CN101419202A - 啤酒花中酮类化合物的高效液相色谱分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种啤酒花中酮类化合物的高效液相色谱分离方法，是采用LU230低压四元高效液相色谱系统的反相色谱法对啤酒花浸膏的甲醇溶液进行分离，分别收集相应馏分；高效液相色谱条件为色谱柱：Hypersil ODS2，5μm，4.6×250mm；流动相：乙腈∶四氢呋喃∶0.1％磷酸水溶液＝60∶5∶35；流速：1.0ml/min；检测波长：314nm；进样量：20μl；色谱柱温：室温；啤酒花浸膏的甲醇溶液浓度是1.8～2.2mg/ml。即得到葎草酮、加葎草酮、合葎草酮、蛇麻酮、加蛇麻酮及合蛇麻酮6种同系化合物的单体溶液。在此基础上经过放大、提纯即可制备这些物质的纯品，作为标准样品以满足进一步质量控制和理论研究的需要。
Description
技术领域：
本发明涉及一种将啤酒花中葎草酮、加葎草酮、合葎草酮、蛇麻酮、加蛇麻酮、合蛇麻酮6种同系化合物单体进行分离的啤酒花中酮类化合物的高效液相色谱分离方法。
背景技术：
葎草酮、加葎草酮、合葎草酮是一组同系物，它们是组成啤酒花中α-酸的主要成分，占α-酸总量的95％以上；蛇麻酮、加蛇麻酮、合蛇麻酮是一组同系物，它们组成啤酒花中β-酸的主要成分，占β-酸总量的95％以上，以上6种同系化合物的分子结构分别如下：
由于它们是组成啤酒花中苦味物质的主要成分，在啤酒酿造和医药领域中具有很高的应用价值，因此分析啤酒花中α-酸和β-酸的含量以及从啤酒花及其制品中提取、精制有效活性组分葎草酮类和蛇麻酮类化合物，成为质量评估与控制及科学研究的关键。
对于啤酒花中α-酸和β-酸的分析方法有分光光度法、电导法、薄层色谱法、离子交换色谱法和高效液相色谱法等。前两种常规分析方法均受α-酸和β-酸氧化产物的影响，不适合于测试衰老或质量差的啤酒花及其制品，不适合于有效活性组分作用机理和动力学研究。随着分析技术的迅速发展，薄层色谱法、离子交换色谱法和高效液相色谱法广泛应用，尤其是高效液相色谱技术的成熟及其商品化使啤酒花或制品中α-酸和β-酸的分析方法得到进一步完善。目前用高效液相色谱分析是采用Nucleosil C18柱，314nm检测，以甲醇+水+磷酸作流动相，0.8mL/min等度洗脱，外标法定量，在30min内，α-酸和β-酸分别被分离成加葎草酮和葎草酮+合葎草酮，加蛇麻酮和蛇麻酮+合蛇麻酮，此法为国际方法[单连菊，林艳，王继文，啤酒科技，2001，5，11-15]。美国酿造化学协会(ASBC)和欧洲酿造协会(EBC)均推荐采用高效液相色谱法分析啤酒花及其制品中的α-酸和β酸；而中国标准GB/T20369-2006《啤酒花制品》中规定采用紫外分光光度法和高效液相色谱法两种方法同时测定。
目前用高效液相色谱法分析α-酸和β-酸还存在以下问题：α-酸被分离成合葎草酮峰以及葎草酮、加葎草酮合峰，β酸被分离成合蛇麻酮峰以及蛇麻酮、加蛇麻酮合峰，作为两对同分异构体的蛇麻酮与加蛇麻酮、葎草酮与加葎草酮均没有得到进一步分离[赵素华，杨锦宗，分析化学，2000，28(4)，520；陆豫，王远兴，吴芬，南昌大学学报(理工版)，2002，26(1)，79-81]，因此只能测定α-酸和β酸各自总的含量。图1所示即按照GB/T20369-2006《啤酒花制品》规定方法分析的色谱图，其中的2+3、5+6分别是同分异构体葎草酮与加葎草酮，蛇麻酮和加蛇麻酮的合峰，没有被分离。
随着人们对啤酒花及其制品中有效活性组分作用机理及其抗菌、抗肿瘤、抗氧化等药理的深入研究，需要从啤酒花及其制品中提取、精制得到6种化合物的标准样品。目前应用超临界CO2萃取技术由啤酒花制备啤酒花浸膏以及初步分离α-酸和β酸的工艺比较成熟[中国专利申请号200710018286，超临界萃取啤酒花的同时初步分离其中的α-酸和β酸的方法及其设备；中国专利申请号200710180014.6，从啤酒花浸膏中分离啤酒花精油、α-酸和β酸的方法]，但是迄今为止还没有关于如何从啤酒花浸膏或α-酸、β酸中精制得到葎草酮、加葎草酮、合葎草酮、蛇麻酮、加蛇麻酮、合蛇麻酮单体的报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种将啤酒花中葎草酮、加葎草酮、合葎草酮、蛇麻酮、加蛇麻酮、合蛇麻酮6种同系化合物单体进行分离的啤酒花中酮类化合物的高效液相色谱分离方法。
本发明的技术解决方案是：一种啤酒花中酮类化合物的高效液相色谱分离方法，其特征是采用LU230低压四元高效液相色谱系统的反相色谱法对啤酒花浸膏的甲醇溶液进行分离，分别收集相应馏分；
高效液相色谱条件为：
色谱柱：Hypersil ODS2，5μm，4.6×250mm；
流动相：乙腈:四氢呋喃:0.1％磷酸水溶液＝60:5:35；
流速：1.0ml/min；
检测波长：314nm；
进样量：20μl；
色谱柱温：室温；
