CN112285253B - 一种用于检测酒醅中一醇四酸四酯的快速预处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测酒醅中一醇四酸四酯的快速预处理方法，将酒醅在含有机溶剂的离心管中密闭浸泡一段时间；将浸泡完后的体系进行离心，取上清液定容；取一定量定容后的上清液加入适量无水硫酸镁并静置一段时间后过滤；预处理后的酒糟样品通过气/液相色谱仪器能够对其中重要理化指标醇（乙醇）酸（乙酸、丁酸、己酸、乳酸）酯（乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯）同时进行较为准确的检测，该预处理方法不仅提高了分析效率，也解决了当前预处理技术操作过程复杂、周期长以及所制备样品检测精确度不高等问题。

Description

一种用于检测酒醅中一醇四酸四酯的快速预处理方法

技术领域

本发明属于酿酒技术领域，具体涉及一种检测酒糟中重要醇(乙醇)酸(乙酸/丁酸/己酸)酯(乙酸乙酯/丁酸乙酯/己酸乙酯/乳酸乙酯)的快速预处理方法。

背景技术

浓香型白酒作为中国五大香型白酒之一，其市场占有率高达70％之多，是中国白酒的代表之作。近年来随着浓香型白酒企业的迅猛发展，随之而来的也显露出了一定的问题，即基酒中主体香己酸乙酯不够突出，非主体香味物质如乳酸乙酯、乳酸等比例过高，进而影响了后续勾兑调节的难度以及最后成品白酒的质量，这将严重制约酒企可持续性的发展。在浓香型白酒漫长的发酵过程中，若能够及时知道发酵过程不同阶段酒糟中重要醇(乙醇)、酸(乙酸/丁酸/己酸/乳酸)、酯类(乙酸乙酯/丁酸乙酯/己酸乙酯/乳酸乙酯)的变化情况，那么将极有助于提早发现酿造过程中存在的问题，并根据出现的问题及时做出调整，从而更好的知道下一轮次的生产发酵，使成品白酒质量得到提高。

若要想提早了解发酵过程酒糟中重要理化指标的变化，则需对就酒糟样品进行一定的预处理然后再进行检测，而对样品预处理的步骤过程和质量程度，直接制约着检测效率和最终检测结果的准确度，就目前针对浓香型白酒领域的检测主要还是集中于在酒体本身的检测，只有少数文献报道了针对酒糟中酸酯的检测，其预处理主要为二种，一是通过液液萃取的方法，如《酿酒》期刊文章“浓香型白酒高温堆积粮醅中挥发性风味物质的检测分析”中采用了无水乙醇浸泡过夜，然后进行过滤，蒸馏得到馏分，再添加一种额外萃取溶剂二氯甲烷萃取，之后再进行静置过夜，旋蒸浓缩，最后氮吹得到最终可以进行检测的样品。二是通过固相微萃取的方法，如《食品科学》期刊文章“酒糟微量挥发性成分的HS-SPME和GC-MS分析”中采用了固相微萃取的方法对酒醅样品进行微萃取，最终检出多种微量挥发性成分。这两类型的方法虽然都能对酒糟样品进行一定程度的预处理，但它们各自都存在着一定的问题及局限性，如第一类采用乙醇-二氯甲烷液液萃取方法中存在步骤过多，制备周期太长，这可能会更加容易造成挥发性物质的损失，且其采用以乙醇为萃取剂之一必然导致重要醇指标乙醇无法检出，而需要额外的进行酒糟酒精含量的测定，进一步增加了人力物力成本，检测效率将大打折扣。第二类固相微萃取方法，虽然经该法在预处理的操作方面相对较为简单，且在样品预处理之后的检测灵敏度方面也较好，但其由于本身装置的制约，特别是纤维萃取头部分在使用一段时间后必然会导致固定相的流失，导致吸附能力下降，这必然会导致之后检测重复性不理想的问题，另外固相微萃取设备也存在者固定相涂层种类有限、选择性差、平衡时间长等问题，这将会大大影响其在实际应用中的广泛程度。

发明内容

本发明提供一种基于气相色谱仪或液相色谱仪检测酒糟中一醇四酸四酯的快速预处理方法，该预处理方法提高了样品的分析效率，也解决了当前预处理技术操作过程复杂、周期长以及所制备样品检测精确度不高等问题，对酒企及时快速、准确的获知酿造过程的变化，从而及时调整相应的发酵策略，对于保证酒企良性可持续发展具有较大贡献。

