CN102590373A

CN102590373A - 一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法

Info

Publication number: CN102590373A
Application number: CN2012100189349A
Authority: CN
Inventors: 寻思颖; 杨敏; 冯永渝; 彭黔荣; 耿平兰; 张倩; 孙棣; 董睿; 黄卫红; 吴力菊
Original assignee: GUIZHOU PROVINCE PRODUCT QUALITY SUPERVISION AND INSPECTION INSTITUTE; Guizhou University
Current assignee: GUIZHOU PROVINCE PRODUCT QUALITY SUPERVISION AND INSPECTION INSTITUTE; Guizhou University
Priority date: 2012-01-20
Filing date: 2012-01-20
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-01-20
Also published as: CN102590373B

Abstract

本发明公开了一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，建立了分散液液微萃取-FLD-HPLC测定白酒中的挥发性酚方法。当分散剂为四氢呋喃、乙醚、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮或它们的混合物，萃取剂为二氯甲烷或氯仿，当二者混合比例为7∶3、6∶4、5∶5，总体积用量为1.5和2ml时，对5ml稀释酒样进行萃取，测定10种挥发性酚类化合物的加标回收率为81.0％～103.4％，RSD值为0.9％～3.1％，检测限为0.0025～0.0506μg/mL。该方法与传统液液萃取比较，具有样品用量少，有机溶剂用量小，前处理时间短等优点。

Description

一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，属于白酒检测技术领域。

背景技术

饮料酒中通常含有一些酚类物质。它们已经被发现存在于啤酒，葡萄酒还有蒸馏酒中。挥发性酚类化合物是饮料酒的重要香味组分，由于这一类组分对于酒的闻香、口味以及稳定性等方面均具有重要的作用，因此引起了许多研究者的注意。

国内轻工业部食品发酵研究所1978年以茅台酒为主要研究对象，采用化学衍生法结合GC-FID/GC-MS对白酒中挥发性酚元化合物进行的分析研究中，前处理较繁琐，需要衍生化步骤，并且其中4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚的加标回收率只有40％左右。

1990年青岛大学、中国医科院药研所和山东大学陆懋荪、刘春胜、阎长泰用溶剂萃取法提取白酒中的6种挥发酚(青岛大学学报，1990，3(1)，102～105)，使用摸拟酒样500mL，经过加抗氧化剂硫代亚硫酸钠，加2M NaOH溶液调节PH＝12.5，使酚形成酚盐进入水相，蒸馏除去乙醇，用CH₂Cl₂萃取除去碱性和中性成分，再用4M HCl和6％NaHCO₃水溶液调节PH＝8.0，最后用CH₂Cl₂萃取酚，进行GC-FID分析。可见其前处理步骤繁琐，而且只在摸拟酒样进行了实验，6种挥发酚平均回收率为79％，苯酚的回收率为65％，6种挥发酚平均RSD值为6.1％，不能达到检测方法回收率为80～120％，RSD值＜5％的要求，因此没有建立白酒中挥发性酚的分析检测方法。

2010年江南大学生物工程学院朱燕.范来文.徐岩.应用浸入固相微萃取(DI-SPME)与气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术(DI-SPME和GC-MS分析白酒中游离酚类化合物，食品与发酵工业，2010，36(10)：138-143，对白酒中挥发性酚类化合物进行了分析，该方法回收率达到85％～115％。但是采用DI-SPME和GC-MS技术，设备较昂贵，操作要求较高，推广普及应用会受到局限，而且该方法只分析了7种挥发性酚类化合物。

2006年，Assadi小组开发了新颖的液相微萃取技术，称作分散液-液微萃取(DLLME)，该方法是建立在三元溶剂系统基础上的，是微型的液-液萃取，使用萃取剂的量可减少至微升级，该方法的优点是操作简单，快速，成本低，回收率高，富集倍数高，对环境友好，现多应用于水中微量物质的分析检测中。对于分散液-液微萃取应用到中国白酒中挥发性酚类物质测定的方法，未见报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，即建立分散液-液微萃取-高效液相色谱分析白酒中挥发性酚类物质的方法，用于我国白酒中挥发性酚类物质分析。

本发明的技术方案。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

将酒样按酒和水的体积比＝1∶0.5～1稀释后，取稀释酒样5mL装入塑料锥形离心管中，用2mL注射器向酒样中快速注入1-2mL由分散剂和萃取剂组成的混合溶剂，其中分散剂与萃取剂的体积比为7∶3，6∶4，或5∶5，超声5-20min后，以3000-6000r/min离心5min，使有机相沉淀分离，下层有机相作为萃取液转入25mL梨形瓶中，在35℃0.075MPa下旋转蒸发浓缩，到浓缩液的体积为0.7～0.9mL即可，所得浓缩液最后用1％冰醋酸水溶液定容至1～2.0mL，过0.45μm滤膜，供高效液相色谱检测仪分析；

高效液相色谱检测色谱条件：色谱柱：Synergi 4u Hydro-RP 80A，150×4.6mm；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：冰醋酸/β-环糊精水溶液＝1/100；流动相B：冰醋酸/乙腈/β-环糊精水溶液＝1/40/60，β-环糊精水溶液的β-环糊精浓度为：7.05×10^-3-8.81×10^-3mol/L；梯度洗脱流动相设置：按体积计算，0min：含流动相A 80％，流动相B 20％；30min：流动相A 40％，流动相B 60％；40min：流动相A30％，流动相B 70％；柱流速：1.5mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm；

用外标法定量计算出HPLC进样中10种酚的浓度，再换算成酒样中10种酚的浓度。

上述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，所述β-环糊精水溶液的β-环糊精浓度为：7.05×10^-3mol/L。

上述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，所述萃取剂为二氯甲烷或三氯甲烷。

上述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，所述分散剂为四氢呋喃、乙醚、乙醇、正丙醇、异丙醇或丙酮。

上述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，所述分散剂为以下混合溶剂：四氢呋喃和乙醇、四氢呋喃和正丙醇、四氢呋喃和异丙醇、乙醇和正丙醇、乙醇和异丙醇、四氢呋喃和丙酮、丙醇和丙酮、或者异丙醇和丙酮。

上述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，所述分散剂与萃取剂的比例为6∶4或5∶5。

上述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，所述分散剂和萃取剂组成的混合溶剂的量为1.5或2mL。

上述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，所得萃取液加入1％冰醋酸溶液或超纯水作为阻挡层，萃取液和阻挡层的体积比＝1∶0.1-0.25，再旋转蒸发浓缩。