啤酒花浸膏的甲醇溶液浓度是1.8～2.2mg/ml。
所述啤酒花浸膏甲醇溶液的制备是：称取0.75～0.85g啤酒花浸膏于5ml离心管中，29～31℃水浴、震荡、摇匀，用30ml甲醇将样品转移至50ml小烧杯中，然后超声处理30～min，再转移到100ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀；取12ml混合液于50ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀，用0.45μm滤膜过滤。
本发明是用LU230低压四元高效液相色谱系统的反相色谱法，按照一定的色谱条件对啤酒花浸膏甲醇溶液进行分离，收集相应的馏分，即得到葎草酮、加葎草酮、合葎草酮、蛇麻酮、加蛇麻酮及合蛇麻酮6种同系化合物的单体溶液。在此基础上经过放大、提纯即可制备这些物质的纯品，作为标准样品以满足进一步质量控制和理论研究的需要。
附图说明：
图1是按照GB/T 20369-2006《啤酒花制品》规定方法分析的色谱图。
图2是本发明实施例的典型色谱图。
具体实施方式：
仪器及色谱条件：
大连依利特分析仪器有限公司LU230低压四元高效液相色谱仪，配备LU230低压梯度混合器(内含在线脱气机)、P230高压恒流泵、UV230+紫外-可见检测器、7725i手动进样阀、EC2000色谱工作站。
色谱柱为Hypersil ODS25μm，4.6×250mm(I.D.×L)(大连依利特分析仪器有限公司)。
流动相：A(乙腈):B(四氢呋喃):C(0.1％磷酸水溶液):D＝60:5:35；
流速：1.0ml/min；
检测器：UV314nm；
色谱柱温：室温。
啤酒花浸膏由新疆大学提供，甲醇(MeOH，色谱纯)、乙腈(ACN，色谱纯)、四氢呋喃(THF，色谱纯)、85％磷酸(分析纯)购自天津市科密欧化学试剂有限公司，经
超纯水纯化系统过滤的去离子水。
样品溶液的配制与处理：
所述啤酒花浸膏甲醇溶液的制备是：称取0.75～0.85g啤酒花浸膏于5ml离心管中，29～31℃水浴、震荡、摇匀，用30ml甲醇将样品转移至50ml小烧杯中，然后超声处理30～min，再转移到100ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀；取12ml混合液于50ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀，用0.4～0.5μm膜过滤。
最佳的配置方法是：称取0.839g啤酒花浸膏于5ml离心管中，30℃水浴、震荡、摇匀，用30ml甲醇多次将样品转移至50ml小烧杯中，然后置于超声30min，转移到100ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀。取12ml于50ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀，用0.45μm膜过滤，此时样品浓度为2mg/mL，样品应低温避光保存。
将样品按照上述条件进样，经色谱柱分离后，在检测器出口处收集与图2所示谱图1、2、3、4、5、6峰相对应的馏分，经质谱仪检测，1、2和3#峰分别为合葎草酮、葎草酮和加葎草酮，是α-酸的主要成分；4、5和6#峰为合蛇麻酮、蛇麻酮和加蛇麻酮，是β-酸的主要成分。同分异构体葎草酮与加葎草酮的分离度为1.97，蛇麻酮和加蛇麻酮的分离度为1.65，均达到了基线分离(分离度Rs大于1.5)。为葎草酮类和蛇麻酮类化合物分析和标准样品的制备奠定了基础。
Claims (2)
1.一种啤酒花中酮类化合物的高效液相色谱分离方法，其特征是采用LU230低压四元高效液相色谱系统反相色谱法对啤酒花浸膏的甲醇溶液进行分离，分别收集相应馏分；
高效液相色谱条件为：
色谱柱：Hypersil ODS2，5μm，4.6×250mm；
流动相：乙腈:四氢呋喃:0.1％磷酸水溶液＝60:5:35；
流速：1.0ml/min；
检测波长：314nm；
进样量：20μl；
色谱柱温：室温；
啤酒花浸膏的甲醇溶液浓度是1.8～2.2mg/ml。
2.根据权利要求1所述的啤酒花中酮类化合物的高效液相色谱分离方法，其特征在于所述啤酒花浸膏甲醇溶液的制备是：称取0.75～0.85g啤酒花浸膏于5ml离心管中，29～31℃水浴、震荡、摇匀，用30ml甲醇将样品转移至50ml小烧杯中，然后超声处理25～35min，再转移到100ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀；取12ml啤酒浸膏与甲醇的混合液于50ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀，用0.45μm滤膜过滤。
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