CN103869003B - 黄柏药材双溶剂融合hplc指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：(1)制备对照品溶液：配制盐酸小檗碱对照品溶液；(2)制备供试品溶液：称取黄柏或关黄柏药材，用具有代表性和互补性的两种溶剂提取，提取液用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；(3)采用高效液相色谱法进行测定得到指纹图谱，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱；紫外检测波长：300nm检测；(4)将两种溶剂提取部位指纹图谱进行融合，建立黄柏药材双溶剂融合指纹图谱。供试品指纹图谱采用国家药典委员会出版的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版进行评价。本发明建立的指纹图谱具有丰富的指纹特征信息，方法简便、重现性好、准确可靠等特点。可有效鉴别关黄柏、黄柏及其混淆品，为黄柏的鉴别和全面质量控制提供依据。

Description

黄柏药材双溶剂融合HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱

技术领域

本发明涉及中药材指纹图谱的构建方法，更具体的说是黄柏药材双溶剂融合指纹图谱的质量控制方法。属于药物分析技术领域。

背景技术

黄柏(PHELLODENDRI CHINENSIS CORTEX)为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮，习称“川黄柏”(国家药典委员会：中国药典，一部.北京，化学工业出版社，2010：153，286)，为常用中药，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功能，临床应用十分广泛。味苦、寒、归肾、膀胱、大肠经。功效清热燥湿、泻火解毒、退虚热。

《中国药典》2005和2010版将两者分开，以“川黄柏”作“黄柏”，“关黄柏”单列。目前市场上销售的主流商品是关黄柏(颜玉贞，余琼希.黄柏HPTLC色谱指纹图谱研究.中兽医学杂志，2008，增刊：304～307)。伪品：木蝴蝶Oroxylum indicum(Linn.)Bentham ex Kurz树皮，黄皮Clausenalansium(Lour.)Skeels树皮(赵静，马骥，庞其昌，等.黄柏饮片光谱成像指纹图谱的研究.中草药，2010，41)。

文献中有关黄柏鉴别及指纹图谱的报道较多，多集中在黄柏药材的鉴别，指纹图谱的研究。采用的方法有高效液相色谱法、高效薄层色谱法、非水毛细管电泳法等分析手段。例如：王瑾采用反相高效液相色谱法，盐酸-70％乙醇(1∶100)回流提取，甲醇-乙睛-0.1mol/L磷酸二氢钠(磷酸调节pH为3.0)-2g/L十二烷基硫酸钠-三乙胺(25∶25∶25∶25∶0.2，v/v)，进样10μL，柱温室温，230nm检测，对收集的22个川黄柏、关黄柏样品进行分析，获得化学数据；用聚类分析和逐步判别分析进行模式识别(王瑾，黄柏的质最评价研究.沈阳：沈阳药科大学硕士学位论文.2004)。

杜雪以1％醋酸一甲醇超声提取，以乙腈和0.3％磷酸三乙胺水溶液为流动相梯度洗脱，柱温25℃，流速0.8ml/min，305nm检测，建立了川黄柏药材HPLC指纹图谱(杜雪，川产道地药材黄柏HPLC指纹图谱质量标准研究.四川：西南交通大学硕士学位论文.2007)。

王龙虎等以乙醇浸泡-超声两步提取，流动相A：50mmol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液(PH 3.5)，流动相B：(50mmol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液，磷酸调pH 3.5)∶乙腈＝3∶7的混合溶液，梯度洗脱，流速1ml/min，280nm检测，对黄柏药材、关黄柏药材、盐川黄柏饮片HPLC指纹图谱初步研究(王龙虎，黄柏药材及中药饮片的HPLC指纹图谱初步研究，中华中医药学会第四届中药炮制学术会议论文集，2004)。

但是文献资料中对黄柏、关黄柏及其混淆品的鉴别的都较分散，且方法较复杂，尚没有一种方法可以直接简单地把黄柏药材的品种区分开来。

发明内容

本发明按照新药研发中药材指纹图谱研究的技术要求，对固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工方法的黄柏药材进行HPLC指纹图谱的研究。

因此，本发明在于提供一种黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的黄柏药材标准指纹图谱。为实现此目的，本发明通过对黄柏药材双溶剂高效液相色谱指纹图谱的研究，提出了一种更好的黄柏药材质量控制方法，弥补了现有质量控制技术的不足，同时可以鉴别川黄柏、关黄柏及其混淆品，使黄柏药材的质量控制更加完善和科学。