上述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，所述阻挡层为1％冰醋酸溶液，萃取液和阻挡层的体积比＝1∶0.2。

上述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，酒样用乙醇或超纯水调整其酒精度为20～35度。

上述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，白酒中10种挥发性酚类物质为苯酚、愈创木酚、对-甲酚、间-甲酚、邻-甲酚、4-甲基愈创木酚、4-乙烯基苯酚、4-乙基苯酚、4-乙烯基愈创木酚和4-乙基愈创木酚。

上述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，所述白酒为：中国特有的一种蒸馏酒。以曲类、酒母为糖化发酵剂，利用淀粉质原料，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏、陈酿和勾兑而酿制而成的各类酒。

发明人为了采用分散液-液微萃取(DLLME)高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)法对中国白酒中挥发性酚类物质的测定，进行了大量的实验，具体如下：

1实验部分

1.1仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪；Agilent 1100荧光检测器；Mttler AE200电子天平(感量：0.1mg)；MILLIPORE Direct Q5型超纯水系统；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器)，2.5ml医用注射器(江西洪达医疗器械集团有限公司)，25ml锥形旋蒸瓶(江凌玻璃仪器)

乙酸(分析纯，成都金山化学试剂有限公司)，二氯甲烷、三氯甲烷(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，乙腈(色谱纯，MERCK公司)，乙醇(95％，分析纯，广东光华化学厂有限公司)，β-环糊精(生化试剂，天津市科密欧化学试剂有限公司)，愈创木酚，4-乙烯基愈创木酚，4-乙烯基苯酚，4-甲基愈创木酚，4-乙基愈创木酚(Aldrich公司)，4-乙基苯酚(Fluka公司)，邻、对-甲酚(成都市科龙化工试剂厂)，间-甲酚(上海科丰化学试剂有限公司)，苯酚(重庆茂业化学试剂有限公司)，甲醇(成都市科龙化工试剂厂)，四氢呋喃(成都市科龙化工试剂厂)，乙腈(成都市科龙化工试剂厂)，丙酮(成都市科龙化工试剂厂)。白酒(市售白酒)。超纯水(来自MILLIPORE Direct Q5型超纯水系统)。

1.2实验操作

1.2.1前处理方法

将酒样按酒和水的体积比＝1∶0.5～1稀释后，取稀释酒样5mL，用2mL注射器快速注入1-2mL由分散剂和萃取剂组成的混合物，其中分散剂与萃取剂的体积比为7∶3、6∶4或5∶5，超声5-20min后，以3000-6000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，下层有机相作为萃取液转入25mL梨形瓶中，加入1％冰醋酸水溶液作阻挡层，萃取液和阻挡层的体积比＝1∶0.1～0.25，在35℃旋转蒸发浓缩，到浓缩液的体积为0.7～0.9mL即可，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1～2.0mL，过0.45μm滤膜，供高效液相色谱检测仪分析；

1.2.2色谱条件

色谱柱：Synergi 4u Hydro-RP 80A，150×4.6mm；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：冰醋酸/β-环糊精水溶液(1/100)；流动相B：冰醋酸/乙腈/β-环糊精水溶液(1/40/60)，β-环糊精水溶液中β-环糊精浓度为：7.05×10^-3mol/L；梯度洗脱：0min：A80％，B20％；30min：A40％，B60％；40min：A30％，B70％；色谱柱：Synergi 4u Hydro-RP80A 150×4.6mm，phenomenex公司；柱流速：1.5mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

2结果与讨论

2.1挥发性酚类物质的选择

由于白酒中挥发性酚类物质的研究信息较少，我们在查阅了国内外相关文献报道之后，将在饮料酒中检出的挥发性酚全部列入选择范围，以免遗漏，共有14种：苯酚、愈创木酚、对-甲酚、间-甲酚、邻-甲酚、4-甲基愈创木酚、4-乙烯基苯酚、4-乙基苯酚、3-乙基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、2，4-二甲酚、4-乙基愈创木酚、2-乙基苯酚、丁香酚。

我们分别对14种挥发性酚类物质进行荧光激发波长和发射波长扫描，结果见表2.1

表2.114种挥发性酚的最佳检测波长

结果表明，激发波长为270nm，发射波长为315nm时有7种酚处于最佳响应，其余的7种酚也接近其最佳响应，考虑到进行实际样品检测时，保留时间会有所偏移，而14种酚的保留时间又比较接近，不利于设置程序波长检测，因此统一选择在激发波长为270nm，发射波长为315nm为检测波长。

用这14种挥发性酚的标样对大批中国白量酒样进行摸底，发现白酒酒样中，并不存在以下4种挥发性酚：2-乙基苯酚、3-乙基苯酚、2，4-二甲酚和丁香酚。故将白酒中待分析的挥发性酚确定为下列10种：苯酚、愈创木酚、对-甲酚、间-甲酚、邻-甲酚、4-甲基愈创木酚、4-乙烯基苯酚、4-乙基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚。用该10种挥发性酚建立色谱条件进行分析。

2.2检测器的选择

酚类物质在荧光检测器和紫外检测器下都有响应，那么我们待检测的10种酚在那个检测器下灵敏度更高。为此以浓度为1μg/mL的上述10种酚类化合物混合标准溶液，在同样色谱分离条件下，分别用紫外检测器(280nm)和荧光检测器(Ex＝270nm，Em＝315nm)进行测定，发现紫外检测器测定10种挥发性酚的信噪比为8.0～18.6，荧光检测器测定的信噪比为164.0～498.9，两者相比，荧光响应比紫外响应高出15.0～44.9倍，见表2.2。

表2.2荧光检测器和二极管阵列检测器的灵敏度比较

表2.2的结果说明在酚类化合物的测定中，荧光检测器比紫外检测器灵敏度更高。由于白酒中的挥发性酚含量较低，高灵敏度有利于准确定量分析，且考虑到白酒中成分复杂，荧光检测器具有较高的选择性，有利于排除干扰，对目标分析物的准确定性起到关键作用。综合考虑，选择荧光检测器分析目标物。

2.3流动相条件的确定

1.通过对10种挥发性酚的RP-HPLC-FLD流动相选择实验，即实验了以甲醇-水(10∶90，20∶80，30∶70，40∶60，50∶50)，乙醇-水(10∶90，20∶80，30∶70，40∶60，50∶50)，乙腈-水(10∶90，20∶80，30∶70，40∶60，50∶50)，以及三种溶剂分别添加K₂HPO₄或KH₂PO₄、Na₂HPO₄或Na H₂PO₄、NH₄H₂PO₄或(NH₄)₂HPO₄的水溶液体系。确定以乙腈-乙酸-水的混合物进行梯度洗脱，即流动相A：水(1/100)；流动相B：冰醋酸/乙腈/水(1/40/60)，；梯度洗脱：0min：A 80％，B 20％；30min：A40％，B 60％；40min：A30％，B 70％；在这种条件下10种挥发性酚可以分成9个峰，除间甲酚和对甲酚不能分离外，其余的酚分离良好，如图1中的a部分。