本发明的技术方案为：一基于气/液相色谱仪器检测的酒糟中一醇四酸四酯的快速预处理方法，包括以下步骤：

a.将酒醅在含有四氢呋喃溶液的离心管中密闭浸泡一段时间(初步浸提)；

b.将浸泡完后的体系进行离心；

c.取5ml上清液于25ml容量瓶中定容；

d.取一定量定容后的上清液加入适量无水硫酸镁并静置一段时间；

e.对静置完的上清液通过0.22um的有机尼龙滤头过滤(天津市津腾实验设备有限公司)；

f.对滤出液通过气相色谱或液相色谱进行检测。

其中，上述a步骤中所述酒醅和四氢呋喃的重量比例为1：4-6。

其中，上述a步骤中所述浸泡一段时间为15-20分钟。

其中，上述b步骤中离心条件8000-10000rpm 5～10分钟。

其中，上述d步骤中加入无水硫酸镁的量优选所取溶液重量的1/3～1/2。

其中，上述d步骤中静置时间为40～60min。

在对本申请的样品进行预处理之前，首要思考的问题即是对这类型样品应采用怎样的萃取试剂进行萃取，考虑到预处理的样品为酒糟，而评价酒糟发酵质量中最重要的指标物质乙醇、乙酸、丁酸、己酸、乳酸、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯无疑都是有机物，而有机物质中只有低碳酸和醇易溶于水，故在萃取试剂方面宜选取有机试剂进行萃取，在比较了四种萃取剂(四氢呋喃、三氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯)对酒糟样品的萃取指标物质种类数以及萃取效果后，优选四氢呋喃为预处理过程的萃取剂，以其为萃取剂预处理的样品不仅仅萃取效果最好而且萃取目标酸酯种类数最多，分析其原因为所检测样品酒糟会被发酵过程中产生的水所包被而在其外表面形成一层水膜，因此为了达到良好的萃取效果，所选取的萃取有机试剂应具有一定的亲水能力，其亲水能力的强弱对萃取效果会有一定的影响，太弱会导致萃取效果差，太强又会影响水溶性指标物质在预处理完后检测过程中的准确性，另外萃取溶剂本身的极性强弱亦会影响其萃取的效果。

在选择好萃取剂类型之后则需要对萃取时间进行一定的考量，萃取时间太短，萃取效果差，萃取时间过长，小分子挥发性脂肪酸则可能会出现散失，因此设置了三个萃取时间进行实验10min、15min、30min，实验发现15min之后萃取效果变化不大，且部分指标含量还略有减少，因此提高预处理的效率综合考虑，优选15min为萃取剂最佳浸泡时间。

考虑到预处理后的酒糟样品需要进行低级脂肪酸的检测(乙酸乙酯、丁酸乙酯)，为保证预处理过程对样品中易挥发性低级脂肪酸的损耗降低到最小，对于酒醅的预处理步骤不宜过多且应尽可能的简便。因此在固液分离方面比较了三种不同方式(离心、定性滤纸过滤、减压抽滤)的处理效果，再综合考虑处理时间、简易程度以及处理结果后选择以离心作为预处理中固液分离步骤的首选，且应该规避使用减压抽滤操作，以减少低沸点易挥发性香物质的散失，从而提高检测的准确性。另外也考虑到样品中含有一定的水分和盐分，水分会对气相色谱仪器产生一定的损害，而样品中的盐分则会对色谱柱产生一定的影响，损伤色谱柱的同时，也会降低检测结果的精确度，因此增加添加无水硫酸镁除水的步骤。最后在进一步进行过滤时所用到滤膜的选择上优选孔径较小的有机超滤膜，从而尽可能的过滤掉高级脂肪酸等大分子杂质。

附图说明

图1为实施例1中在酒糟样品加入四种不同的萃取溶液静置15min后的萃取溶液颜色变化图。

图2为实施例1中以四氢呋喃溶液为萃取剂预处理完后的滤液经过气相色谱检测乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸、己酸的图。

图3为实施例1中以四氢呋喃溶液为萃取剂预处理完后的滤液经过液相色谱检测乳酸的图。

具体实施方式

实施例1

取12份重量为5g已发酵90天并且混合均匀的窖池酒糟于12支离心管中，每3支离心管样作为1组，共4组，每组分别加入不同的萃取剂四氢呋喃、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷20ml后用保鲜膜密封，静置15分钟(图1为实施例1中在酒糟样品加入四种不同的萃取溶液静置15min后的萃取溶液颜色变化情况图示，从图中可以看出萃取溶液的颜色由深到浅依次为四氢呋喃，乙醇，乙酸乙酯和三氯甲烷，这也间接的说明了四氢呋喃萃取溶液对酒糟样品的浸润效果相较其它萃取溶液更好。)，再将离心管样在10000r/min的条件下离心5分钟，取5ml上清液于离心管中，再分别用对应的萃取剂四氢呋喃、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷定容至25ml，取10ml定容后的液体于事先加有5g无水硫酸镁的离心管中后，保鲜膜密封，静置45分钟后用0.22微米的有机滤膜进行过滤，获得澄清液体，进行气相色谱和液相色谱的检测。

其中气相色谱条件为：色谱柱为FFAP30 m×0.250mm，0.25μm：程序升温条件为起始温度40℃，保持1.5min；以5℃/min升值45℃，保持2分钟；再以15℃/min升至180℃保持1min；进样口温度为250℃；检测器温度为270℃；载气为氮气；流速为30ml/min；分流比为50：1；进样体积为1μl。

液相色谱条件为：色谱柱为HPX-87H300 mm×7.8mm，柱温45℃，流动相：5mM硫酸，硫酸中含有质量浓度为2.4％乙腈，进样量20μL，检测波长210nm，保留时间11.6min，流速0.6ml/min。