因此本发明的第一个目的是提供一种黄柏药材双溶剂HPLC指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备对照品溶液：精密配制盐酸小檗碱对照品溶液；

(2)制备供试品溶液：精密称取黄柏或关黄柏药材粉末，用两种不同溶剂进行提取，提取液用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；

(3)采用高效液相色谱法进行测定得到指纹图谱，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱；紫外检测波长：300nm检测；优选地应用Agilent EZChrom Elite软件将两种溶剂提取部位指纹图谱进行融合，建立黄柏药材双溶剂融合指纹图谱；

(4)评价相似度：供试品指纹图谱采用国家药典委员会出版的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版进行评价。

根据本发明一个优选的实施方式，可选用具有代表性和互补性的两种溶剂进行上述步骤(b)所述的提取，如：甲醇和甲醇-盐酸；乙腈和乙腈-盐酸；甲醇和甲醇-醋酸，优选所述两种不同溶剂为甲醇和甲醇-盐酸。根据本发明一个特别优选的实施方式，所述甲醇-盐酸中甲醇和盐酸的体积比为100∶1，乙腈-盐酸中乙腈和盐酸的体积比为100∶1，甲醇-醋酸中甲醇和醋酸的体积比为100∶1。

以下具体描述以上各步骤。

(1)对照品溶液的制备：

盐酸小檗碱对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品适量，用甲醇配制成每1ml含盐酸小檗碱20～500μg的溶液；

(2)供试品溶液的制备：精密称取黄柏或关黄柏药材粉末0.1～10g，甲醇和甲醇-盐酸(体积比100∶1)提取，超声提取，提取时间为10～80min，提取时间为优选为30min，提取液用微孔滤膜(孔径为0.2μm～0.8μm，优选0.45μm)过滤，即得供试品溶液；

(3)高效液相色谱仪自动进样器进样0.5～20μl，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，梯度洗脱的流动相为甲酸-甲酸铵缓冲液(含20mmol/L甲酸铵，pH3.11±0.02，A)和乙腈(B)梯度洗脱；梯度洗脱时间为20～60min，流速0.3～2.0ml/min；柱温20～45℃；紫外检测波长：200nm～400nm；

(4)相似度评价：供试品指纹图谱在200nm～400nm检测波长下的相似度均大于0.90。

根据本发明一个优选的实施方式，在步骤(3)中，所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如以下浓度配制进行：洗脱程序为：0～13min，13％～15％B；13～22min，15％～35％B；22～27min，35％～42％B；27～27.1min，42％～13％B；27.1～37min，13％B。

根据本发明一个优选的实施方式，本发明所述黄柏药材产自四川，记为HB。

根据本发明一个优选的实施方式，本发明所述关黄柏产自辽宁，记为HB-L。

根据本发明一个特别优选的实施方式，本发明检测方法可以通过下述步骤实施：(1)取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含103μg的溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤即得。(2)供试品溶液的制备：分别以甲醇和甲醇-盐酸(100∶1)作为提取溶剂。取本品粉末0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂15ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，用等体积0.22μm微孔滤膜过滤的超纯水稀释，超声混匀即得。

(3)色谱条件：Welch C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲酸-甲酸铵缓冲液(含20mmol/L甲酸铵，pH3.11±0.02，A)-乙腈(B)梯度洗脱，洗脱程序为：0～13min，13％～15％B；13～22min，15％～35％B；22～27min，35％～42％B；27～27.1min，42％～13％B；27.1～37min，13％B。流速1.0ml/min进样量20μL，柱温30℃，检测波长300nm，检测时间35min。

本发明的第二个目的是提供按照本发明HPLC指纹图谱的建立方法所得到的黄柏药材双溶剂融合的标准指纹图谱，指纹图谱中有8个共有峰，编号依次为1～8。所述8个共有峰中，单峰面积占总峰面积大于5％，而小于10％的共有峰为峰5；单峰面积占总峰面积大于10％的共有峰为峰3、峰7、峰8；其余色谱峰峰面积均小于5％。这些共有特征峰构成了黄柏药材的指纹图谱，可作为黄柏药材的标准指纹图谱。非共有峰面积占总色谱峰积面积比值＜10％。共有峰的峰号(相对保留时间)：1(0.263)，2(0.305)，3(0.515)，4(0.694)，5(0.718)，6(0.793)，7(0.847)，8(1.000)。共有峰的归属为：峰8为盐酸小檗碱。