图1中的挥发性酚分别为：1：苯酚2：愈创木酚3：对-甲酚4：间-甲酚5：邻-甲酚6：4-甲基愈创木酚7：4-乙烯基苯酚8：4-乙基苯酚9：4-乙烯基愈创木酚10：4-乙基愈创木酚

环糊精(CDs)是一类由数个D-比喃糖单元通过-(1，4)-糖苷键构成的，腔内疏水、腔外亲水的“锥筒形”环状低聚糖。高效液相色谱(HPLC)环糊精固定相法或环糊精(α-，β-，γ-环糊精及其衍生物)流动相添加剂法，在分离苯系物异构体及对映体方面显示了独特的优势^[17-19]。然而，未见应用于我国白酒中酚类物质检测的报道。我们通过大量的β-环糊精与流动相体系的溶解混合实验和流动相的分离实验，即进行了以甲醇-β-环糊精水溶液(10∶90，20∶80，30∶70，40∶60，50∶50)，乙醇-β-环糊精水溶液(10∶90，20∶80，30∶70，40∶60，50∶50)，乙腈-β-环糊精水溶液(10∶90，20∶80，30∶70，40∶60，50∶50)体系的溶解混合实验和流动相的分离实验，确定以乙腈-乙酸-β-环糊精水溶液的混合物进行梯度洗脱的方案。实现了标准混合液和真实酒样的甲酚异构体的拆分，如图1中b部分所示第3和第4号峰。这种分离是基于β-环糊精对于对-甲酚、间-甲酚异构体的选择性包结作用。因为β-环糊精的空腔结构外沿上有亲水的羟基，空腔内部是亲脂的碳氢结构，甲酚结构中甲基苯环由于亲脂性(或称疏水作用)将嵌入β-环糊精的空腔中，而酚羟基将与β-环糊精空腔外沿上的羟基发生氢键作用，形成β-环糊精和甲酚的包结物。由于对-甲酚、间-甲酚的甲基处于不同的位置，其空间结构的差异，导致它们与β-环糊精空腔的契合程度不同，所形成的包结物稳定性不同，从而导致它们在色谱柱中与固定相的作用不同，因此其色谱行为不同，表现出其不同的保留时间，从而可实现甲酚异构体的拆分。

根据甲酚异构体在反相柱上的洗脱顺序，可以推测甲酚异构体进入β-环糊精空腔，形成的主客体复合物稳定性顺序为对-甲酚＞间-甲酚＞邻-甲酚。这一结果与文献报道的β-环糊精与对-甲酚、间-甲酚和邻-甲酚包结物的稳定常数是相符的。我们还实验了流动性水相中添加β-环糊精浓度对对-甲酚和间-甲酚分离度的影响，如表2.3所示，

当β-环糊精浓度为3.53×10^-3mol/L(4g/L)时，3，4号峰(对-甲酚、间-甲酚)开始分离，但不能完全分开，分离度R＝0.91。当β-环糊精浓度为5.29×10^-3mol/L(6g/L)时，3，4号峰进一步分离，分离度R＝1.21。随着β-环糊精浓度的增加，对、间-甲酚分离度逐渐增大，当浓度为7.05×10^-3mol/L(8g/L)时，对-甲酚，间-甲酚分离度为1.52，达到完全分离。当浓度为8.81×10^-3mol/L(10g/L)时，对-甲酚，间-甲酚分离度进一步提高为1.81。

表2.3β-环糊精添加量对间-甲酚、对-甲酚同分异构体拆分的影响

甲酚异构体的分离度随着β-环糊精浓度的增加而增大。这可能是因为β-环糊精浓度的增加有利于增强它与同分异构体之间的相互作用，使得同分异构体之间的色谱行为差异扩大，得到不同的保留时间，从而达到分离的目的。但β-环糊精浓度太高时，由于受溶解度的限制，在流动相中不能完全溶解，使流动相变浑浊，且易堵塞色谱柱，因此经过比较选择7.05～8.81×10^-3mol/L β-环糊精溶液作为最佳流动相添加剂。

因此分离10种挥发性酚的流动相条件为：

流动相A：冰醋酸/β-环糊精的水溶液(1/100)；流动相B：冰醋酸/乙腈/β-环糊精的水溶液(1/40/60)，β-环糊精浓度为：7.05×10^-3mol/L；梯度洗脱：0min：A 80％，B 20％；30min：A40％，B 60％；40min：A30％，B 70％；

2.4工作曲线与检测限

精密称取苯酚、愈创木酚、对-甲酚、间-甲酚、邻-甲酚、4-甲基愈创木酚、4-乙烯基苯酚、4-乙基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚对照品各25mg，用1％冰醋酸溶液定容至25mL(4-乙烯基苯酚、4-乙烯基愈创木酚用甲醇定容)，配成1mg/ml的标准储备液。用1％冰醋酸溶液进行倍比稀释，配成质量体积浓度依次为0.02，0.2，1.0，2.0和4.0μg/mL的酚类化合物混合对照品溶液。以峰面积(Y)对质量浓度(X，μg/mL)进行线性回归，酚类化合物回归方程见表2.4。以信噪比为3确定检测限。

表2.4挥发性酚类化合物的回归方程及检测限

结果表明，该分析方法的相关系数在0.99984到0.99990之间，浓度与峰面积呈良好的线性关系。检出限为0.0025～0.0506μg/mL。

2.5实验Farina L方法提取白酒中挥发性酚类物质

由于目前还没有用分散液液微萃取-高效液相色谱法对白酒中挥发性酚进行分析的相关报道，故参考Farina L用分散液液微萃取-气相色谱-质谱联用分析红葡萄酒挥发性酚中的方法进行摸索。方法相关步骤是：取5ml酒样，用注射器迅速注入总体积为1ml，由0.95ml丙酮和0.05ml CCl₄组成的混合溶剂，轻轻摇动，3000r/min离心5min后，用微量注射器取0.002ml下层有机相直接进气相色谱-质谱进行分析。