检测结果见表1。

表1不同萃取剂提取下酒糟中的九类重要指标香味物质含量情况(单位：mg/g酒糟)

从上表可以看出，四种萃取剂对用于评价糟醅发酵质量情况的最重要的九种醇酸酯类指标的萃取能力各不相同，其中四氢呋喃不仅仅在萃取效果方面最好，而且能将这九种醇酸酯类指标全部萃取出来，以其为萃取剂经过预处理后的酒糟样品滤液在气相和液相色谱检测出的图谱中九中指标出峰表现良好，分析准确度高。

实施例2：

取6份重量为5g已发酵90天并且混合均匀的窖池酒糟于6支离心管中，每3支离心管样作为1组，共2组。每只离心管加入20ml四氢呋喃后，用保鲜膜封闭离心管管盖和管身交接处后置于离心管架上分别静置10分钟、15分钟和30分钟，静置完后将离心管样在每分钟10000转的条件下离心5分钟后取5ml上清液于25ml离心管中分别用与萃取剂一致的溶剂进行定容，取10ml定容后的液体于事先加有5g无水硫酸镁的50ml离心管中后，用保鲜膜封闭离心管管盖和管身交接处，并置于离心管架上静置45分钟左右后用0.22微米的有机滤膜进行过滤，将获得的澄清液体进行气相液相检测，结果见表2。

表2以四氢呋喃为萃取剂不同浸泡时间下酒糟中的九类重要指标香味物质含量情况(单位：mg/g酒糟)

从上表可以看出，在15min的浸泡时间下，酒糟中九种重要指标香味物质全部溶解于四氢呋喃中。另外和浸泡30min对比可知，随着长时间的浸泡，部分香味物质略有散失，如乙酸乙酯、乙酸等。故浸泡时间不宜过长，综合考虑预处理样品效率以及检测的精确度后，优选浸泡15min。

实施例3：

取9份重量为5g已发酵90天并且混合均匀的问题窖池酒糟于9支离心管中，每3支离心管样作为1组，共3组。每只离心管加入20ml四氢呋喃后，用保鲜膜封闭离心管管盖和管身交接处后置于离心管架上静置15min，静置完后将3组离心管样分别在每分钟10000转的条件下离心5分钟、通过定性滤纸过滤以及采取减压抽滤的操作后取5ml上清液于25ml离心管中分别用与萃取剂一致的溶剂进行定容，取10ml定容后的液体于事先加有5g无水硫酸镁的50ml离心管中后，用保鲜膜封闭离心管管盖和管身交接处，并置于离心管架上静置45分钟左右后用0.22微米的有机滤膜进行过滤，将获得的澄清液体进行气相液相检测，结果见表3

表3以四氢呋喃为萃取剂不同固液分离方式下酒糟中的九类重要指标香味物质含量情况(单位：mg/g酒糟)

由上表数据可知，在预处理的固液分离操作上，采取不同的方法，对酒糟样品的萃取效果是存在一定差异的，其中在定性滤纸过滤的过程中暴露空气时间相对较长、滤纸上可能存在一定的物质残留以及减压抽滤由于其操作过程本身的原因导致了易挥发性物质尤其是酯类物质有较大损失，这对于预处理样品检测的精确度是有较大影响的。在综合考虑操作效率以及萃取效果和精确度后选优选以离心操作作为预处理过程中固液分离的步骤。

Claims (2)

1.一种用于检测酒醅中一醇四酸四酯的快速预处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将酒醅在四氢呋喃的离心管中密闭浸泡15min；

（2）将浸泡完后的体系进行离心，取上清液定容，离心条件为10000 rpm下离心5min；

（3）取一定量定容后的上清液加入适量无水硫酸镁并静置一段时间后过滤，所述的过滤采用0.22um的有机尼龙滤头过滤；

（4）对滤出液通过气相色谱和液相色谱进行检测，气相色谱条件为：色谱柱为FFAP30 m×0.250 mm，0.25μm：程序升温条件为起始温度40℃，保持1.5 min；以5℃ /min升值45℃，保持2分钟；再以15℃/min升至180℃保持1min；进样口温度为250℃；检测器温度为270℃；载气为氮气；流速为30 ml/min；分流比为50：1；进样体积为1μL，液相色谱条件为：色谱柱为HPX-87H300 mm×7.8 mm，柱温45℃，流动相：5mM硫酸，硫酸中含有质量浓度为2.4%乙腈，进样量20μL，检测波长210nm，保留时间11.6min，流速0.6mL/min；

步骤（1）中所述的酒醅与四氢呋喃的重量比例为1：4-6；

所述的一醇四酸四酯中，一醇为乙醇；四酸为乙酸、丁酸、己酸和乳酸；四酯为乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯。

2.根据权利要求1所述的用于检测酒醅中一醇四酸四酯的快速预处理方法，其特征在于，步骤（3）中无水硫酸镁的质量为溶液重量的1/3 ~1/2，静置时间为 40~ 60 min。

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