本发明将药材用不同溶剂提取，得到的不同提取部位在同一指纹图谱条件下分别建立指纹图谱，然后将这些指纹图谱进行融合，达到不同提取部位成分信息互补，增加指纹图谱的信息量，从而提高其指纹鉴定能力，以实现指纹图谱的全面和整体评价。本发明为以黄柏为例，建立其双溶剂融合指纹图谱，该方法可有效鉴别关黄柏、黄柏及其混淆品，为黄柏的鉴别和全面质量控制提供依据。

本发明方法具有如下显著的优点和用途：

(a)将药材用不同溶剂提取，得到的不同提取部位在同一指纹图谱条件下分别建立指纹图谱，然后将这些指纹图谱进行融合，达到不同提取部位成分信息互补，增加指纹图谱的信息量，从而提高其指纹鉴定能力，以实现指纹图谱的全面和整体评价；

(b)供试品制作简便，分析时间较短，色谱条件容易实现；

(c)方法稳定性、简便、稳定、精密度高、重现性好；

(d)有效表征了黄柏药材的质量，适于对黄柏药材真伪、产地和品质的鉴别与控制。

下面通过实施例及其附图详细阐述本发明的技术方案，所例举的实施例及附图对本发明没有限制。

附图说明

图1为黄柏药材HPLC对照图谱及共有色谱峰的标定，其由中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版生成，记为HB-R。

图2为实施例1的10批次黄柏药材双溶剂融合指纹图谱叠加图，图中由上至下分别为HB-10～HB-1。

图3为黄柏混淆品、关黄柏双溶剂融合指纹图谱与HB-R的叠加图，其中由下至上分别为HB-11～HB-15、HB-L和HB-R。

具体实施方式

实施例1：四川产黄柏药材HPLC指纹图谱的检测

1实验材料与仪器

1.1药材：四川产黄柏共10批，分别记为(HB-1～HB-10)。

1.2仪器：DIONEX Ultimate3000高效液相色谱仪(四元梯度泵；柱温箱；DAD检测器；自动进样器；Chromeleon色谱数据系统)；METTLERTOLEDO AL204-S电子天平；METTLER TOLEDO PH计；KQ-250DE型医用数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；LXJ-II B型低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)；

1.3试剂：盐酸小檗碱标准品(中国药品生物制品检定所，批号为：批号110713-200606)，乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

2.高效液相色谱

2.1色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料(Welch C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm))；采用梯度洗脱，流动相为甲酸-甲酸铵缓冲液(含20mmol/L甲酸铵，pH3.11±0.02，A)-乙腈(B)梯度洗脱，洗脱程序为：0～13min，13％～15％B；13～22min，15％～35％B；22～27min，35％～42％B；22～27.1min，42％～13％B；27.1～37min，13％B。流速1.0ml/min进样量20μL，柱温30℃，检测波长300nm，检测时间35min。

2.2对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含103μg的溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤即得。

2.3供试品溶液的制备：

分别以甲醇和甲醇-盐酸(100∶1)作为提取溶剂。取本品粉末0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂15ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，用等体积0.22μm微孔滤膜过滤的超纯水稀释，超声混匀即得。

2.4测定：在相同色谱条件下，对同一样品的不同提取物测定色谱图，将色谱数据导入Agilent EZChrom Elite软件对色谱图进行融合，得到融合指纹图谱见图2所示，并进行相似度评价，结果见表1，确定其特征共有峰：指纹图谱中有8个特征共有峰，其中8号色谱峰为S色谱峰，为盐酸小檗碱，生成的对照图谱见图1。

实施例2：黄柏药材与关黄柏、混淆品的鉴别

1实验材料与仪器

1.1药材：黄柏混淆品共5批，分别记为(HB-11～HB-15)，辽宁产关黄柏记为HB-L。

1.2仪器：DIONEX Ultimate3000高效液相色谱仪(四元梯度泵；柱温箱；DAD检测器；自动进样器；Chromeleon色谱数据系统)；METTLERTOLEDO AL204-S电子天平；METTLER TOLEDO PH计；KQ-250DE型医用数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；LXJ-II B型低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)；