按照以上步骤对乙醇含量为50％的模拟酒样进行萃取，离心后不分层，原因是由于CH₃CH₂OH与萃取剂CCl₄互溶，当其含量较高时，两个有机试剂互溶充分，无法通过离心使其沉淀。将模拟酒样的CH₃CH₂OH含量降为20％后，按照以上步骤进行萃取，发现存在以下问题：

(1)离心沉淀后的有机相含量较少，仅为微升级，而回收率的计算与沉淀有机相的体积有着直接联系，在对有机相进行准确测量时操作难度较大。

(2)离心沉淀后有机相含量较少，用微量注射器进行测量为0.03mL左右，无法进行滤膜过滤后再进样的操作，且大多数液相色谱都配备自动进样器，装瓶液体需达到0.5ml左右才能进样分析。目前采用此方法进行分析的多为气相色谱，仅需0.002mL的进样量即可，虽然不能进行滤膜过滤后再进样的操作，但是由于气化温度一般较高，少量杂质可通过高温气化排出，不易残留在色谱柱上，对色谱柱的影响较小，可通过手动进样进行分析。

对于以上问题，拟解决方案是：将最后沉淀的有机相小心吸出，采用定容的方法，使得进样液体积达到1mL以上，过滤膜后装瓶再进样。

2.6萃取剂对萃取回收率的影响

参考Farina的方法中，分散剂和萃取剂混合物的总体积为1mL，由0.95mL分散剂丙酮和0.05mL萃取剂CCl₄组成进行实验，即丙酮∶CCl₄＝19∶1，考察回收率。即取5mL乙醇含量20vol％，加标浓度为0.2μg/mL的模拟酒样，用2mL注射器迅速注入1mL(CCl₄∶丙酮＝1∶19)，振荡5min，3000转/离心5min，小心吸出沉淀有机相，定容、过膜，进入HPLC测定。结果见图2，10种酚的回收率很低，为0.3～5.8％。将萃取剂变为CH₂Cl₂，并调整分散剂丙酮与CH₂Cl₂的比例为8∶2，其它条件不变，10种酚的回收率为16.5～37.1％，有所提高。接着扩大注入溶剂的量到2mL，采取了5mL注射器迅速注入2mL(丙酮∶CH₂Cl₂＝8∶2，7∶3，6∶4)三种比例的溶剂混合物，振荡5min，3000转/离心5min，小心吸出沉淀有机相。为了排除溶剂对色谱峰的影响，有机相装入25mL的梨形烧瓶中，加入0.5mL1％冰醋酸水溶液作阻挡层，35℃0.075MPa下旋蒸4min，用1％冰醋酸水溶液定容过膜，进入HPLC测定。结果发现2mL(丙酮∶CH₂Cl₂＝3∶7)效果较好，回收率为67.0～97.8％

因此以2mL分散剂与萃取剂的比例为7∶3，取5mL乙醇含量为20％的加标模拟酒样(0.2μg/mL)，固定分散剂为丙酮，选取萃取剂为CCl₄CH₂Cl₂以及CHCl₃，通过考察回收率，比较他们对10种挥发性酚的萃取效率。不同萃取剂对10种挥发性酚的萃取回收率见图2。图2中，10种挥发性酚为：

1：苯酚2：愈创木酚3：对-甲酚4：间-甲酚5：邻-甲酚6：4-甲基愈创木酚7：4-乙烯基苯酚8：4-乙基苯酚9：4-乙烯基愈创木酚10：4-乙基愈创木酚

由图2对比可知，参考Farina的方法的回收率很低，采用分散剂与萃取剂的比例为7∶3，提高了10种酚的回收率，其中CH₂Cl₂和CHCl₃对10种挥发性酚的萃取效率明显优于CCl₄。由于CH₂Cl₂的沸点(39.75℃)为低于CHCl₃(61.15℃)。故选择CH₂Cl₂作为萃取剂，在固定萃取剂的条件下，考察不同分散剂对萃取效果的影响。

分散液液微萃取的萃取剂需满足一定的要求：

(1)密度必须大于样品溶液和分散剂；

(2)对目标化合物的富集效果要明显优于分散剂；

(3)不易溶于样品溶液；

(4)易溶于分散剂；

(5)能满足后续色谱分析的需要。

2.7分散剂对萃取回收率的影响

在选定萃取剂为CH₂Cl₂的条件下，采用2.6中2mL(CH₂Cl₂∶丙酮)进行模拟酒样萃取的实验条件，选择甲醇、乙醇、乙腈、正丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和四氢呋喃8种有机溶剂作为分散剂，考察分散剂对萃取效率的影响。分散剂和萃取剂混合物的总体积为2mL，组成为：分散剂∶CH₂Cl₂＝7∶3。不同分散剂对挥发性酚的萃取回收率的影响，见图3，图3中A，B，C，D，E，F，G，H分别表示使用的8种分散剂，它们分别是：四氢呋喃、乙醚、乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、丙酮、乙酸乙酯

10中酚为：1：苯酚2：愈创木酚3：对-甲酚4：间-甲酚5：邻-甲酚6：4-甲基愈创木酚7：4-乙烯基苯酚8：4-乙基苯酚9：4-乙烯基愈创木酚10：4-乙基愈创木酚

由图3对比可知，8种不同分散剂对10种挥发性酚的萃取效率为：四氢呋喃＞乙醚＞丙酮＞乙酸乙酯，正丙醇＞乙腈＞乙醇＞甲醇。8种分散剂的极性为：甲醇＞乙腈＞乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞四氢呋喃。当分散剂极性较大时，10种挥发性酚中极性较大的物质较易停留在分散剂中，萃取剂无法将其充分提取出来，导致萃取效率较低。故选择四氢呋喃作为分散剂。在萃取剂与分散剂选定的条件下，优化萃取条件，使萃取效率达到分析要求。

在分散液液微萃取中，分散剂起着桥梁作用：小体积的分散剂内溶解的萃取剂随着分散剂体积的扩张而释放出来；当扩张的分散剂溶于样品溶液时，萃取剂部分析出。而选用的萃取剂一般不溶于样品溶液，被分散成极小体积的萃取剂便与样品溶液形成胶束状态^[46]。

分散剂需满足：

(1)能完全溶解萃取剂；

(2)必须易溶于样品溶液；

(3)萃取剂在分散剂中的分配系数要大于其在样品液中的分配系数；

(4)必须有较好的色谱行为，不干涉或影响目标物的定性和定量。

2.8萃取剂与分散剂混合比例对萃取回收率的影响

选择萃取剂为二氯甲烷，分散剂为四氢呋喃，找到两者最佳的混合比例，使萃取效率达到分析要求。四氢呋喃与二氯甲烷不同混合比例对挥发性酚的萃取回收率的影响，如图4所示。图4中10种酚分别为：

