二十二批香附药材的特征图谱合成一张药材对照图谱，二十二批香附饮片的特征图谱合成一张饮片对照图谱，二十二批香附标准汤剂的特征图谱合成一张标准汤剂对照图谱，三批香附配方颗粒的特征图谱合成一张配方颗粒对照图谱，将以上香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒对照图谱进行对比，结果见图23(其中，峰9(S)：芦丁)所示。
结果表明：香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中均能检出九个特征峰，其物质基础一致，本技术方案可以准确、高效地检测出香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，实现整体控制香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒质量的目的。
综上，适用于香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒高效液相特征图谱的检测方法，能整体控制香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，确保香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒质量的整体稳定，且方法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高。
Claims (8)
1.一种香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
A．内标溶液的制备：取芦丁对照品，加甲醇溶解，制成每1mL含330μg的溶液，即得；
B．对照药材参照物溶液的制备：取香附对照药材2.0g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25mL，超声处理45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得对照药材提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加对照药材提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C．供试品溶液的制备：称取本品0.5～2.0g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
D．建立：分别取所得对照药材参照物溶液和所得供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，建立HPLC特征图谱；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2%磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：325nm；
理论板数按芦丁峰计算应不低于10000；
流动相按梯度洗脱程序为：
0～12min，流动相A为5→20%，流动相B为95→80%；
12～30min，流动相A为20→30%，流动相B为80→70%；
30～40min，流动相A为30→48%，流动相B为70→52%；
40～50min，流动相A为48→56%，流动相B为52→44%；
50～55min，流动相A为56→75%，流动相B为44→25%；
55～65min，流动相A为75→90%，流动相B为25→10%。
2.根据权利要求1所述的香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述香附药材HPLC特征图谱包括九个特征峰，其中，峰9为芦丁，并以芦丁参照物峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.272、峰2为0.455、峰3为0.493、峰4为0.544、峰5为0.637、峰6为0.844、峰7为0.887及峰8为0.920，相对保留时间在规定值的±10%之内。
3.根据权利要求1所述的香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述香附饮片HPLC特征图谱包括九个特征峰，其中，峰9为芦丁，并以芦丁参照物峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.240、峰2为0.412、峰3为0.448、峰4为0.495、峰5为0.587、峰6为0.860、峰7为0.907及峰8为0.932，相对保留时间在规定值的±10%之内。
4.根据权利要求1所述的香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述香附标准汤剂HPLC特征图谱包括九个特征峰，其中，峰9为芦丁，并以芦丁参照物峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.212、峰2为0.425、峰3为0.463、峰4为0.513、峰5为0.607、峰6为0.825、峰7为0.873及峰8为0.914，相对保留时间在规定值的±10%之内。
5.根据权利要求1所述的香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述香附配方颗粒HPLC特征图谱包括九个特征峰，其中，峰9为芦丁，并以芦丁参照物峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.210、峰2为0.420、峰3为0.456、峰4为0.511、峰5为0.606、峰6为0.821、峰7为0.871及峰8为0.913，相对保留时间在规定值的±10%之内。
6.根据权利要求1所述的香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，在步骤A-C中，所述甲醇的浓度均为70%。
7.一种根据权利要求1-6中任意一项所述香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1．供试品溶液的制备：称取本品0.5～2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理45min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品提取液；另取内标溶液1mL于10mL容量瓶中，加供试品提取液至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S2．检测：取经步骤S1所得供试品溶液注入至高效液相色谱仪，测定，并将所得高效液相色谱图与所得HPLC特征图谱进行比较，检测香附药材、饮片、标准汤剂或/和配方颗粒的质量及真伪；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2%磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：325nm；
理论板数按芦丁峰计算应不低于10000
流动相按梯度洗脱程序为：
0～12min，流动相A为5→20%，流动相B为95→80%；
12～30min，流动相A为20→30%，流动相B为80→70%；
30～40min，流动相A为30→48%，流动相B为70→52%；
40～50min，流动相A为48→56%，流动相B为52→44%；
50～55min，流动相A为56→75%，流动相B为44→25%；
55～65min，流动相A为75→90%，流动相B为25→10%。
8.根据权利要求1所述的香附药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的检测方法，其特征在于，在步骤S1中，所述甲醇的浓度为70%。
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