1.3试剂：盐酸小檗碱标准品(中国药品生物制品检定所，批号为：批号110713-200606)，乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

2.高效液相色谱

2.1色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料(Welch C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm))；采用梯度洗脱，流动相为甲酸-甲酸铵缓冲液(含20mmol/L甲酸铵，pH3.11±0.02，A)-乙腈(B)梯度洗脱，洗脱程序为：0～13min，13％～15％B；13～22min，15％～35％B；22～27min，35％～42％B；22～27.1min，42％～13％B；27.1～37min，13％B。流速1.0ml/min进样量20μL，柱温30℃，检测波长300nm，检测时间35min。

2.2对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含103μg的溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤即得。

2.3供试品溶液的制备：

分别以甲醇和甲醇-盐酸(100∶1)作为提取溶剂。取黄柏混淆品及关黄柏粉末各0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂15ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，用等体积0.22μm微孔滤膜过滤的超纯水稀释，超声混匀即得。

2.4测定：

将5批黄柏药材混淆品、关黄柏的双溶剂融合指纹图谱及黄柏对照谱(HB-R)导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》(见图3)，进行相似度评价，计算结果(见表2)。

表2：黄柏混淆品、关黄柏双溶剂融合指纹图谱与与HB-R相似度计算结果

由表2显示，5批混淆品及关黄柏与黄柏对照谱相似度均小于0.86。可见，建立的指纹图谱方法对于黄柏混淆品及关黄柏具有一定的鉴别作用。

Claims (10)

1.黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备对照品溶液：配制盐酸小檗碱对照品溶液；

(2)制备供试品溶液：称取黄柏或关黄柏药材用两种不同溶剂进行提取，提取液用孔径为0.2μm～0.8μm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，所述两种不同溶剂为甲醇和甲醇-盐酸、乙腈和乙腈-盐酸、或甲醇和甲醇-醋酸；

(3)采用高效液相色谱法进行测定得到指纹图谱，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲酸-甲酸铵缓冲液A和乙腈B；梯度洗脱时间为20～60min，流速0.3～2.0ml/min；柱温20～45℃，且所述梯度洗脱的洗脱程序以如下程序进行：乙腈0～13min，13％～15％B，体积比；13～22min，15％～35％B，体积比；22～27min，35％～42％B，体积比；27～27.1min，42％～13％B，体积比；27.1～37min，13％B，体积比；紫外检测波长：300nm检测；在相同色谱条件下，对同一样品的不同提取物测定色谱图，对色谱图进行融合，得到融合指纹图谱；

(4)评价相似度：将分析所得的双溶剂融合指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。

2.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(1)中所述盐酸小檗碱对照品溶液的浓度为20～500μg/mL。

3.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(2)中所述药材的称重量为0.1～10g。

4.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述甲醇-盐酸中甲醇和盐酸的体积比为100∶1，乙腈-盐酸中乙腈和盐酸的体积比为100∶1，甲醇-醋酸中甲醇和醋酸的体积比为100∶1。

5.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(2)中所述提取为采用甲醇和甲醇-盐酸提取；再采用超声提取，提取时间为10～60min。

6.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(2)中所述黄柏药材产自四川，所述关黄柏产自辽宁。

7.如权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述甲酸-甲酸铵缓冲液包含20mmol/L甲酸铵，pH为3.09-3.13。

8.根据权利要求1所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(3)所述测定中，高效液相色谱仪自动进样器进样0.5～20μl。

9.根据权利要求1-8任一项所述的黄柏药材HPLC指纹图谱的建立方法所测得的黄柏药材标准指纹图谱，其特征在于：所述指纹图谱中有8个共有峰，编号依次为1～8；共有峰的峰号(相对保留时间)为：1(0.263)，2(0.305)，3(0.515)，4(0.694)，5(0.718)，6(0.793)，7(0.847)，8(1.000)；共有峰的归属为：峰8为盐酸小檗碱。

10.根据权利要求9所述的黄柏药材标准指纹图谱，其特征在于：所述指纹图谱的8个共有峰中，单峰面积占总峰面积大于5％，而小于10％的共有峰为峰5；单峰面积占总峰面积大于10％的共有峰为峰3、峰7、峰8；其余色谱峰峰面积均小于5％。