所选比例分别为：

比例一：四氢呋喃∶二氯甲烷＝9∶1比例二：四氢呋喃∶二氯甲烷＝8∶2

比例三：四氢呋喃∶二氯甲烷∶四氢呋喃＝7∶3比例四：四氢呋喃∶二氯甲烷＝6∶4

比例五：四氢呋喃∶二氯甲烷＝5∶5

由图4中曲线可知，当萃取剂与分散剂为混合比例三、四、五，即(四氢呋喃∶二氯甲烷＝7∶3，6∶4，5∶5)时，10种挥发性酚的萃取效率较好；当混合溶剂中萃取剂含量较少时，萃取剂不能充分的将目标物从样品溶液中提取出来；而当混合溶剂中萃取剂含量高于一定值时，分散剂相应减少，无法将萃取剂较好的分散在样品溶液中，对目标物的萃取效率降低。

2.9萃取剂与分散剂注入体积对萃取回收率的影响

选择萃取剂为二氯甲烷，分散剂为四氢呋喃，当二者混合比例为四氢呋喃∶二氯甲烷∶＝7∶3时，考查注入的混合溶剂体积对萃取回收率的影响，如图5所示。图5中为萃取剂与分散剂混合物的注入体积为0.5、1.0、1.5和2mL体积时，10种酚的萃取回收率。10种酚分别为：

由5图可知，当四氢呋喃∶二氯甲烷∶＝7∶3，注入的混合溶剂体积为小于1.0mL时，10种挥发性酚的回收率偏低，不能达到分析要求；当注入混合溶剂体积为1.5mL和2mL时，各挥发性酚的回收率均大于80％，达到最佳值。

2.10萃取时间对萃取回收率的影响

分散液液微萃取中萃取时间是指，快速注入萃取剂和分散剂的混合溶液后到离心之前的时间间隔。由于该方法是在样品溶液中将萃取剂均匀分散成小液滴，表面积接触较大，在短时间内就能达到平衡，完成萃取，所以通常在萃取剂和分散剂快速注入样品溶液中后就直接离心。

在本实验中，确定了分散剂，萃取剂，及两者的最佳比例之后，尝试了不增加特别萃取时间，即在萃取剂和分散剂快速注入样品溶液中后就直接离心，回收率见表1。

表1萃取后直接离心对挥发性酚的萃取效率(％)

由上表可知，10种挥发性酚的回收率偏低。考虑增加萃取时间5min，采用在萃取时间中静置、震荡、超声等方法，考查回收率，结果如图5所示。图6中分别表示了萃取剂和分散剂快速注入样品溶液中后就直接离心，即静置时间为0，萃取剂和分散剂快速注入样品溶液中后静置5min、震荡5min和超声5min 10种酚的回收率。10种酚分别为：

由图6可知，在5min的萃取时间中，静置的回收率偏低，其中4-甲基愈创木酚的回收率为40％左右；震荡的回收率相对静置提高较多，但是还有愈创木酚、4-甲基愈创木酚、4-乙烯基苯酚的回收率＜80％；超声的回收率较好，10种挥发性酚均能达到80％以上。由于超声对挥发性酚的萃取效率较好，接下来考查不同超声时间对回收率的影响，结果如图7所示。图7中分别表示了萃取剂和分散剂快速注入样品溶液中后，超声5、10、20、30min时，10种酚的回收率。10种酚分别为：

由图7可知，超声5min和超声10min对挥发性酚的萃取效率较相近，回收率均达到80％以上；当超声时间达到20min时，除间-甲酚外，其余各物质的回收率均达到90％以上。当超声时间继续延长时，回收率略有下降。在实际实验过程中，可以根据具体实验情况选择超声时间。

2.11离心转速对萃取回收率的影响

选定混合溶剂总体积为2mL，其中萃取剂为二氯甲烷0.6mL，分散剂为四氢呋喃1.4mL，将混合溶剂快速注入5mL样品溶液中后，超声5min提取，后离心。选择转速3000r/min、4000r/min、5000r/min、6000r/min，考查回收率，见表2。

表2不同转速离心对挥发性酚的萃取效率(％)

由表可知，不同转速下回收率接近，在3000r/min下离心5min就可以使有机相沉淀充分，故选择离心转速为3000r/min。

2.12萃取温度对回收率的影响

当操作温度＜10℃时，在液液萃取过程中，易出现乳化现象，离心之后，分层界面不明显，不利于操作。所以操作应当在20℃左右时进行，或者在进行液液萃取之前，将样品溶液置于20℃水浴锅中恒温待用。

2.13萃取后处理的选择

酒样按酒/水(1∶1)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入1.5mL分散剂和萃取剂形成的混合溶剂，其中分散剂为四氢呋喃，萃取剂为二氯甲烷，四氢呋喃∶二氯甲烷＝7∶3，超声5min后，以3000r/min离心5min，流动相定容1～2mL后过膜进样，由于乙醇的影响，色谱峰出峰时间发生改变，峰型拖尾严重。为了去除沉淀有机相中所含的乙醇，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入1％冰醋酸水溶液和超纯水(萃取液和阻挡层的体积比＝1∶0.1～0.25)，35℃旋蒸浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。1％冰醋酸水溶液可以抑制酚羟基的电离，使峰型对称，有利于准确定量。

2.14分散液液微萃取方法重复性考查

经过以上对萃取剂、分散剂、萃取剂与分散剂混合比例、萃取时间、离心转速、萃取温度、萃取后处理的选择，得出实验方法如下：

酒样按酒/水(1∶1)稀释后，取稀释酒样5ml，用注射器快速注入2ml萃取剂和分散剂的混合溶液(其中萃取剂为二氯甲烷0.6ml，分散剂为四氢呋喃1.4ml)，超声5min后，以3000r/min离心5min，下层有机相转入25ml梨形瓶中，加入0.4mL％冰醋酸水溶液，35℃旋转蒸发浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1～2ml，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。加标考查回收率，重复性见表3。

表3分散液液微萃取重复性

结果表明，用我们建立的分散液液微萃取方法，分析10种挥发性酚回收率的相对标准偏差在0.9％到3.1％之间，表明该方法的重复性良好。

2.15旋蒸过程中阻挡层对回收率的影响

将酒样按酒和水的体积比＝1∶1稀释后，取稀释酒样5mL，用2mL注射器快速注入1-2mL由萃取剂和分散剂组成的混合溶剂，其中萃取剂与分散剂的体积比为3∶7、4∶6、5∶5，4∶6～，超声5-20min后，以3000-6000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，下层有机相作为萃取液转入25mL梨形瓶中，加入1％冰醋酸水溶液作阻挡层，萃取液和阻挡层的体积比＝1∶0.1～0.25，在35℃旋转蒸发浓缩，到浓缩液的体积为0.7～0.9mL即可，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1～1.5mL，过0.45μm滤膜，供高效液相色谱检测仪分析，外标法定量。回收率见表3。

表3旋蒸过程中添加阻挡层与不添加阻挡层测定回收率对比

通过上表对比可以看出，旋蒸之前，在萃取液中不添加阻挡层时，10种挥发性酚的回收率达到90％以上的只有2个酚，还有2个酚(对甲酚)的回收率为69.3％和74.2％达不到检测方法回收率为80％～120％的要求；但是旋蒸之前在萃取液中添加阻挡层后，10种挥发性酚的回收率达到90％以上的增加到8个，其余2个也为87.7％和88.8％，说明旋蒸之前在萃取液中添加阻挡层10种挥发性酚的回收率明显优于不添加阻挡层直接对萃取液进行旋蒸的结果。原因可能是在旋蒸浓缩过程中，萃取液中所含的大量萃取剂二氯甲烷形成蒸气挥发的同时携带部分挥发性酚一起蒸发，导致挥发性酚类物质的损失。旋蒸之前在萃取液中加入阻挡层后，阻挡层覆盖于比重大于1的二氯甲烷为主的有机相之上，使得在旋蒸过程中二氯甲烷和部分被二氯甲烷携带的酚类化合物蒸发时都必须通过阻挡层，由于二氯甲烷不溶解于水相性质的阻挡层，可以通过阻挡层蒸发；而酚类化合物分子中含有羟基，在通过水相性质的阻挡层时会与水分子以及其中的醋酸分子发生相互作用，因此阻挡层可以起到捕集、吸收和保留挥发性酚类化合物的目的，使测定的回收率提高，因此测定的准确性改善，分析结果稳定。

进一步考察不同浓度冰醋酸水溶液、纯水作为阻挡层时的回收率，结果见表4。

表4旋蒸过程中加入不同阻挡层测定的回收率

由表可知，纯水与不同浓度冰醋酸水溶液作为阻挡层所测得的回收率相对一致，为保持样品与流动相相同，选择1％冰醋酸水溶液作为阻挡层。

经过考察不同阻挡层用量对回收率的影响，确定萃取液和阻挡层的体积比＝1∶0.1～0.25，阻挡层的添加量约为0.2～0.5mL为宜。

2.16模拟酒样中标样浓度以及酒样稀释比例的影响和补充筛选实验

当实验的模拟原酒样中标样浓度从0.4μg/mL下降到0.1μg/mL时，用上述优化的THF∶CH₂Cl₂＝7∶3进行实验时，发现10种酚的回收率出现不稳定和下降的情况。分析原因可能是原酒样中酚的含量从0.4μg/mL下降到0.1μg/mL时，实验酒样的浓度(按1∶1稀释)就从0.2μg/mL下降到0.05μg/mL。对0.05μg/mL含量的20％酒精度的模拟酒样或真实稀释酒样进行实验时，由于酚的含量降低，乙醇和酒中其他物质的干扰更大，操作的要求更高，操作误差对回收率的影响更大。因此决定对含酚浓度为0.1μg/mL左右的酒样要降低对酒样的稀释程度。将原酒样(含酚浓度为0.1μg/mL)的稀释比例从1∶1调整到1∶0.5或1∶0.2以增加实验酒样中酚的浓度。当用THF∶CH₂Cl₂＝7∶3共2mL对5mL的稀释模拟酒样进行实验时，发现稀释比例为1∶0.5实验酒样经注入、超声、离心后可以分层，而且有机层在下层。而稀释比例为1∶0.2实验酒样注入、超声、离心后能分层，但有机层在上层，吸取时误差较大。因此以稀释比例为1∶0.5实验酒样进行实验。但对于酒精度从20vol％变化到33vol％的体系(即乙醇含量为50vol％左右的原酒样，按酒样和水＝1∶0.5稀释后其乙醇含量为33vol％)，稀释模拟酒样含酚浓度从0.2μg/mL下降到0.067μg/mL用THF∶CH₂Cl₂＝7∶3共2mL进行萃取时，10种酚的回收率不能达到分析要求(80％～120％)，如表5第一行所示。因此我们对原酒样含酚浓度为0.1μg/mL以1∶0.5稀释后酒精度33vol％浓度的体系，即含酚浓度为0.067μg/mL的稀释模拟酒样，又进行了相关的补充筛选实验，结果如表5所示。首先调整THF∶CH₂Cl₂的比例为8∶2，6∶4，5∶5，发现THF∶CH₂Cl₂的比例为6∶4时，有6种酚的回收率＞80％，但又4种酚的回收率低甚至不能检出。考虑到实际白酒中乙醇含量高，分散剂中使用乙醇也许有利。所以进行了乙醇做分散剂的实验，C₂H₅OH/CH₂Cl₂＝6/4，5/5，6/4，3/7作提取剂时，实验结果表明C₂H₅OH/CH₂Cl₂＝5/5时，虽然回收率还打不到分析要求(80％～120％)，但没有出现有的酚不能提取的问题。因此考虑使用乙醇与THF混合溶剂或极性较低的正丙醇、异丙醇代替乙醇，或用丙酮代替THF混合搭配作为分散剂，同时还考虑萃取剂由CH₂Cl₂变成CHCl₃进行实验。如表5所示，混合分散剂的确可以让所有的酚都能被提取出来，经过80多次的反复实验，发现2mL的下列体系：(无水乙醇+正丙醇)∶CHCl₃＝(2+3)∶5；(无水乙醇+正丙醇)∶CHCl₃＝(1+4)∶5；丙醇∶CHCl₃＝5∶5；丙醇∶CHCl₃＝6∶4；(丙酮+丙醇)∶CHCl₃＝(2+3)∶5；(丙酮+丙醇)∶CHCl₃＝(1+4)∶5；丙酮∶CHCl₃＝5∶5；丙酮∶CHCl₃＝6∶4；(正丙醇+THF)∶CH₂Cl₂＝(4+2)∶4，对原酒样含酚浓度为0.1μg/mL以1∶0.5稀释后酒精度33vol％浓度的体系，进行分散液相微萃取，其10种酚的回收率可以达到80-120％，可满足检测需要。

表5补充实验

表5条件：酒精浓度为50％(体积百分比)的水溶液，使其加标浓度为0.1μg/mL作为模拟原酒样，将模拟原酒样∶纯水＝1∶0.5稀释得到稀释酒样，取5mL稀释酒样进行上述体系筛选实验。用酒精浓度为52％和53％(体积百分比)的真实酒样进行验证实验，使其加标浓度为0.1μg/mL，得到加标酒样，将加标酒样∶纯水＝1∶0.5稀释得到稀释真实加标酒样，取5m L稀释真实加标酒样进行上述验证实验。

上述酒样中的验证实验表明：用2mL溶剂体系{丙酮+丙醇)∶CHCl₃＝(1+4)∶5}对5mL稀释真实加标酒样进行5次分散液相微萃取-HPLC-FLD检测平均回收率为93.36～97.63％，标准相对偏差(DRS％)为1.22～3.61％，可满足中国白酒中10种挥发性酚的检测需要。

1.3结论

本发明建立了分散液液微萃取-HPLC-FLD测定白酒中的挥发性酚方法。当萃取剂为二氯甲烷或氯仿，分散剂为四氢呋喃，乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮以及它们的混合物，当分散剂与萃取剂的比例为7∶3，6∶4，5∶5，总体积用量为1.5～2mL时，对5ml稀释酒样进行萃取，测定10种挥发性酚类化合物的加标回收率为81.0％～103.4％，RSD值为0.9％～3.61％，检测限为0.0025～0.0506μg/mL。该方法与传统液液萃取比较，具有样品用量少，有机溶剂用量小，前处理时间短等优点。经大量实验发现，当酒样中10种挥发性酚的浓度≥0.4μg/mL时，将酒样按照酒样和水＝1∶1(V/V，体积比)稀释后，取5mL稀释酒样，使用1.5或2mL分散剂和萃取剂的混合物，其组成和比例为：四氢呋喃∶二氯甲烷＝7∶3、6∶4、5∶5；或乙醚∶二氯甲烷＝7∶3、6∶4、5∶5作分散剂和萃取剂，进行分散液相微萃取前处理操作，然后进入HPLC-FLD测定。当酒样中酚的浓度为0.1μg/mL左右，即较低含量时，将酒样按照酒样和水＝1∶0.5(V/V，体积比)稀释后，取5mL稀释酒样，使用1.5或2mL分散剂和萃取剂的混合物，其组成和比例为：(无水乙醇+正丙醇)∶CHCl₃＝(2+3)∶5；(无水乙醇+正丙醇)∶CHCl₃＝(1+4)∶5；丙醇∶CHCl₃＝5∶5；丙醇∶CHCl₃＝6∶4；(丙酮+丙醇)∶CHCl₃＝(2+3)∶5；(丙酮+丙醇)∶CHCl₃＝(1+4)∶5；丙酮∶CHCl₃＝5∶5；丙酮∶CHCl₃＝6∶4；(正丙醇+THF)∶CH₂Cl₂＝(4+2)∶4体系进行分散液相微萃取前处理操作，然后进入HPLC-FLD测定。

附图说明

图1为流动性水相中添加β-环糊精前后10种挥发性酚的HPLC-FLD分离色谱图；

图2为萃取剂CCl₄、CH₂Cl₂、CHCl₃对挥发性酚的萃取效率图；

图3为不同分散剂对挥发性酚的萃取效率图；

图4为四氢呋喃与二氯甲烷不同混合比例对挥发性酚的萃取效率图；

图5为注入的混合溶剂体积对萃取效率的影响图；

图6为不同萃取处理方法对挥发性酚的萃取效率图；

图7为超声时间对挥发性酚的萃取效率的影响图。

具体实施方式

本发明的实施例1。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶1)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入1.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂(THF∶CH₂Cl₂＝7∶3，V/V)超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.2mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，当由浓缩瓶中的液体由2相变为1相时停止浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

高效液相色谱检测色谱条件：色谱柱：Synergi 4u Hydro-RP 80A，150×4.6mm；流动相由流动相A相和流动相B相组成，按体积计算，流动相A：冰醋酸/β-环糊精水溶液＝1/100；流动相B：冰醋酸/乙腈/β-环糊精水溶液＝1/40/60，β-环糊精水溶液的β-环糊精浓度为：7.05×10^-3mol/L；梯度洗脱流动相设置：按体积计算，0min开始时：含流动相A80％，流动相B20％；30min时：流动相A40％，流动相B60％；40min时：流动相A30％，流动相B70％；柱流速：1.5mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：20％vol

精密称取苯酚、愈创木酚、对-甲酚、间-甲酚、邻-甲酚、4-甲基愈创木酚、4-乙烯基苯酚、4-乙基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚对照品各25mg，用1％冰醋酸水溶液定容至25mL(4-乙烯基苯酚、4-乙烯基愈创木酚用甲醇定容)，配成1mg/mL的标准储备液。用1％冰醋酸水溶液进行倍比稀释，配成质量浓度依次为0.02，0.2，1.0，2.0和4.0μg/mL的酚类化合物混合对照品溶液。以峰面积(Y)对质量浓度(X，μg/mL)进行线性回归，建立10中挥发性酚类化合物的校正曲线(也称回归方程)，用于外标法定量计算。

用10种酚类化合物标准品混合溶液，建立浓度范围为0.02～4.0μg/mL10种酚类化合物的浓度和高效液相色谱色谱峰峰面积的校正曲线，将HPLC所测进样中的10种酚的峰面积用校正曲线计算出进样中10种酚的浓度，再换算成原酒样中10种酚的浓度。换算公式如下。

本发明的实施例2。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶1)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入1.5mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂(THF∶CH₂Cl₂＝7∶3，V/V)超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.2mL，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1.3mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

高效液相色谱检测色谱条件：色谱柱：Synergi 4u Hydro-RP 80A，150×4.6mm；流动相由流动相A相和流动相B相组成，流动相A：冰醋酸/β-环糊精水溶液＝1/100；流动相B：冰醋酸/乙腈/β-环糊精水溶液＝1/40/60，β-环糊精水溶液的β-环糊精浓度为：7.05×10^-3mol/L；梯度洗脱流动相设置：按体积计算，0min开始时：含流动相A80％，流动相B20％；30min时：流动相A40％，流动相B60％；40min时：流动相A30％，流动相B70％；柱流速：1.5mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：20％vol

用10种酚类化合物标准品混合溶液，建立浓度范围为0.02～4.0μg/mL10种酚类化合物的浓度和高效液相色谱色谱峰峰面积的校正曲线，将HPLC所测进样中的10种酚的峰面积用校正曲线计算出进样中10种酚的浓度，再换算成原酒样中10种酚的浓度。换算公式如实施例1中所示。

本发明的实施例3。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶1)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂(THF∶CH₂Cl₂＝7∶3，V/V)超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.2mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1.5mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

高效液相色谱检测色谱条件：色谱柱：Synergi 4u Hydro-RP 80A，150×4.6mm；流动相由流动相A相和流动相B相组成，流动相A：冰醋酸/β-环糊精水溶液＝1/100；流动相B：冰醋酸/乙腈/β-环糊精水溶液＝1/40/60，β-环糊精水溶液的β-环糊精浓度为：7.05×10^-3mol/L mol/L；梯度洗脱流动相设置：按体积计算，0min开始时：含流动相A80％，流动相B20％；30min时：流动相A40％，流动相B60％；40min时：流动相A30％，流动相B70％；柱流速：1.5mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：20％vol

用10种酚类化合物标准品混合溶液，建立浓度范围为0.02～4.0μg/mL10种酚类化合物的浓度和高效液相色谱色谱峰峰面积的校正曲线，将HPLC所测进样中的10种酚的峰面积用校正曲线计算出进样中10种酚的浓度，再换算成原酒样中10种酚的浓度。

本发明的实施例4。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶1)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂(THF∶CH₂Cl₂＝6∶4，V/V)超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.2mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1.5mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：20％vol

本发明的实施例5。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶0.5)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂[(无水乙醇+正丙醇)∶CHCl₃＝(2+3)∶5，V/V]超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.2mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1.5mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：30～35％vol

本发明的实施例6。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶0.5)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂[(无水乙醇+正丙醇)∶CHCl₃＝(1+4)∶5，V/V]超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.2mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1.5mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：30～35％vol

本发明的实施例7。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶0.5)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂[(无水乙醇+异丙醇)∶CHCl₃＝(2+3)∶5，V/V]超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.2mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，当由浓缩瓶中的液体由2相变为1相时停止浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1.5mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：30～35％vol

本发明的实施例8。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶0.5)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂[(无水乙醇+异丙醇)∶CHCl₃＝(1+4)∶5，V/V]超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.2mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1.5mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：30～35％vol

本发明的实施例9。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶0.5)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂[(丙酮+THF)∶CHCl₃＝(3+3)∶4，V/V]超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.2mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1.5mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：30～35％vol

本发明的实施例10。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶0.5)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂[(丙酮+正丙醇)∶CHCl₃＝(2+3)∶5，V/V]超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.3mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1.5mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：30～35％vol

用10种酚类化合物对标准品混合溶液，建立浓度范围为0.02～4.0μg/mL10种酚类化合物的浓度和高效液相色谱色谱峰峰面积的校正曲线，将HPLC所测进样中的10种酚的峰面

积用校正曲线计算出进样中10种酚的浓度，再换算成原酒样中10种酚的浓度。

本发明的实施例11。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶0.5)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂[(丙酮+正丙醇)∶CHCl₃＝(1+4)∶5，V/V]，竖向轻摇两次后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.4mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩2.5分钟，当浓缩瓶中的液体体积为1.5mL时停止浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1.8mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：30～35％vol

本发明的实施例12。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶0.5)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂[(丙酮+正丙醇)∶CHCl₃＝(1+4)∶5，V/V]，超声5min后，以6000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.4mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，当浓缩瓶中的液体由2相变为1相时停止浓缩，移出浓缩液，用1％冰醋酸水溶液洗浓缩瓶3次，合并洗液和浓缩液，最后用1％冰醋酸水溶液定容，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：30～35％vol

本发明的实施例13。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶0.5)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂(正丙醇∶CHCl₃＝5∶5，V/V)，超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.3mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩3min，移出浓缩液，用1％冰醋酸水溶液洗浓缩瓶3次，合并洗液和浓缩液，最后用1％冰醋酸水溶液定容，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：30～35％vol

本发明的实施例14。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶0.5)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂(正丙醇∶CHCl₃＝6∶4，V/V)，超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.4mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1.5mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：30～35％vol

本发明的实施例15。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶0.5)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂(丙酮∶CHCl₃＝5∶5，V/V)，超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.4mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，当浓缩瓶中的液体由2相变为1相时停止浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1.5mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：30～35％vol

本发明的实施例16。一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，包括下述步骤，

酒样按酒/水(1∶0.5)稀释后，取稀释酒样5mL，用注射器快速注入2.0mL分散剂和萃取剂组成的混合溶剂[(正丙醇+THF)∶CH₂Cl₂＝(4+2)∶4，V/V)]，超声20min后，以3000r/min离心5min，使有机相沉淀与酒相分离，将下层有机相小心转入25mL梨形瓶中，加入0.3mL1％冰醋酸水溶液，35℃0.075MPa下旋蒸浓缩，最后用1％冰醋酸水溶液定容至1.5mL，过0.45μm滤膜，供HPLC分析。

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm。

酒样的酒精度调整为：30～35％vol

Claims

1.一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，其特征在于：包括下述步骤，

荧光检测器条件：Ex＝270nm，Em＝315nm；

2.根据权利要求1所述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，其特征在于：所述β-环糊精水溶液的β-环糊精浓度为：7.05×10^-3mol/L。

3.根据权利要求1所述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，其特征在于：所述萃取剂为二氯甲烷或三氯甲烷。

4.根据权利要求1所述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，其特征在于：所述分散剂为四氢呋喃、乙醚、乙醇、正丙醇、异丙醇或丙酮。

5.根据权利要求4所述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，其特征在于：所述分散剂为以下混合溶剂：四氢呋喃和乙醇、四氢呋喃和正丙醇、四氢呋喃和异丙醇、乙醇和正丙醇、乙醇和异丙醇、四氢呋喃和丙酮、丙醇和丙酮、或者异丙醇和丙酮。

6.根据权利要求1所述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，其特征在于：所述分散剂与萃取剂的比例为6∶4或5∶5。

7.根据权利要求1所述的一种同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，其特征在于：所述分散剂和萃取剂组成的混合溶剂的量为1.5或2mL。

8.根据权利要求1所述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，其特征在于：所得萃取液加入1％冰醋酸溶液或超纯水作为阻挡层，萃取液和阻挡层的体积比＝1∶0.1-0.25，再旋转蒸发浓缩。

9.根据权利要求8所述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，其特征在于：所述阻挡层为1％冰醋酸溶液，萃取液和阻挡层的体积比＝1∶0.2。

10.根据权利要求1所述的同时测定白酒中10种挥发性酚类化合物的方法，其特征在于：酒样用乙醇或超纯水调整其酒精度为20～35度。